一种rgd环化五肽的制备工艺
阅读说明：本技术 一种rgd环化五肽的制备工艺 (Preparation process of RGD cyclized pentapeptide ) 是由 胡峻 计炜 徐春夏 徐佩 于 2019-11-13 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种RGD环化五肽的制备工艺,针对该环肽的特殊结构,将天冬氨酸侧链的羧基固定在树脂上,在偶联氨基酸结束后,分别脱去天冬氨酸主链羧基的保护基团(OMe或者Oall)和D-苯丙氨酸上的Fmoc基团,然后进行固相成环,成环结束,切割树脂即可得到纯度较高的环形RGD五肽,且收率较高。该工艺价格操作简单,易于工业化生产。(The invention provides a preparation process of RGD cyclized pentapeptide, which is characterized in that aiming at the special structure of the cyclic peptide, carboxyl of an aspartic acid side chain is fixed on resin, after coupling amino acid is finished, a protecting group (OMe or Oall) of aspartic acid main chain carboxyl and an Fmoc group on D-phenylalanine are respectively removed, then solid phase cyclization is carried out, cyclization is finished, and the resin is cut to obtain the ring-shaped RGD pentapeptide with higher purity and higher yield. The process is simple in price operation and easy for industrial production.)
技术领域
本发明涉及固相多肽合成领域，具体涉及一种RGD环化五肽的制备工艺。
背景技术
随着环境因素的改变，各类癌症发病率和死亡率均有所增加。在一些肿瘤细胞或者肿瘤新生血管内皮细胞常特异性地高表达某些整合素受体：如αvβ3，而正常组织血管中含量很少。RGD肽是一类含有精氨酸、甘氨酸、天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)的短肽，作为整合素和其配体相互作用的识别位点,能与肿瘤细胞或者新生血管特异表达的某些整合素如αvβ3结合。因此，这类受体可以作为肿瘤靶向治疗的靶点,利用外源RGD肽竞争结合整合素受体可以靶向标记定位肿瘤，达到更有效、精确和安全治疗的目的。大多数内源性线性RGD肽在血浆中的半衰期极短，对αvβ3受体亲和力较低，其定位效果和生物活性不够理想。因此人们对RGD肽进行修饰与改造,以提高RGD肽的稳定性、亲和性、特异性、靶向性，延长在体内的作用时间。发现RGD肽一级序列后紧跟谷氨酸残基可有最大亲和性并证实环化肽具有更稳定的结构和更强的亲和性。许多与RGD肽相关的药物被开发出来，其中CN101428148、CN101485891、CN101474415中均涉及一种RGD多肽放射性药物，该放射性药物的结构为99mTc-HYNIC-PKM-E[L-c(RGDxK)]2，其中c(RGDxK)为一包含精氨酸、甘氨酸、天冬氨酸的环形五肽，是一个重要的起始原料。CN106518966A公开了一种RGD环肽的合成方法，该方法为固相合成线性全保护五肽后，进行液相环合，收率在75％左右。因为线性肽在进行液相环合的过程中，不可避免地会发生聚合等副反应，而导致收率下降，而且环合过程中使用的缩合剂与终产品混合在一起，分离困难。CN103588863B公开了一种RGD环肽的合成方法，该方法为将Asp主链的羧基固定在树脂上，固相合成线性全保护五肽后，分别脱去Asp侧链的保护基团Oall及苯丙氨酸的Fmoc基团，进行固相环合。该工艺中使用的Asp保护氨基酸，保护基团为Oall，价格较高，另外脱去Oall，需要用到昂贵的四(三苯基膦)钯，另外四(三苯基膦)钯的使用给药品带来了残留重金属钯的隐患。
