阅读说明：本技术 乳酸乳球菌kdll2016-01在发酵羽毛制备蛋白饲料中的应用 (Application of lactococcus lactis KDLL2016-01 in preparation of protein feed by fermenting feathers ) 是由 徐良梅 陈志辉 刘洋 李岚雪 郭建新 于 2018-11-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了本发明涉及乳酸乳球菌KDLL2016-01在发酵羽毛制备蛋白饲料中的应用,属于动物营养与饲料技术领域。该应用是将羽毛粉碎成羽毛粉,灭菌后加入发酵培养基中；将乳酸乳球菌KDLL2016-01接种至发酵培养基中进行发酵培养；发酵完成后将发酵产物进行干燥,获得蛋白饲料。该应用所采用的乳酸乳球菌KDLL2016-01在培养过程中不产生有害代谢产物,产物可以直接饲喂畜禽,无需对发酵产品进行脱毒等处理,而且发酵过程中产生的乳球菌肽也可以对饲料中可能存在的致病菌也有杀伤作用,使饲料品质更加安全。本发明方法制备的蛋白饲料适用于饲喂畜禽。(The invention discloses application of lactococcus lactis KDLL2016-01 in preparation of protein feed by fermenting feathers, and belongs to the technical field of animal nutrition and feed. The application comprises pulverizing feather into feather powder, sterilizing, and adding into fermentation culture medium; inoculating lactococcus lactis KDLL2016-01 into a fermentation culture medium for fermentation culture; and drying the fermentation product after the fermentation is finished to obtain the protein feed. The lactococcus lactis KDLL2016-01 adopted in the application does not produce harmful metabolites in the culture process, products can be directly fed to livestock and poultry, detoxification and other treatment of fermented products are not needed, lactococcus peptides produced in the fermentation process can also have a killing effect on pathogenic bacteria possibly existing in the feed, and the feed quality is safer. The protein feed prepared by the method is suitable for feeding livestock and poultry.)

乳酸乳球菌KDLL2016-01在发酵羽毛制备蛋白饲料中的应用

技术领域

本发明涉及乳酸乳球菌KDLL2016-01在发酵羽毛制备蛋白饲料中的应用，属于动物营养与饲料技术领域。

背景技术

目前，蛋白质饲料的缺乏是世界性的问题，没有优质的、充足的蛋白质饲料，就没有优质的、充足的肉类产品，这种情况在很大程度上限制了畜禽养殖业的快速健康发展。我国羽毛资源非常丰富，但是在很长时间内没有得到很好利用，这主要跟羽毛结构性质有关。羽毛结构非常稳固，导致其性质稳定，不溶于水、稀酸和稀碱，加工处理之前，蛋白酶不能水解羽毛，因此动物不能消化羽毛，更无法利用其中的蛋白质，羽毛中的粗蛋白含量较高，主要是难以被畜禽消化的角蛋白。因此破坏羽毛稳定的结构，提高其水溶性，提高羽毛的消化率，使其变得易于消化和吸收显得至关重要。目前常用于水解羽毛的方法如下：

高温高压水解法目前应用最广泛的一种处理方法，其成品颜色会随着原料的变化而发生变化，当原料的颜色多为白色时，成品通常呈深黄色，当原料的颜色多为黑色时，成品通常呈深褐色，一般情况下，高压水解羽毛粉成品呈浅褐色。高温高压水解法控制温度和压力比较困难，造成生产出的产品的质量不是很稳定，过高的温度会引起蛋白质变性，使羽毛粉的消化率下降。

化学水解法利用加热条件下，羽毛对酸、碱的敏感性大大提高这一特性发明的一种处理方法。但是化学水解法同样也有很多缺陷，化学水解法的生产工艺比较复杂，生产出的水解羽毛粉中含有较多的盐分，这会影响水解羽毛粉的适口性，较多的盐分也会容易吸潮，导致水解羽毛粉变质。化学水解法在生产过程中会产生大量的污水，会对环境造成严重的污染。

膨化法的原理是，羽毛粉在经过膨化通道时会受到很大的剪切作用，并且羽毛在冲出膨化出口的瞬间，外部的压力迅速消失，而羽毛粉的内部仍保持着高压状态，内外的压力差会使羽毛迅速发生膨胀。膨化时羽毛牢固的空间结构会被破坏掉，角蛋白的结构变得松散，疏水性有所下降，亲水性得到提高，蛋白酶更容易对羽毛进行水解，动物更容易消化羽毛，并从中吸收所需的营养。

微生物降解法是指自然界中的某些微生物在生长过程中可以产生能够水解角蛋白的酶将角蛋白降解成小肽或氨基酸。微生物降解法与其他处理方法相比，具有很大的优势，主要表现在微生物降解法的成本低，工艺简单，产生的废水废气较少。具有角蛋白降解能力的微生物主要有细菌、真菌和放线菌。但传统的微生物其次级代谢产物可能含有对畜禽有害的物质，因此通常需要脱毒处理。

