一种负调控稻曲病菌产孢的致病因子、基因及应用

文档序号：1608736 发布日期：2020-01-10 浏览：35次 >En<

阅读说明：本技术 一种负调控稻曲病菌产孢的致病因子、基因及应用 (Pathogenic factor for negatively regulating and controlling ustilaginoidea virens spore production, gene and application ) 是由寇艳君熊萌时焕斌邱结华于 2019-09-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种负调控稻曲病菌产孢的致病因子、基因及应用。氨基酸序列如SEQ ID No.1所示,基因序列如SEQ ID No.2所示。本发明经研究发现源于稻曲病菌的真菌致病性基因稻曲病UvPSR1基因在真菌营养生长、孢子产量、侵染菌丝形成和致病过程中具有重要作用,该基因或其编码的蛋白质可以作为用于设计和筛选抗真菌药物的靶标。(The invention discloses a pathogenic factor for negatively regulating and controlling ustilaginoidea virens spore production, a gene and application. The amino acid sequence is shown as SEQ ID No.1, and the gene sequence is shown as SEQ ID No. 2. The invention discovers that UvPSR1 gene derived from ustilaginoidea virens and used as a fungal pathogenic gene plays an important role in the processes of fungal vegetative growth, spore yield, infected hypha formation and pathogenesis, and the gene or the protein coded by the gene can be used as a target for designing and screening antifungal medicaments.)

技术领域

本发明涉及水稻稻曲病防治技术领域，特别是涉及一种负调控稻曲病菌产孢的致病因子、基因及应用。

背景技术

稻曲病是近些年来发病面积逐渐增大的水稻病害，对水稻的产量和品质造成重要影响。该病害广泛分布于水稻主产区，在亚洲国家例如中国、日本、印度和菲律宾等国家发生较重。在我国受气候变化、肥料增施和品种单一等因素影响该病害呈现逐年加重，逐步扩大的趋势。该病害由子囊菌亚门麦角菌科绿核菌属(Ustilaginoidea virens)侵染造成，侵染未抽穗的水稻花器，后期在穗上形成墨绿色的稻曲球，稻曲病菌一方面影响水稻的产量，另一方面分泌真菌毒素稻曲毒素和黑粉菌素影响水稻品质。稻曲病菌包裹谷粒，其产生的稻曲毒素污染稻米，人畜食用被稻曲毒素污染的稻米后，稻曲毒素可强烈抑制人畜微管蛋白组装和细胞骨架形成，严重抑制人畜细胞正常发育，对人畜健康造成极大威胁。因此，为了保障粮食的生产安全，寻找有效防治稻曲病菌的药靶，研发高效防治药剂成为迫在眉睫的科研课题。

稻曲病菌的生活史中包括有性阶段和无性阶段，有性阶段能产生菌核，菌核萌发产生子座，继而形成子囊壳，子囊壳内分化形成的子囊孢子可以侵染水稻。无性阶段产生厚垣孢子，厚垣孢子萌发产生分生孢子在侵染中同样具有重要作用。病原菌从颖花侵入获取水稻细胞中营养用以菌丝生长和稻曲球形成。稻曲球前期由一层膜包裹，表面平滑，后期由淡黄色转为墨绿色，最后开裂释放墨绿色粉末。稻曲病发病早期无明显征状，经过10-15天的浅育期，可在稻穗上观察到稻曲球。稻曲病菌为活体营养型病原真菌，侵染花器后并不杀死寄主细胞，从活体中吸收养分。除侵染花外，还可以侵染胚芽鞘和幼苗部。揭示稻曲病菌的侵染生物学过程对于有效防治该病害具有重要意义。

稻曲病菌基因组大小约39.4Mb，大小与稻瘟病菌相似，预测包含8426个编码基因，相比稻瘟病菌基因密度偏低。基因组序列进化分析表明稻曲病菌与绿僵菌属的亲缘关系最近。基因组数据的注释为后期功能基因组学的发展奠定良好的基础。对稻曲病菌的基因组信息分析表明，该病菌在营养吸收、能量代谢及附着胞形成的蛋白数量较少，这在一定程度上解释了稻曲病只能从水稻花器侵染形成病害的遗传基础。