发明内容
本发明的目的在于针对以上技术问题，提供一种合成路线简单、生产成本低、高收率、高纯度的RGD环化五肽的制备工艺。
本发明的技术方案如下：
一种RGD环化五肽的制备方法，反应方程式为：
本发明中所用缩写及其含义列于下表：
具体步骤为：
(1)制备中间体5：将树脂与Fmoc-天冬氨酸(X)侧链上的羧基偶联，得到中间体5。树脂是CTC树脂；X-为天冬氨酸羧基的保护基团，是OMe、Oall；
(2)制备中间体4：使用固相合成法依次将R-Asp(X)树脂与Fmoc-甘氨酸、Fmoc-精氨酸(R1)、Fmoc-赖氨酸(R2)、Fmoc-D-苯丙氨酸、偶联，得到中间体4。R1-为精氨酸氨基的保护基团，是Pbf；R2-为赖氨酸氨基的保护基团，是Boc、Dde；
(3)制备中间体3：使用NaOH/DMF溶液脱去天冬氨酸上的OMe基团，或使用四(三苯基膦)钯脱去天冬氨酸上的Oall基团；使用DBLK溶液(20％)脱去D-苯丙氨酸上的Fmoc基团，得到中间体3；
(4)制备中间体2：使用缩合剂HOBT/DIC，HBTU/DIEA将树脂上的线性肽环化，得到中间体2；
(5)制备目标化合物：将RGD环化五肽在弱酸条件下从树脂上切割下来。
本发明的有益效果是：本发明针对该环肽的特殊结构，将天冬氨酸侧链的羧基固定在树脂上，在偶联氨基酸结束后，分别脱去天冬氨酸主链羧基的保护基团(OMe或者Oall)和D-苯丙氨酸上的Fmoc基团，然后进行固相成环，成环结束，切割树脂即可得到纯度较高的环形RGD五肽，且收率较高。该工艺价格操作简单，易于工业化生产，且使用的Fmoc-天冬氨酸(OMe)与Fmoc-天冬氨酸(Oall)相比，价格仅为Fmoc-天冬氨酸(Oall)的三分之一，且脱去OMe基团的反应条件相对简单，仅需要在NaOH碱性条件下即可，无需用到昂贵的四(三苯基膦)钯。
具体实施方式
实施例1：制备环[天冬氨酰-甘氨酰-精氨酰(Pbf)-赖氨酰(Dde)-D-苯丙氨酰]
按照如下步骤操作：
1、中间体5的制备
名称
分子量
比例
投料量(g)
CTC树脂(Sub1.00mmol/g)
/
1.0
10.00
Fmoc-Asp(Ome)
369.37
3.0
11.08
DIEA
129.24
12.0
15.51
称取2-Chlorotrityl chloride resin树脂10.00g 10.00mmol(W克)(Nmmol)，将树脂加入到反应器中，加入DMF充分洗涤、溶胀树脂。
以2-Chlorotrityl chloride resin树脂摩尔量N为基数，按一定投料比称量以下物料：Fmoc-Asp-OMe11.08g(3.0倍量)，用适量DMF溶解，加入到反应器中，加入DIEA15.51g(12.0倍量)，偶联反应2.0±0.5小时，DMF洗涤3次。用DCM/MeOH/DIEA(3:1:1)封闭10分钟，重复1次。甲醇收缩，将该肽树脂真空干燥12小时以上，称量肽树脂的重量13.40g。
检测该CTC-Asp(OMe)的替代度为0.56mmol/g，N0mmol＝13.40*0.56＝7.50mmol。
2、中间体4的制备
名称
分子量
比例
投料量(g)
CTC-Asp(OMe)(Sub0.56mmol/g)
/
1.00
13.40
Fmoc-Gly-OH
297.3
3.00
6.69
HOBT
135.13
3.00
3.04
DIC
126.20
3.00
2.84
Fmoc-Arg(Pbf)-OH
648.8
3.00