传统的酸碱处理和膨化法，一方面会造成环境污染，另一方面会造成羽毛角蛋白营养成分也会产生损伤。

另外羽毛作为蛋白饲料，其胱氨酸含量过高，造成其蛋白品质较生产常用的鱼粉差，配制饲料时易造成氨基酸不平衡。

目前国内有关益生菌降解羽毛角蛋白的文章比较少见，而乳球菌降解羽毛角蛋白的研究还未见报道其发酵产物饲喂畜禽的方法和饲喂效果也未见报道。

发明内容

本发明针对化学水解法和膨化法加工羽毛作为蛋白饲料时对营养成分破坏较大，且对周边环境污染也较大的问题，以及微生物发酵羽毛可能会存在次级代谢产物会对畜禽产生毒性等问题，采用益生菌之一的乳球菌对羽毛进行发酵生产羽毛蛋白饲料。该方法对周边环境污染小，发酵后羽毛粉的氨基酸更加平衡，营养价值获得一定的提高，而且没有对畜禽有害的次级代谢产物，可以直接用来饲喂畜禽。本发明提供了乳酸乳球菌KDLL2016-01在发酵羽毛制备蛋白饲料中的应用，本发明首次发现了一株可以降解羽毛角蛋白的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)KDLL2016-01及其新应用，该菌株能够用于发酵降解羽毛制备发酵蛋白饲料，发酵获得的蛋白饲料产品其氨基酸更加平衡，胱氨酸的含量有所降低高，并且富含对畜禽生长有益的益生菌，具体方案如下：

本发明提供了一种乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)KDLL2016-01在发酵羽毛制备蛋白饲料中的应用，即一种利用乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)KDLL2016-01发酵羽毛制备蛋白饲料的方法，所述乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)KDLL2016-01的保藏编号为CGMCC No.15450。

优选地，所述的应用包括如下步骤：

步骤一：将羽毛粉碎成羽毛粉，灭菌后加入发酵培养基中；

步骤二：将乳酸乳球菌KDLL2016-01接种至发酵培养基中进行发酵培养；

步骤三：发酵完成后将发酵产物进行干燥，获得蛋白饲料。

优选地，步骤一所述将羽毛粉碎成羽毛粉按照如下方法进行：将羽毛清洗后与水、琼脂混合并搅拌均匀，烘干后粉碎，置于400目的尼龙袋上，流动水清洗去除琼脂后烘干，过60目筛；其中：所述羽毛重量与水的重量之比为10:1；所述琼脂的重量与羽毛的重量之比为1:200。

优选地，步骤一所述羽毛粉的添加量为：羽毛粉重量与发酵培养基重量之比为1:4。

优选地，步骤二在接种前将乳酸乳球菌KDLL2016-01进行复苏培养后接种至液体种子培养基中在温度为30℃、pH值为6.0和转速为200rpm的条件下进行种子培养48h，得乳酸乳球菌KDLL2016-01的种子培养液，将所得乳酸乳球菌KDLL2016-01的种子培养液接种至发酵培养基中。

更优选地，所述液体种子培养基的配方为：牛肉膏8.0g，蛋白胨10.0g，酵母膏4.0g，葡萄糖20.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，磷酸氢二钾2.0g，乙酸钠5.0g，硫酸镁0.2g，吐温801.0g，硫酸锰0.05g，去离子水1000mL。

优选地，步骤二所述接种的接种量为5.7％(v/v)。

优选地，步骤二所述发酵培养基配方为：牛肉膏10g，酵母膏10g，蔗糖100g，氯化钠2g，磷酸氢二钾10g，硫酸镁0.5g，pH值为6.0。

优选地，步骤二所述发酵培养的条件为：有氧，初始pH值6.3，发酵温度32℃，转速220rpm，发酵时间为36h。

优选地，步骤三所述将发酵产物进行干燥是将发酵产物进行过滤得发酵液和固体，将所得发酵液进行喷雾干燥，并将所得固体烘干，然后将烘干后的固体粉末与喷雾干燥后的固体粉末合并，获得蛋白饲料。

本发明还提供了以上任一所述应用制得的蛋白饲料。

本发明的乳酸菌，是以羽毛粉为单一氮源源，从鸡场堆积的废弃羽毛中分离、筛选到的一株可降解角蛋白的益生菌，该菌株已经于2018年3月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15450。

发明有益效果：

1.本发明首次发现了一株可以降解羽毛角蛋白的乳酸乳球菌KDLL2016-01，其保藏编号为CGMCC No.15450，该菌株为益生菌，在培养过程中不产生有害代谢产物，产物可以直接饲喂畜禽，无需对发酵产品进行脱毒等处理，而且发酵过程中产生的乳球菌肽也可以对饲料中可能存在的致病菌也有杀伤作用，使饲料品质更加安全。

2.羽毛粉中的蛋白含量虽可达80％以上，但基本是结构紧密不易被消化的角蛋白。而本发明方法对羽毛进行发酵后，其中所含的致密角蛋白结构被乳球菌及其代谢产物分解或破坏，畜禽对羽毛蛋白饲料的消化率更高，羽毛发酵后产物的pH适度降低，适口性更好，能提高畜禽采食量。

3.羽毛作为蛋白饲料，其胱氨酸含量过高，造成其蛋白品质较生产常用的鱼粉差，配制饲料时易造成氨基酸不平衡。而按照本发明方法获得的发酵后羽毛粉胱氨酸含量有一定幅度的降低，氨基酸比例更加平衡。