关于稻曲病菌致病的分子机制目前研究还不清楚。近期通过T-DNA随机***的正向遗传学方法和同源重组等敲除靶基因的反向遗传学的方法，明确了UvSpo76、Uvt-726、UvSUN2、UvT-B1464R、Uvt-1241 UvHOG1、UvPRO1、Uvt3277和UvSLT2基因的生物学功能，证明这些基因正向参与稻曲病菌孢子分化、营养菌丝生长和致病力，但鲜有报道负调控产孢的致病因子。

发明内容

本发明提供了一种负调控稻曲病菌产孢的致病因子、该致病因子的基因及应用。

一种负调控稻曲病菌产孢的致病因子，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明又公开了编码所述致病因子的基因。所述的基因，基因序列如SEQ ID No.2所示。

本发明又公开了所述致病因子或所述基因作为药物靶标在筛选抗稻曲病菌药物中的应用。

本发明还公开了一种抗稻曲病菌药物，活性成分为以下物质中的至少一种：

(1)能够抑制所述致病因子的抑制剂；

(2)能够降低所述基因表达水平的DNA或RNA序列；

(3)能够将所述基因敲除的序列。

所述的抗稻曲病菌药物，能够将所述基因敲除的序列为：将序列分别如SEQ IDNo.3和4所示的侧翼序列Uvpsr1-5’和Uvpsr1-3’分别***到载体质粒pFGL821中所得的重组质粒。所述的抗稻曲病菌药物，使用农杆菌转化法将所述质粒导入到稻曲病菌细胞内。

本发明还提供了所述抗稻曲病菌药物在抑制稻曲病菌中的应用。

本发明还提供了所述抗稻曲病菌药物在预防或治疗水稻稻曲病菌感染中的应用。

本发明经研究发现源于稻曲病菌的真菌致病性基因稻曲病UvPSR1基因在真菌营养生长、孢子产量、侵染菌丝形成和致病过程中具有重要作用，该基因或其编码的蛋白质可以作为用于设计和筛选抗真菌药物的靶标。

附图说明

图1为稻曲病UvPSR1基因敲除策略示意图。

图2为使用QRT-PCR检测UvPSR1基因的表达量结果图。

图3为UvPSR1基因参与调控菌丝生长检测结果图，其中A为菌落图，B为菌落直径统计结果。

图4为UvPSR1基因负调控稻曲病菌的产孢检测结果，其中A为产孢量显微照片，B为产孢量统计结果。

图5为UvPSR1基因参与氧化逆境响应检测结果图，其中A为培养后菌落的图，B为通过菌落直径计算抑制率。

图6为UvPSR1基因参与稻曲病菌毒素合成检测结果图，其中A为晚籼98种子的照片，B为晚籼98种子根长统计结果。

图7为UvPSR1基因敲除对稻曲致病性检测结果图，其中A为稻穗上稻曲球照片，B为稻曲球数量统计结果。

具体实施方式

实施例1

稻曲病UvPSR1基因的鉴定和敲除。

稻曲病UvPSR1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，稻曲病UvPSR1基因的基因序列(CDS序列)如SEQ ID No.2所示。通过同源重组的策略构建了稻曲病UvPSR1基因敲除载体。敲除策略示意如图1所示。

敲除载体构建按照下面的方法进行：

UvPSR1基因长度为3556bp(序列如SEQ ID No.3所示，包含CDS序列和一些非编码区序列)，利用同源重组的方法将其替换为潮霉素B基因，从而得到UvPSR1敲除突变体。具体步骤如下：

以稻曲病菌野生菌株HWD(来自华中农业大学黄俊斌实验室)的基因组为模板，PCR扩增UvPSR1基因的上游1069bp(基因片段命名为UvPSR1-5’)和下游979bp(基因片段命名为UvPSR1-3’)的侧翼序列，设计引物UvPSR1-5F/5R，UvPSR1-3F/3R，引物序列如下：