14.61
HOBT
135.13
3.00
3.04
DIC
126.20
3.00
2.84
Fmoc-Lys(Dde)-OH
532.58
3.00
11.99
HOBT
135.13
3.00
3.04
DIC
126.20
3.00
2.84
Fmoc-D-Phe-OH
387.4
3.00
8.72
HOBT
135.13
3.00
3.04
DIC
126.20
3.00
2.84
称取CTC-Asp(OMe)13.40g 7.50mmol(W0克)(N0mmol)，将树脂加入到反应器中，加入DMF洗涤树脂后，将20％DBLK[20％哌啶/DMF(V/V)](用量3-4ml/克树脂)加入反应器中，反应10+10分钟，用DMF洗涤树脂。
以CTC-Asp(OMe)树脂摩尔量N0为基数，按表格中的投料比称量以下物料：Fmoc-Gly-OH 6.69g(3.0倍量)；HOBT 3.04g(3.0倍量)；用适量DMF溶解。冰浴下加入DIC 2.84g(3.0倍量)，活化反应3±1分钟后加入到反应器中。偶联反应2.0±0.1小时，用DMF洗涤4次。
检测反应：取少量反应液，滴3-5滴茚三酮溶液，加热至沸腾；以DMF洗涤树脂颗粒，观察是否显色，以确定反应是否完全。
重复上述操作将下列Fmoc-AA偶联到树脂上Fmoc-Arg(Pbf)、Fmoc-Lys(Dde)、Fmoc-D-phe。
3、中间体3的制备
将10％NaOH/DMF[10％NaOH/DMF(g/g)]68g(用量5-6ml/克树脂)加入反应器中，反应2.0±0.5小时，用DMF洗涤树脂；将20％DBLK[20％哌啶/DMF(V/V)](用量3-4ml/克树脂)加入反应器中，反应10+10分钟，用DMF洗涤树脂。
4、中间体2的制备
以CTC-Asp(OMe)13.40g 7.50mmol(W0克)(N0mmol)摩尔量N0为基数，HOBT 3.04g(3.0倍量)用适量DMF溶解加入到反应器中，DIC 2.84g(3.0倍量)加入到反应器中。偶联反应2.0±0.1小时，用DMF洗涤4次。
检测反应：取少量反应液，滴3-5滴茚三酮溶液，加热至沸腾；以DMF洗涤树脂颗粒，观察是否显色，以确定反应是否完全。
树脂用甲醇收缩，氮气流室温鼓风干燥得中间体2 15.8g。
5、目标化合物：环[天冬氨酰-甘氨酰-精氨酰(Pbf)-赖氨酰(Dde)-D-苯丙氨酰]的制备
裂解液配置：按10ml/g的比例，配置裂解液：(DCM:冰乙酸:三氟乙醇＝5:1:1)
***/石油醚：根据100ml/g树脂的比例，其中***：石油醚＝1:1v/v
树脂称量：称取15.8gW(g)干燥的肽树脂，投入至裂解反应瓶中。在冰浴(0-5℃)条件下，缓慢加入配置的冰冻裂解液158ml，充分搅拌0.5小时，撤去冰浴。室温(20-30℃)下充分搅拌树脂,反应1.5～2.0小时，反应完毕后收集滤液。搅拌下将滤液缓慢加入10倍体积的冰冻***/石油醚1580ml中，搅拌均匀，离心，收集沉淀。将所得环状RGD肽，真空干燥8.0小时以上，置于冰箱，冷藏保存。产品7.38g，收率96.4％，产品纯度为95.8％。
实施例2：制备环[天冬氨酰-甘氨酰-精氨酰(Pbf)-赖氨酰(Dde)-D-苯丙氨酰]
按照如下步骤操作：
1、中间体5的制备
名称
分子量
比例
投料量(g)
CTC树脂(Sub1.00mmol/g)
/
1.0
10.00
Fmoc-Asp(Oall)
395.40
3.00
11.86
DIEA
129.24
12.0
15.51
称取2-Chlorotrityl chloride resin树脂10.00g 10.00mmol(W克)(Nmmol)，将树脂加入到反应器中，加入DMF充分洗涤、溶胀树脂。