3、本发明利用KDLL2016-01发酵羽毛对于羽毛降解率可高达35％。

4、本发明获得的合并发酵产物作为蛋白饲料代替鱼粉配制饲料饲喂蛋鸡。

5、本发明采用羽毛用作动物源蛋白饲料，成本低廉，且羽毛获取容易。

附图说明

图1为乳球菌菌株复筛降解圈。

图2为16S rDNA系统发育树。

图3为羽毛粉(左)和发酵羽毛粉(右)表观形态。

图4为普通电子显微镜下的羽毛粉(左)和发酵羽毛粉(右)。

图5扫描电镜下的羽毛粉(左)和发酵羽毛粉(右)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

以下实施例中的“发酵羽毛粉”即为“蛋白饲料”。

实施例一：羽毛粉降解菌的分离、筛选和鉴定

1.实验方法

(1)样品的收集：①菌株分离样品采自2016年东北农业大学动物饲养基地所饲养肉鸡的粪便；②取5g鸡粪便样品于装有50mL无菌生理盐水的250mL锥形瓶中，搅拌混匀，制成悬浮液，取1mL悬菌液接入含富集培养基100mL的250mL锥形瓶中，30℃，220r/min富集培养48h制成富集培养液。

(2)初筛：将富集培养液按梯度稀释后各取0.1mL涂布于羽毛粉固体培养基平板，30℃恒温培养箱中倒置培养若干天并进行观察，待长出菌落后，挑选生长良好、较大单个的菌落，重新划线于LB平板，于30℃恒温培养3d，经多次划线，分离纯化出单菌落。

(3)复筛：将初蹄得到的菌株各取一环分别接种于种子培养基中，30℃，220r/min培养24h。将种子液各取1mL分别接种于装有100mL初始液体发酵培养基的250mL三角瓶中，每个菌株三个平行，培养24h。期间密切观察羽毛的降解情况。根据各菌株对羽毛的降解情况进行复筛。发酵液在4℃，8000r/min离心机中离心15min，取上清液，测定吸光度值和可溶性蛋白含量。

(4)可溶性蛋白含量测定：采用考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白含量。

(5)菌种的保存：本试验分离纯化得到的单一菌株采用甘油冷冻保存法进行长期保存，菌株接种于种子培养基中，30℃，220r/min摇床培养24h，将菌悬液与已灭菌的30％甘油-去离子水溶液1:1混合均匀，于-20℃低温保存，有效期1年。

(6)菌种的鉴定：将菌株涂布于LB固体培养基平板和羽毛粉培养基平板，30℃倒置培养，48h左右，观察单菌落形态呈白色微凸起状，表面光滑湿润，边缘比较整齐，并进行16SrDNA分子鉴定及系统发育分析。

种子培养基(MRS液体培养基)组成为：牛肉膏8.0g，蛋白胨10.0g，酵母膏4.0g，葡萄糖20.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，磷酸氢二钾2.0g，乙酸钠5.0g，硫酸镁0.2g，吐温80 1.0g，硫酸锰0.05g，去离子水1000mL，121℃灭菌20min。

2实验结果及结论

复筛菌株上清液吸光度及可溶性蛋白含量如表1所示。

表1复筛菌株上清液吸光度及可溶性蛋白含量

注：同列数据肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)。下表同。

根据复筛结果选取一株菌，分别接种到表层涂有羽毛悬浊液的营养琼脂培养基上，48h后观察其“降解圈”产生情况。结果如图1所示，该菌落呈乳白色降解圈明显。

菌株通过PCR扩增所产生的DNA片段均为单一条带，将PCR产物进行测序，获得全长为1379bp的基因序列这与电泳图的结果一致。将两端序列在NCBI中进行Blast比对，发现该的16S rDNA与多数乳酸乳球菌Lactococcus lactis达到95％以上，利用MEGA 5.1聚类分析构建系统发育树，如图2所示。从系统发育树上可进一步鉴定菌株为乳酸乳球菌。命名为乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)KDLL2016-01，该乳酸乳球菌为益生菌。

实施例二：乳球菌发酵降解羽毛粉条件的优化

1实验方法

1.1培养基

(1)发酵培养基：牛肉膏10g，酵母膏10g，蔗糖100g，氯化钠2g，磷酸氢二钾10g，硫酸镁0.5g，pH值为6.0，121℃灭菌20min。

(2)MRS液体培养基(种子培养基)：牛肉膏8.0g，蛋白胨10.0g，酵母膏4.0g，葡萄糖20.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，磷酸氢二钾2.0g，乙酸钠5.0g，硫酸镁0.2g，吐温80 1.0g，硫酸锰0.05g，去离子水1000mL，pH值为5.7，121℃灭菌20min。

1.2发酵条件的优化

利用单因素试验研究影响乳球菌发酵羽毛的因素：有无氧、时间、转速、温度、接种量和pH值对羽毛降解率的影响，逐个探索出较优水平。

(1)将400目的尼龙袋(6cm×5cm)，用铅笔做好标记后在105℃下烘干至恒重，称量每个尼龙袋重量，记为M1；

(2)将羽毛清洗后烘干，粉碎后，过40目筛，获得羽毛粉；称取5g羽毛粉，置于的尼龙袋中，封口后105℃烘干至恒重，称量重量，记为M2；

(3)配制MRS液体培养基，在厌氧、30℃、pH值为6.0、转速为180rpm的条件下对乳球菌培养24h；

(4)配制发酵培养基，在250mL三角瓶中加入发酵培养基50mL，将灭菌后的装有羽毛的尼龙袋置于培养基中，分别在有氧和厌氧条件下，接种量4％(体积比)、30℃、pH值6.0、转速200rpm、发酵时间30h为基础条件，设置不同梯度，保持其它因素不变，设置5个重复，对有无氧、时间(18h、24h、30h、36h、42h)、转速(180rpm、200rpm、220rpm、240rpm、260rpm)、温度(26℃、28℃、30℃、32℃、34℃)、接种量(3％、4％、5％、6％、7％)和pH值(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)等影响羽毛角蛋白降解率的因素进行研究。