UvPSR1-5F：5’-CGGAATTCCCCAGAGTTGTAGTCGGCTG-3’；

UvPSR1-5R：5’-CGGGATCCCCTTTGGAAGTCCCCACCTC-3’，

UvPSR1-3F：5’-AAAACTGCAGTGCCAAAATTACCCGACGGT-3’；

UvPSR1-3R：5’-AAAACTGCAGGGTACGGTGCACACGAAGTA-3’。

以这两对引物用KOD酶进行PCR扩增，分别得到两段基因侧翼序列UvPSR1-5’和UvPSR1-3’。反应体系为

反应条件为：

98℃预变性30s；

98℃变性7s，63℃退火20s，72℃延伸，延伸时间根据扩增片段大小确定(30s/kb)，共34个循环，每个循环退火温度下降0.2℃；

72℃延伸2min。

将上述所得到的敲除基因的侧翼序列UvPSR1-5’用T4连接酶连接到线性化的载体pFGL821载体(addgene ID：58223)中的XhoI和BamHI之间，UvPSR1-3’***PstI位点(单限制性内切酶连接，测序挑选正向连接的克隆)。利用农杆菌介导的转化方法转化稻曲病菌野生菌株HWD，在含有潮霉素(250μg/ml)的YT固体培养基(10g/L葡萄糖，1g/L蛋白胨，1g/L酵母提取物，15g/L琼脂粉)平板上进行转化子筛选。根据同源重组原理获得UvPSR1假定敲除突变体转化子。

实施例2

稻曲病菌UvPSR1基因敲除突变体的鉴定。

1、基因组DNA水平鉴定

提取转化子基因组，使用验证引物Uvpsr1-3tR(5’-CGGGCTCACTCCTGATTCTT-3’)，和p821-5F(GTGGTGTAAACAAATTGACGCTTAG)扩增重组后片段，检测体系为：

反应条件为：

95℃预变性30s；

95℃变性7s，63℃退火20s，72℃延伸，延伸时间根据扩增片段大小确定(30s/kb)，共34个循环，每个循环退火温度下降0.2℃；

72℃延伸2min。

扩增结果为阳性则为敲除突变体。共鉴定获得7株突变体菌株，敲除突变体分别命名为ΔUvpsr1-1、2、3、7、8、9、13，由于敲除突变体转化子间表型一致，后续分析选择ΔUvpsr1-1和ΔUvpsr1-9。

2、QRT-PCR检测UvPSR1基因的表达

在Uvpsr1基因的CDS区设计实时定量引物UvPSR1RT-F/R及内参β-tubulin的引物β-tubulinRTF/R。

UvPSR1RT-F：5’-CGTTGAGATCGAGGGCCATT-3’；

UvPSR1RT-R：5’-CCGGAAGAGACGGTGATGTA-3’。

β-tubulinRTF：5’-GGCGTTTACAATGGCACTTC-3’；

β-tubulinRTR：5’-CGGAACAGTTGACCAAAAGG-3’。

提取野生型菌株、缺失突变体菌株ΔUvpsr1-1、ΔUvpsr1-9的总RNA并反转录进行实时定量检测。结果如图2所示，UvPSR1在野生型菌株中检测到表达，但敲除突变体中没有表达，进一步证明该基因被敲除。

实施例3

UvPSR1缺失突变体互补载体及互补菌株的获得。

为了验证突变体的表型是由UvPSR1缺失造成的，我们构建了互补载体UvPSR1-C，以野生型HWD基因组为模板，用引物UvPSR1-F/R，扩增出UvPSR1基因的全长，利用T4连接酶连接到内切酶EcoR1和Xba1线性化的pFGL820(addgene ID：58221)载体上。

UvPSR1-F：5’-CGGAATTCCGTCGGAGGCAACATTCAAG-3’；

UvPSR1-R：5’-GCTCTAGATCCTCGCAAATCCCCACTCT-3’。

将构建完成的互补载体转化至敲除突变体ΔUvpsr1-1菌株中，命名为Uvpsr1-C。QRT-PCR检测表明UvPSR1基因在互补突变体中正常表达。

实施例4

UvPSR1敲除对稻曲病菌生长的影响。

将野生型菌株，突变体和互补菌株分别接种于PSA培养基上，28℃避光培养15天，观察菌落形态并测菌落直径。结果如图3所示，与野生型和互补突变体菌株相比，敲除突变体生长缓慢，菌落直径明显小于互补和野生型，表明UvPSR1调控稻曲病菌菌丝的生长。

实施例5

UvPSR1敲除突变体的产孢量检测。

将野生型菌株，突变体和互补菌株分别接种于PSA培养基上，28℃避光培养15天，分别打18个相同大小的菌饼(直径5mm)，每六个菌饼放入一个瓶中(100mL锥形瓶分装50mLPS培养基)，28℃摇床内培养七天，在显微镜下观察培养基中分生孢子的产生情况。实验重复三次。