以2-Chlorotrityl chloride resin树脂摩尔量N为基数，按一定投料比称量以下物料：Fmoc-Asp-Oall 11.86g(3.0倍量)，用适量DMF溶解，加入到反应器中，加入DIEA15.51g(12.0倍量)，偶联反应2.0±0.5小时，DMF洗涤3次。用DCM/MeOH/DIEA(3:1:1)封闭10分钟，重复1次。甲醇收缩，将该肽树脂真空干燥12小时以上，称量肽树脂的重量13.78g。
检测该CTC-Asp(Oall)的替代度为0.60mmol/g，N0mmol＝13.78*0.60＝8.27mmol。
2、中间体4的制备
名称
分子量
比例
投料量(g)
CTC-Asp(Oall)(Sub0.60mmol/g)
/
1.00
13.78
Fmoc-Gly-OH
297.3
3.00
7.37
HOBT
135.13
3.00
3.35
DIC
126.20
3.00
3.13
Fmoc-Arg(Pbf)-OH
648.8
3.00
16.09
HOBT
135.13
3.00
3.35
DIC
126.20
3.00
3.13
Fmoc-Lys(Dde)-OH
532.58
3.00
13.21
HOBT
135.13
3.00
3.35
DIC
126.20
3.00
3.13
Fmoc-D-Phe-OH
387.4
3.00
9.61
HOBT
135.13
3.00
3.35
DIC
126.20
3.00
3.13
称取CTC-Asp(Oall)13.78g 8.27mmol(W0克)(N0mmol)，将树脂加入到反应器中，加入DMF洗涤树脂后，将20％DBLK[20％哌啶/DMF(V/V)](用量3-4ml/克树脂)加入反应器中，反应10+10分钟，用DMF洗涤树脂。
以CTC-Asp(Oall)树脂摩尔量N0为基数，按一定投料比称量以下物料：Fmoc-Gly-OH7.37g(3.0倍量)；HOBT 3.35g(3.0倍量)；用适量DMF溶解。冰浴下加入DIC 3.13g(3.0倍量)，活化反应3±1分钟后加入到反应器中。偶联反应2.0±0.1小时，用DMF洗涤4次。
检测反应：取少量反应液，滴3-5滴茚三酮溶液，加热至沸腾；以DMF洗涤树脂颗粒，观察是否显色，以确定反应是否完全。
重复上述操作将下列Fmoc-AA偶联到树脂上Fmoc-Arg(Pbf)、Fmoc-Lys(Dde)、Fmoc-D-phe。
3、中间体3的制备
名称
分子量
比例
投料量(g)
CTC-Asp(Oall)(Sub0.60mmol/g)
/
1.00
13.78
四(三苯基膦)钯
1155.56
0.10
0.96
以CTC-Asp(Oall)树脂摩尔量N0为基数，将四(三苯基膦)钯0.96g(0.1倍量)用适量DMF溶解加入到反应器中，反应30±10分钟，用DMF洗涤树脂；将20％DBLK[20％哌啶/DMF(V/V)](用量3-4ml/克树脂)加入反应器中，反应10+10分钟，用DMF洗涤树脂。
4、中间体2的制备
以CTC-Asp(Oall)树脂13.40g 7.50mmol(W0克)(N0mmol)摩尔量N0为基数，HOBT3.35g(3.0倍量)用适量DMF溶解加入到反应器中，DIC3.13g(3.0倍量)加入到反应器中。偶联反应2.0±0.1小时，用DMF洗涤4次。
检测反应：取少量反应液，滴3-5滴茚三酮溶液，加热至沸腾；以DMF洗涤树脂颗粒，观察是否显色，以确定反应是否完全。
树脂用甲醇收缩，氮气流室温鼓风干燥得中间体2 16.2g。
5、目标化合物：环[天冬氨酰-甘氨酰-精氨酰(Pbf)-赖氨酰(Dde)-D-苯丙氨酰]的制备
裂解液配置：按10ml/g的比例，配置裂解液：(DCM:冰乙酸:三氟乙醇＝5:1:1)
***/石油醚：根据100ml/g树脂的比例，其中***：石油醚＝1:1v/v
树脂称量：称取16.2gW(g)干燥的肽树脂，投入至裂解反应瓶中。在冰浴(0-5℃)条件下，缓慢加入配置的冰冻裂解液162ml，充分搅拌0.5小时，撤去冰浴。室温(20-30℃)下充分搅拌树脂,反应1.5～2.0小时，反应完毕后收集滤液。搅拌下将滤液缓慢加入10倍体积的冰冻***/石油醚1620ml中，搅拌均匀，离心，收集沉淀。将所得环状RGD肽,真空干燥8.0小时以上，置于冰箱，冷藏保存。产品7.95g，产品收率94.2％，产品纯度为97.4％。