(5)发酵完成后将尼龙袋捞出，用自来水清洗掉培养基，再用蒸馏水反复清洗三次后，105℃烘干至恒重，称量发酵后的尼龙袋和其内部羽毛的总重量，记为M3。计算公式如下：

2实验结果

2.1有无氧对乳球菌羽毛粉降解率的影响

表2有无氧对乳球菌降解羽毛粉效率的影响

在有氧状态下，乳球菌对羽毛的降解率可达23.1％，高于无氧状态的13.7％，因此本试验采用有氧发酵降解羽毛，制备羽毛蛋白饲料。

2.2转速对乳球菌对羽毛粉降解效率的影响

表3转速对乳球菌羽毛降解效率的影响

在不同转速毛降解率呈先增加后降低的趋势，在转速为220rpm时，乳球菌对羽毛的降解率最高，可达到25.8％。因此，本试验选择发酵转速为220rpm。

2.3温度对乳球菌对羽毛粉降解效率的影响

表4温度对乳球菌羽毛降解效率的影响

在不同温度时羽毛降解率呈先增加后降低的趋势，在温度30℃时，乳球菌对羽毛的降解率最高，可达到28.2％。

2.4接种量对乳球菌对羽毛粉降解效率的影响

表5接种量对乳球菌羽毛降解效率的影响

在不同接种量时羽毛降解率呈先增加后降低的趋势，在接种量为5％时，乳球菌对羽毛的降解率最高，可达到24.4％。

2.5 pH值对乳球菌对羽毛粉降解效率的影响

表6 pH值对乳球菌羽毛降解效率的影响

在pH值为6.5时羽毛降解最高可达到27.2％。

2.6发酵时间对乳球菌对羽毛粉降解效率的影响

表7发酵时间对乳球菌羽毛降解效率的影响

在有氧条件下，以转速220rpm、温度为30℃、接种量为5％、pH值为6.5条件下，从18～36h阶段，羽毛的降解率呈快速增长状态，降解率从18h时的17.4％增长到36h的35.3％，而到42h时其降解率仅增长了不到0.5％，所以本试验最佳发酵时间为36h。

3讨论和结论

本试验采用“尼龙袋称重”的方法，分别对有无氧、转速、温度、接种量、pH值和发酵时间等影响羽毛角蛋白降解率的因素对乳球菌发酵羽毛条件进行优化分析。由于随着装液量减少，培养基中溶氧量增大，对于降解率影响不显著，从成本考虑本研究在发酵生产时，依据文献确定装液量为20％。

有无氧对乳球菌降解羽毛粉效率影响的结果表明，在有氧状态下，乳球菌对羽毛的降解率可达23.08％，高于无氧状态的13.61％。乳球菌为兼性厌氧微生物，在无氧条件下会产生乳酸等酸性物质。研究表明，在有氧条件下，氧气可以提高兼性厌氧菌的生长速率，菌种的生长数量相对提高。因此可分析羽毛角蛋白的降解率提高的原因为乳球菌数量增加，提高了羽毛的分解速率。

高转速可以提高液体培养基溶氧，但转速过快则会降低菌与发酵底物的接触几率，研究表明，通过试验分别探讨了10种搅拌桨叶对细菌发胶原纤维素的影响，结果表明菌体细胞的生长和发酵效果是同步偶联的，转速步控缩短了菌体生长的延迟期，使对数期提前、增殖速度加快，最高菌浓得到一定提升，与转速未控制时相比，生长曲线未出现明显的衰亡期。因此，转速对菌体发酵速率有一定的提升，最大菌体浓度也会随之增加。在本试验中，不同转速对羽毛降解效率的影响结果表明，在转速在180～260rpm之间，随转速的提高，羽毛降解率呈先增加后降低的趋势，在转速为220rpm时，降解率最高，可达到25.78％。这说明增加发酵液中的溶氧率确实可以提高乳球菌的生长速度，进而提高羽毛角蛋白的降解率，这也与前面有无氧的研究结果相吻合。但是当转速高于220rpm时，羽毛降解率下降，这可能是因为过大的转速降低了乳球菌与羽毛接触的几率，降低了乳球菌在羽毛表面的附着，从而导致羽毛降解率下降。

在微生物发酵羽毛粉的过程中，温度对羽毛粉降解率的影响主要有两个因素。一是微生物生命活动都由生物化学组成，受温度影响极其明显，温度是影响微生物生长繁殖的重要因素；二是温度可通过影响酶促反应速度或活性酶蛋白结构影响酶活。研究表明，乳球菌的最大生长速率随温度的升高而增加，而延滞期随温度的升高而降低，在超过最适温度时，延滞期延长明显，速率降低。在本试验中，不同温度对羽毛降解效率影响结果表明，在不同温度时羽毛降解率呈先增加后降低的趋势，在温度30℃时，乳球菌对羽毛的降解率最高，可达到28.15％，与菌种最适生长温度一致，说明菌的生长数量与降解率存在一定的正比例关系。