结果如图4所示：野生型的产孢量为3±0.53×10⁶，ΔUvpsr1-1的产孢量为11.7±0.25×10⁶，ΔUvpsr1-9的产孢量为12±0.5×10⁶，Uvpsr1-C的统计结果为4±0.3×10⁶，敲除突变体的产孢量是互补和野生型菌株的3-4倍。

实施例6

UvPSR1敲除突变体对过氧化物的敏感性试验。

在PSA固体培养基平板上培养敲除突变体ΔUvpsr1-1、ΔUvpsr1-9、互补菌株Uvpsr1-C、野生型菌株HWD，将其放在PSA固体培养基平板上培养15天，然后分别用0.3mm的打孔器切取相同大小菌饼，接种到用含H₂O₂(浓度0.03％v/v)的PSA培养基(200g/L马铃薯，20g/L蔗糖，20g/L琼脂粉)和PSA固体培养基平板上，28℃避光培养15天后菌落拍照并测量直径。

直径生长抑制率(％)＝(PSA培养的菌落直径-含不同化学物质PSA培养的菌落直径)/PSA培养的菌落直径×100％。

结果如图5所示：敲除突变体、互补、野生型菌株与单纯的PSA培养基上相比，互补菌株和野生型菌株的菌落直径有明显的变小，所以，敲除基因UvPSR1后菌株对过氧化物的敏感性会升高。

实施例7

UvPSR1的敲除导致菌株的毒素合成减少。

用直径为0.3mm的打孔器分别在敲除突变体ΔUvpsr1-1、ΔUvpsr1-9、互补菌株Uvpsr1-C、野生型菌株HWD菌落上打一个菌饼，然后将6个菌饼放到100ml的锥形瓶中，加入50ml PS培养基(200g/L马铃薯，20g/L蔗糖)，170rpm，28℃摇床培养七天，过滤收集孢子液。每个瓶中放入50粒晚籼98种子，28℃培养箱静置培养7天，然后观察种子的根长拍照并测量。

结果如图6所示：突变体孢子液处理的种子根长较互补菌株和野生型菌株处理的要长，表明UvPSR1缺失突变体的毒力比互补和野生型低。

实施例8

UvPSR1敲除突变体对稻曲致病性对比试验。

用0.3mm的打孔器分别在敲除突变体ΔUvpsr1-1、ΔUvpsr1-9、互补菌株Uvpsr1-C、野生型菌株HWD菌落上打一个菌饼，将其放在PSA固体平板上培养15天，然后打6个菌饼放到100ml的锥形瓶中，加入50ml PS液体培养基，170rpm，28℃摇床培养七天，收集菌丝和孢子的混合液并注射进孕穗前七天的水稻穗中(晚籼98)，看到穗部有明显的鼓起为止，22℃遮光生长处理两天，然后32℃以下温度，保持高湿度，直达其发病为止。

结果如图7所示：在接种20天后，接种互补菌株和野生型菌株的水稻穗会发病，长出稻曲球，UvPSR1敲除突变体接种的稻穗上没有观察到稻曲球，完全丧失致病性。

序列表

<110> 中国水稻研究所

<120> 一种负调控稻曲病菌产孢的致病因子、基因及应用

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 587

<212> PRT

<213> 稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)