实施例3：制备环[天冬氨酰-甘氨酰-精氨酰(Pbf)-赖氨酰(Boc)-D-苯丙氨酰]
按照如下步骤操作：
1、中间体5的制备
名称
分子量
比例
投料量(g)
CTC树脂(Sub1.00mmol/g)
/
1.0
10.00
Fmoc-Asp(Oall)
395.40
3.00
11.86
DIEA
129.24
12.0
15.51
称取2-Chlorotrityl chloride resin树脂10.00g 10.00mmol(W克)(Nmmol)，将树脂加入到反应器中，加入DMF充分洗涤、溶胀树脂。
以2-Chlorotrityl chloride resin树脂摩尔量N为基数，按一定投料比称量以下物料：Fmoc-Asp-Oall 11.86g(3.0倍量),用适量DMF溶解，加入到反应器中，加入DIEA15.51g(12.0倍量)，偶联反应2.0±0.5小时，DMF洗涤3次。用DCM/MeOH/DIEA(3:1:1)封闭10分钟，重复1次。甲醇收缩，将该肽树脂真空干燥12小时以上，称量肽树脂的重量13.95g。
检测该CTC-Asp(Oall)的替代度为0.61mmol/g，N0mmol＝13.95*0.61＝8.51mmol。
2、中间体4的制备
名称
分子量
比例
投料量(g)
CTC-Asp(Oall)(Sub0.61mmol/g)
/
1.00
13.95
Fmoc-Gly-OH
297.3
3.00
7.59
HBTU
379.24
3.00
9.68
DIEA
129.24
3.00
3.30
Fmoc-Arg(Pbf)-OH
648.8
3.00
16.56
HBTU
379.24
3.00
9.68
DIEA
129.24
3.00
3.30
Fmoc-Lys(Boc)-OH
468.55
3.00
11.96
HBTU
379.24
3.00
9.68
DIEA
129.24
3.00
3.30
Fmoc-D-Phe-OH
387.4
3.00
9.89
HBTU
379.24
3.00
9.68
DIEA
129.24
3.00
3.30
称取CTC-Asp(Oall)13.95g 8.51mmol(W0克)(N0mmol)，将树脂加入到反应器中，加入DMF洗涤树脂后，将20％DBLK[20％哌啶/DMF(V/V)](用量3-4ml/克树脂)加入反应器中，反应10+10分钟，用DMF洗涤树脂。
以CTC-Asp(Oall)树脂摩尔量N0为基数，按一定投料比称量以下物料：Fmoc-Gly-OH7.59g(3.0倍量)；HBTU 9.68g(3.0倍量)；用适量DMF溶解。冰浴下加入DIEA 3.30g(3.0倍量)，活化反应3±1分钟后加入到反应器中。偶联反应2.0±0.1小时，用DMF洗涤4次。
检测反应：取少量反应液，滴3-5滴茚三酮溶液，加热至沸腾；以DMF洗涤树脂颗粒，观察是否显色，以确定反应是否完全。
重复上述操作将下列Fmoc-AA偶联到树脂上Fmoc-Arg(Pbf)、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-D-phe。
3、中间体3的制备
名称
分子量
比例
投料量(g)
CTC-Asp(Oall)(Sub0.61mmol/g)
/
1.00
13.95
四(三苯基膦)钯
1155.56
0.10
0.98
以CTC-Asp(Oall)树脂摩尔量N0为基数，将四(三苯基膦)钯0.98g(0.1倍量)用适量DMF溶解加入到反应器中，反应30±10分钟，用DMF洗涤树脂；将20％DBLK[20％哌啶/DMF(V/V)](用量3-4ml/克树脂)加入反应器中，反应10+10分钟，用DMF洗涤树脂。
4、中间体2的制备