在生产实践中，接种量少，将使发酵过程延长，拖延发酵时间，增加能耗，造成发酵成本升高，增加杂菌污染的机会，造成发酵效果下降，如将种子液的接种量扩大，将缩短发酵期，虽对发酵有利，但过大的接种量反而可能会引起在发酵开始的时候微生物浓度较高，大量消耗发酵底物，易造成降解阶段必须的营养物质无法满足微生物生长需要，促使菌体“早衰”、“自溶”。在本试验中，不同接种量对羽毛降解效率影响的结果表明，在不同接种量时羽毛降解率呈先增加后降低的趋势，在接种量为5％时，乳球菌对羽毛的降解率最高，可达到24.36％。

环境中的pH值对微生物的生命活动影响很大，主要作用在于：引起细胞膜电荷的变化，从而影响了微生物对营养物质的吸收；影响代谢过程中酶的活性；改变生长环境中营养物质的可给性以及有害物质的毒性。研究表明，pH值会影响细胞膜的电荷状态，引起膜的渗透性发生改变进而影响菌体对营养物质的吸收和代谢产物的形成，同时还能影响产物的稳定性。在本试验中，不同pH值对羽毛降解效率影响的结果表明，在pH值为6.5时羽毛降解最高可达到27.24％，在其最适生长条件pH范围内，但与最适生长pH有一定的偏差，这可能是因为该乳球菌在酸性条件下，会加速生成乳酸，而影响羽毛的降解效率。

发酵时间的选取通常选择发酵过程中快速增长与平缓增长的节点，既节约成本，又能提高效率，本试验结果表明，乳球菌在发酵36h前的羽毛粉降解率呈上升趋势，36h之后则上升缓慢，有持平迹象，因此本试验中乳球菌发酵羽毛粉的最适发酵时间为36h。

实施例三：发酵羽毛粉理化性质分析

1实验方法

1.1发酵羽毛粉形态结构的分析

从市场中收集当天的羽毛废弃物，用自来水洗净，再用蒸馏水洗3次，于65℃烘箱中烘干至恒重，粉碎过40目筛制成羽毛粉。将羽毛粉发酵产物及尼龙袋一同用自来水洗净，再用蒸馏水洗3次，取出羽毛粉先于120℃烘箱中灭菌15min，后65℃烘干至恒重，粉碎过40目筛，根据实施例二优化的条件按照如下步骤制备发酵羽毛粉(即蛋白饲料)，具体方法如下：

(1)将羽毛清洗后与水、琼脂混合并搅拌均匀(羽毛重量与水的重量之比为10:1；琼脂的重量与羽毛的重量之比为1:200)，烘干后粉碎后，置于400目的尼龙布上，流动水清洗去除琼脂后烘干，再过60目筛；灭菌后按照羽毛粉的添加量为：羽毛粉重量与发酵培养基重量之比为1:4向发酵培养基中加入羽毛粉；

(2)将乳酸乳球菌KDLL2016-01进行复苏培养后接种至液体种子培养基中在温度为30℃、pH值为6.0和转速为200rpm的条件下进行种子培养48h，得乳酸乳球菌KDLL2016-01的种子培养液，将所得乳酸乳球菌KDLL2016-01的种子培养液按照5.7％(v/v)的接种量接种至发酵培养基中，进行发酵培养；其中：发酵培养的条件为：有氧，初始pH值6.3，发酵温度32℃，转速220rpm，发酵时间为36h；液体种子培养基的配方为：牛肉膏8.0g，蛋白胨10.0g，酵母膏4.0g，葡萄糖20.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，磷酸氢二钾2.0g，乙酸钠5.0g，硫酸镁0.2g，吐温80 1.0g，硫酸锰0.05g，去离子水1000mL，121℃灭菌20min；发酵培养基配方为：牛肉膏10g，酵母膏10g，蔗糖100g，氯化钠2g，磷酸氢二钾10g，硫酸镁0.5g，pH值为6.0，121℃灭菌20min。

(3)发酵完成后将发酵产物进行干燥是将发酵产物进行过滤得发酵液和固体，将所得发酵液进行喷雾干燥，并将所得固体烘干，然后将烘干后的固体粉末与喷雾干燥后的固体粉末合并，获得蛋白饲料。

进行如下实验：

(1)羽毛粉发酵前后表观形态观察。通过视觉直接观察羽毛粉和发酵羽毛粉的表观形态、颜色等表观性状。

(2)羽毛粉发酵前后光学显微镜观察。利用光学微镜(AMG Auto FL)观察羽毛粉的粉碎程度、颗粒大小及形态。

(3)羽毛粉发酵前后扫描电镜观察。将羽毛粉放入配制好的***和乙醇(95％)1：1混合脱脂液中，超声清洗2min后于操作台中自然干燥，用小镊子将干燥样品放在样品台上，轻轻展平，Eiko IB-3离子溅射仪导电处理90s，用扫描电镜(HITACHI S-3400N)观察液体发酵前后羽毛粉的微观结构变化。

1.2发酵羽毛粉常规营养成分及氨基酸组成分析

(1)羽毛粉及发酵羽毛粉常规营养成分测定。粗蛋白含量采用凯氏定氮法测定；粗脂肪含量采用***抽提法测定；能量采用Parr 6300型氧弹量热仪测定；Ca和P分别采用高锰酸钾法和比色法测定。

(2)羽毛粉及发酵羽毛粉氨基酸成分测定。羽毛粉和发酵羽毛粉样品先用6mol/L盐酸水解24h(110℃)，转移定容后0.45μm滤膜过滤，在日立L-8900型氨基酸自动分析仪上测定氨基酸含量。