以CTC-Asp(Oall)树脂摩尔量N0为基数，HBTU 9.68g(3.0倍量)用适量DMF溶解加入到反应器中，DIC 3.30g(3.0倍量)加入到反应器中。偶联反应2.0±0.1小时，用DMF洗涤4次。
检测反应：取少量反应液，滴3-5滴茚三酮溶液，加热至沸腾；以DMF洗涤树脂颗粒，观察是否显色，以确定反应是否完全。
树脂用甲醇收缩，氮气流室温鼓风干燥得中间体2 15.3g。
5、目标化合物：环[天冬氨酰-甘氨酰-精氨酰(Pbf)-赖氨酰(Boc)-D-苯丙氨酰]的制备
裂解液配置：按10ml/g的比例，配置裂解液：(DCM:冰乙酸:三氟乙醇＝5:1:1)
***/石油醚：根据100ml/g树脂的比例，其中***：石油醚＝1:1v/v
树脂称量：称取W(g)干燥的肽树脂，投入至裂解反应瓶中。在冰浴(0-5℃)条件下，缓慢加入配置的冰冻裂解液，充分搅拌0.5小时，撤去冰浴。室温(20-30℃)下充分搅拌树脂,反应1.5～2.0小时，反应完毕后收集滤液。搅拌下将滤液缓慢加入10倍体积的冰冻***/石油醚中，搅拌均匀，离心，收集沉淀。将所得环状RGD肽,真空干燥8.0小时以上，置于冰箱，冷藏保存。产品7.45g，产品收率91.6％，产品纯度为96.8％。
对比实施例1：CN106518966A
按CN106518966A中合成方法：一种RGD环肽的制备方法，具体步骤为：以氯树脂为起始树脂载体，通过固相合成法依次连接多肽序列中相对应的Fmoc-氨基酸，得到多肽-2-Cl树脂；将多肽-2-Cl树脂进行全保护切割反应，切割液进行旋蒸，冻干得到待环化全保护肽；将冻干的待环化全保护肽，进行液相环化，得到全保护环化肽；将全保护环化肽切除保护基，HPLC制备纯化，冻干得到RGD环肽。纯品收率为75.2％，HPLC检测纯度为95.3％。
对比实施例2：CN103588863B
按CN103588863B中合成方法：一种RGD环肽的制备方法，具体步骤为：以氯树脂为起始树脂载体，先接好第一个侧链羧基带特殊保护基的D天冬氨酸；把RGD序列肽的直线肽接好在树脂上；脱去D天冬氨酸的侧链羧基保护基，脱去末端氨基的Fmoc基团，加缩合剂直接在树脂上形成环肽；最后用切割液将环肽从树脂上切割下来。
实施例4：含量测定及比较
照高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录V D)测定，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(150mm×4.6mm×3μm，推荐使用SHISEIDO CAPCELL MG II色谱柱)，以0.02mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)-乙腈(90:10)为流动相A，0.02mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)-乙腈(30:70)为流动相B；按下表进行梯度洗脱，检测波长为290nm，柱温为35℃。精密量取供试品溶液20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
时间(分钟)
流动相A(％)
流动相B(％)
0
70
30
30
70
30
35
0
100
45
70
30
55
70
30
根据该环肽的特殊结构，本发明所述工艺将天冬氨酸侧链的羧基固定在树脂上，在偶联氨基酸结束后，分别脱去天冬氨酸主链羧基的保护基团(OMe或者Oall)和D-苯丙氨酸上的Fmoc基团，然后进行固相成环，成环结束，切割树脂即可得到纯度较高的环形RGD五肽，纯度较高，收率较高，另外从原料价格和反应条件方面考虑，使用Fmoc-天冬氨酸(OMe)路线为优选路线。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，依据本发明的技术实质，对以上实施例所作的任何简单的修改、等同替换与改进等，均仍属于本发明技术方案的保护范围之内。