2实验结果

2.1发酵羽毛粉结构分析

图3中左图为正常羽毛粉，右图为发酵羽毛粉(蛋白饲料)，由图3可知：与正常羽毛粉相比，发酵羽毛粉质地相对较致密，羽毛形态保留程度低，粉碎程度较大，颜色稍深。

图4中左图为普通电子显微镜下的羽毛粉，右图为发酵羽毛粉(蛋白饲料)，由图4可知：正常羽毛粉碎后多为条状短节，羽轴结构清楚，羽小枝部分呈片状；而发酵羽毛粉颗粒更小，小段羽轴与羽小枝粉碎效果明显。

图5中左图为扫描电镜下的羽毛粉，右图为发酵羽毛粉(蛋白饲料)，由图5可知：正常羽毛经过粉碎后虽破碎程度发生了变化，羽毛各部分结构完整，表面光滑，形态规律，羽轴与羽小枝表面髓鞘未被破坏，内部结构未打开。经发酵培养后的羽毛粉，羽轴断裂，断面不规则层度加深，髓鞘分解，内部结构多暴露，形成团状或者散条状。

2.2发酵羽毛粉常规营养成分及氨基酸组成分析

由表8可知：乳球菌发酵使羽毛粉能量降低了2％；粗脂肪含量升高了0.3％；粗蛋白含量降低了6.95％；粗灰分含量升高了78.26％；钙含量降低了4.44％；磷含量升高了200％。

表8发酵羽毛粉常规营养成分

由表9可知：乳球菌发酵使羽毛粉蛋氨酸含量升高了2.44％；酪氨酸含量升高了7.25％；其余15种氨基酸含量均有所降低，其中半胱氨酸含量降低了22.38％。

表9发酵羽毛粉氨基酸组成

3讨论与结论

本试验通过视觉观察、光学显微镜和扫描电镜，以三个层次从宏观到微观研究乳球菌发酵对羽毛粉形态结构的改变。本试验宏观观察结果表明，与正常羽毛粉相比，发酵羽毛粉质地相对较致密，羽毛形态保留程度低，粉碎程度较大，颜色稍深。这可能是乳球菌发酵羽毛过程中分解羽毛表面物质，使得内部颜色较深的部分外露，也可能是发酵培养基中葡萄糖经高温高压灭菌后颜色发黄，羽毛粉在其中发酵一段时间颜色随之发生变化。

本试验通过光学显微镜观察乳球菌降解前后羽毛粉的结构结果表明，正常羽毛粉碎后多为条状短节，羽轴结构清楚，羽小枝部分呈片状而发酵羽毛粉颗粒较小，小段羽轴与羽小枝粉碎效果明显，进一步说明乳球菌发酵分解了羽毛表面不同位置，致其断裂，增大了粉碎程度。根据本试验电镜观察中羽轴破碎程度可以证明本研究乳球菌对羽毛角蛋白的降解作用。

与光学显微镜相比，扫描电镜能直接观察样品表面的结构，制备过程简单，观察过程中，可进行三维空间的平移和旋转，从各种角度对样品进行观察，景深较光学显微镜大几百倍，分辨率也比较高，图像富有立体感，放大范围广，可放大十几倍到几十万倍。本试验扫描电镜观察结果表明，羽毛各部分结构由其表面光滑的完整形态变为团状或者散条状。羽轴与羽小枝表面髓鞘分解明显，原因可能是羽毛结构中二硫键及化学键断裂，使表面粗糙，结构松散。由本试验电镜图片还可以看出部分羽毛结构由排列整齐的条状变为质地疏松的块状，与经过膨化的羽毛粉结构相似，有利于动物体的消化和吸收。

实施例四发酵羽毛在蛋鸡中的应用

1.实验方法

1.1实验设计和饲料组成

(1)试验采用单因子随机试验设计，选取27周龄、体重相近、健康蛋鸡150羽，随机分成3组，即对照组(鱼粉组)、2％发酵羽毛粉组(50％替代鱼粉组)、4％发酵羽毛粉组(100％替代鱼粉组)，每组5个重复，每个重复10羽，在蛋鸡32周龄时结束试验，实验期为5周，本试验中“发酵羽毛粉”为实施例二中利用本发明方法制备的发酵羽毛粉(蛋白饲料)。

(2)在试验开始首先要彻底清扫鸡舍，刷洗鸡笼、料槽、水槽、粪垫以及地面，门口设置消毒设施。用高锰酸钾和***溶液按一定配比混合进行密闭熏蒸消毒。蛋鸡采用层叠式金属笼饲养，每笼1只。每天08:00定量投料，自由饮水。舍内温度控制在20℃左右，湿度控制在60％左右，试验期内采用自然光照与人工光照相结合的方式，在产蛋初期，光照周期逐渐以0.5h每周的速度增加，直至16h/d，定期进行防疫消毒，每天要清洗水槽，保证水的供应和清洁。每日观察鸡群的状况，观察采食饮水是否正常以及粪便是否异常等，并且做好当日记录。

日粮配方参照NRC家禽营养需要(1998版)，基础日粮养分含量均达到或超过该标准，基础日粮配方见下表10。

表10蛋鸡产蛋期饲粮组成及营养水平(风干基础)

注：预混料为每千克饲粮提供维生素A 12 000IU，维生素D₂ 400IU，维生素E30IU，维生素K₃ 1.5mg，维生素B₁₂ 0.012mg，维生素B₁ 2.0mg，生物素0.20mg，叶酸1.2mg，烟酸35mg，泛酸12mg，吡哆醇4.5mg，核黄素9mg，铜8mg，碘1.0mg，铁80mg，锰100mg，硒0.30mg，锌80mg。

1.2测定指标和方法

(1)饲粮营养物质表观代谢率指标的测定

代谢试验采用全收粪法，在试验蛋鸡31周龄即试验第29d开始。每天准确记录各组试验蛋鸡的采食量，准确收集每组试验蛋鸡每天***的粪，清除收集的粪中脱落的毛发及生长环境中的杂物，连续收集3d。将每天收集的粪便进行称重，加入质量为粪便鲜重10％盐酸溶液充分混匀，于-20℃保存，在全部试验结束后，将采自同一组的粪充分混合均匀，每组大约选取100g左右新鲜粪样进行风干样品的制备，选取的新鲜粪样首先在120℃烘箱中烘15min灭酶活后，降至65℃烘干，经24h充分回潮后称重至恒重，粉碎制成待测样品。测定粪和料的能量、粗蛋白、粗脂肪及Ca、P的含量。粗蛋白含量采用凯氏定氮法测定；粗脂肪含量采用***抽提法测定；能量采用Parr 6300型氧弹量热仪测定；Ca和P分别采用高锰酸钾法和比色法测定。，计算养分表观代谢率。

(2)产蛋性能指标的测定

根据产蛋个数、蛋重及耗料量计算产蛋率、平均蛋重、饲料转化率(料蛋比)以及破软壳率。各指标测定方法如下：

1)产蛋率：每天相同时间(16:00)记录每组各重复的产蛋数目，计算当天每重复的产蛋率和各组日产蛋率均值，计算公式如下：

2)平均蛋重：每周连续三天(周一至周三)，在相同时间采集(16:00)鸡蛋，电子天平称量每重复的总蛋重，计算平均蛋重，计算公式如下：

3)日采食量：每周日统计每组各重复蛋鸡全周耗料量，余料回收，计算日平均采食量；

4)破软壳率：每天相同时间(16:00)记录每组各重复的破软壳蛋数目。计算每重复的破软壳率和各组破软壳率均值，计算公式如下：

(5)饲料转化率(料蛋比)：根据日采食量和日平均蛋重计算其比值。

(3)蛋品质指标的测定

每三天相同时间(12:00)在每组各重复中随机采集3枚鸡蛋，1枚备用，当天进行蛋品质测定，测定顺序及方法如下：

1)蛋重：分析天平准确称量每枚鸡蛋的重量，精确至0.0001g；

2)蛋形指数：使用蛋形指数测定仪(NFN-385，富士平工业株式会社，东京，日本)测定每枚鸡蛋的横径与纵径，计算其蛋形指数，计算公式如下：

3)蛋壳强度：将完整的鸡蛋置于蛋壳强度测定仪(II型，富士平工业株式会社，东京，日本)上，选择相应程序测定蛋壳强度；

4)哈夫单位：使用蛋白高度测定仪(NFN-381，富士平工业株式会社，东京，日本)测量浓蛋白高度，测量时取蛋黄边缘与浓蛋白边缘之中点，测量2或3个点的蛋白高度，求其平均值并计算哈夫单位，计算公式如下：

哈夫单位＝100×log(H-1.7×W^0.37+7.6)

H：浓蛋白高度，单位：mm w：蛋重，单位：g；

5)蛋黄颜色：将鸡蛋打碎，使用蛋黄分离器将蛋黄与蛋清分离，在荧光灯下与罗氏比色扇比色，试验中两个人分别对同一蛋黄进行读数，取其平均值；

6)蛋壳厚度：使用蛋壳厚度计(NFN-380，富士平工业株式会社，东京，日本)测定蛋的锐端、钝端和中部3个部分的蛋壳厚度，取其平均值；

7)蛋黄相对重：用蛋黄分离器将蛋清和蛋黄完全分离，称量蛋黄重量，计算公式如下：

2.实验结果

2.1发酵羽毛粉对蛋鸡饲粮营养物质代谢率的影响

由表11可知：对照组、2％发酵羽毛粉组和4％发酵羽毛粉组的干物质表观代谢率、脂肪表观代谢率、蛋白质表观代谢率、代谢能表观代谢率、灰分表观代谢率无显著差异(P>0.05)；但对照组的钙的表观代谢率显著高于发酵羽毛组(P<0.05)，2％发酵羽毛粉组钙的表观代谢率高于4％发酵羽毛粉组，但差异不显著(P>0.05)。添加发酵羽毛粉后，蛋鸡磷的表观代谢率有下降趋势，其中4％发酵羽毛粉组显著低于对照组(P<0.05)。

表11发酵羽毛粉对蛋鸡营养物质代谢率的影响(％)

注：同一行数据肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)。(下表同)

2.2发酵羽毛粉对蛋鸡产蛋性能的影响

由表12可知：对照组、2％发酵羽毛粉组和4％发酵羽毛粉组的产蛋率、蛋重、日采食量、合格率、破蛋率、料蛋比均无显著差异。

表12发酵羽毛粉对蛋鸡产蛋性能的影响

2.3发酵羽毛粉对蛋鸡蛋品质的影响

由表13可知：对照组、2％发酵羽毛粉组和4％发酵羽毛粉组的蛋形指数、蛋壳强度、蛋黄颜色、蛋白高度、哈夫单位、蛋黄相对重均无显著差异，4％发酵羽毛粉组的蛋壳厚度显著高于对照组和2％发酵羽毛粉组。

表13发酵羽毛粉对蛋鸡蛋品质的影响

3.讨论与结论

在当前家禽饲养产业滑坡趋势下，如何在保证生产的情况下降低饲料成本成为目前的研究热点，利用水解羽毛粉、酶解羽毛粉等替代动物饲粮中的价格较高蛋白饲料成为了切实有效的解决办法。营养物质的表观代谢率是体现饲粮饲喂效果最直观的表示方法，营养物质能更好的被动物机体吸收利用才是改善饲料品质最主要的目的，才能保证机体健康生长，正常发育。营养物质表观代谢率主要受肠道微生物、日粮氨基酸组成及饲料原料品质等多种因素的影响。有研究评定三种羽毛粉对肉鸭的能量表观代谢率分别为81.51％、73.07％和76.85％，相较于本试验结果偏低，说明试验中乳球菌发酵羽毛粉相较于其他羽毛发酵饲料，具有较高的饲用价值，应用前景广阔。本试验中，发酵羽毛粉中微量元素，特别是磷含量显著升高，同时发酵羽毛粉替代鱼粉组磷的表观代谢率也显著高于羽毛粉替代鱼粉组，说明乳球菌发酵羽毛可通过改变微量元素改善蛋鸡代谢。发酵羽毛粉替代鱼粉会显著提高普通羽毛粉各营养物质表观代谢率，且除钙的表观消化率有所降低外，与鱼粉饲粮的饲喂效果无显著影响，说明通过乳球菌发酵确实分解了羽毛角蛋白的坚硬“外壳”，使营养成分更容易被消化吸收，对蛋鸡消化代谢无不利影响，同时还能降低饲粮成本，减少资源浪费，推进环境友好发展。

产蛋性能是评定蛋鸡价值及品质是重要指标，本试验通过不同水平乳球菌发酵羽毛粉替代日粮中鱼粉饲喂蛋鸡，结果表明，发酵羽毛粉则对蛋鸡产蛋性能无显著影响。2％发酵羽毛粉组的产蛋率高于4％发酵羽毛粉组，原因可能是羽毛粉中缺乏Met、Lys、Trp和His等氨基酸，因此在使用羽毛粉配制日粮时易造成这几种氨基酸缺乏。本试验配方中仅考虑了Lys，Met的满足，而未兼顾到His，Trp等的氨基酸平衡，故当蛋鸡日粮中羽毛粉添加量增加时，His及Trp更容易缺乏，这可能是造成较高羽毛粉添加量升高同时蛋鸡产蛋率下降的原因。

蛋黄颜色是衡量蛋品质的重要感官指标，对鸡蛋食用价值没有影响，但随着人们消费水平的提高，蛋黄颜色逐渐引起消费者的重视，并直接影响消费者的购买力，具有经济价值。蛋黄颜色主要受遗传和饲料中着色物质的影响。蛋白高度主要受饲粮能量、采食量的影响。哈夫单位值越高，蛋白越稠，蛋白品质越好，主要受消化吸收的营养成分含量及组成的影响。此外，蛋黄营养丰富，蛋黄相对重也是衡量鸡蛋营养含量的一项重要指标。蛋黄相对重越大，表明鸡蛋的营养水平越高，除了受遗传因素影响外，饲粮的营养水平也很重要。本试验结果表明，发酵羽毛粉替代鱼粉对蛋鸡蛋壳强度、蛋黄颜色、蛋白高度、哈夫单位和蛋黄相对重无显著影响，说明发酵羽毛粉的蛋白品质几乎与鱼粉无差异。

蛋形指数是蛋鸡种质分类的指标之一，仅与包装和运输相关。研究表明，蛋形指数与蛋重具有一定相关性，随蛋重的增加蛋形指数有下降的趋势。本试验中，发酵毛粉替代鱼粉对蛋重无显著影响，蛋形指数也无显著差异。

蛋壳厚度是衡量蛋品质的重要指标，直接影响胚胎的死亡率、种蛋的孵化率，具有重要的经济价值。良好的蛋壳强度和蛋壳厚度可减少鸡蛋的破损率，提高经济效益。蛋壳厚度和蛋壳强度对鸡蛋的新鲜度有一定影响。本试验结果表明，饲粮添加4％发酵羽毛粉可显著提高蛋鸡蛋壳厚度。分析原因可能是，发酵羽毛粉中较高的蛋白含量及氨基酸水平的共同作用，使蛋壳中蛋白沉积增多，蛋壳厚度增加，进而提高蛋鸡蛋品质。

本试验通过筛选鉴定出一株能降解羽毛的益生菌(乳球菌)，为羽毛降解菌的研究提供了新思路，为结合微生物特性，利用未灭活乳球菌发酵羽毛粉直接饲喂试验动物或者采取复合酶发酵手段，进一步开发研究奠定基础。本研究中蛋鸡饲喂试验周期较短，目的是探究发酵羽毛粉初步饲喂效果，仍需要在此基础上进一步提高降解效率，结合膨化、固态发酵等多种生产手段，使乳球菌发酵羽毛形成产品，应用于大规模生产验证，为形成产业体系提供理论基础。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。