<400> 1

Met Gly Asn Asp Gly Asn Glu Leu Ser Pro Asp Glu Val Gly Thr Ser

1 5 10 15

Lys Gly Gly Arg Gly Leu Leu Lys Val Pro Ser Arg Ser Ser Ser Gln

20 25 30

Gln Arg Asn Gln Ala Ser Thr Ala Ser Thr Gly Leu Ser Gly Ala Thr

35 40 45

Val Thr Asp Pro Arg Thr Ser Ile Asp Ala Arg Ser Lys Glu Ser Arg

50 55 60

Gly Ser Val Ser Gly Arg Gln Arg Asn Gly Ser Ala Ser Thr His Arg

65 70 75 80

Thr Gly Ala Asp Ser Glu Arg Gly His Thr Leu Gly Asn Ser Gln Pro

85 90 95

Ser Ser Pro Ser Thr Ser Glu Gln Lys Arg Lys Arg Lys Lys Thr Gly

100 105 110

Gly Leu Leu Ser Leu Leu Gly Cys Cys Gly Val Pro Asp Ser Ala Asn

115 120 125

Thr Leu Glu Glu Gly Glu Ser Glu Asn Ile His Lys Val Glu Lys Leu

130 135 140

Pro Gln Arg Pro Ala Asn Ala Lys Thr Arg Pro Gln Asn Pro Gln Glu

145 150 155 160

Gln Gln Ile Val Ile Lys Thr Leu Asn Glu Lys Glu Pro Thr Gln Asp

165 170 175

Thr Ser Thr Pro Gly His Thr Glu Asn Gln Ala Ser Ser Ser Thr Gln

180 185 190

Asp Pro Ser Ser Asn Val Glu Gly Ala Gln Pro Glu Thr Lys Glu Ser

195 200 205

Ala Asn Pro Ala Ile Ala Val Asp Ala Pro Ser Gln His Ala Glu Asn

210 215 220

Asp Ala Glu Thr Gly Asp Gln Thr Ala Val Ala Asp Asn Gly Asn Thr

225 230 235 240

Asp Met Pro Asp Ala Gly Gln Asp Glu Val Pro Glu Ala Leu Val Thr

245 250 255

Gly Gly Ser Asp Asp Thr Gln Phe Leu Thr Ile Pro Pro Pro Pro Ile

260 265 270

Leu Pro Pro Pro Pro Gly Pro Gly Ser Ala Leu Ala Pro Pro Ser Thr

275 280 285

Leu Met Glu Ser Gly Pro Ala Ala Pro Glu Gln Gln Ala Trp Leu Leu

290 295 300

Pro Ser Ile Ala Pro Glu His Lys Gly Arg Lys Cys Leu Val Leu Asp

305 310 315 320

Leu Asp Glu Thr Leu Val His Ser Ser Phe Lys Ile Leu His Gln Ala

325 330 335

Asp Phe Thr Ile Pro Val Glu Ile Glu Gly His Tyr His Asn Val Tyr

340 345 350

Val Ile Lys Arg Pro Gly Val Asp Glu Phe Met Lys Arg Val Gly Glu

355 360 365

Leu Tyr Glu Val Val Val Phe Thr Ala Ser Val Ser Lys Tyr Gly Asp

370 375 380

Pro Leu Leu Asp Gln Leu Asp Ile His Lys Val Val His His Arg Leu

385 390 395 400

Phe Arg Glu Ser Cys Tyr Asn His Gln Gly Asn Tyr Val Lys Asp Leu

405 410 415

Ser Gln Ile Gly Arg Glu Leu Lys Asp Thr Ile Ile Ile Asp Asn Ser

420 425 430

Pro Thr Ser Tyr Ile Phe His Pro Gln His Ala Val Pro Ile Ser Ser

435 440 445

Trp Phe Ser Asp Ala His Asp Asn Glu Leu Leu Asp Leu Ile Pro Val

450 455 460

Leu Glu Asp Leu Ala Gly Pro Asn Val Ala Asp Ser Ser Pro Arg Ala

465 470 475 480

Ala Ser Pro Val Ser Ala Ser Gly Ala Ser Thr Gly Ala Ser Ile Asn

485 490 495

Arg Pro Ser Ser Pro Thr Pro Pro Gly Gly Pro Arg Thr Ala Ile Arg

500 505 510

Arg Arg Ala Ala Ala Asp Gln Lys Glu Lys Ile Ala Asn Ala Arg Pro

515 520 525

Ala Ser Thr Arg Ser Ala Gly Ala Gly Gly Ser Ser Ser Thr Met Leu

530 535 540

Arg Leu Tyr Thr Asp Glu Ser Pro Gly Leu Lys Val Asp Pro Val Ile

545 550 555 560

Val Leu Val Leu Ser Leu Val Phe Ile Phe Ser Val Val Ala Leu His

565 570 575

Val Ile Ala Lys Ile Thr Arg Arg Phe Ser Ser

580 585

<210> 2

<211> 1764

<212> DNA

<213> 稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)

<400> 2

atgggaaatg acggtaatga gctgtcaccc gatgaggtgg ggacttccaa aggtgggcgt 60

ggtctcttga aagtaccatc aagatcctcg tcacaacaaa ggaatcaggc gtcgaccgca 120

tctaccggct tgagtggagc tacggtgacg gatccgagaa ccagtatcga tgcacgatcg 180

aaagaatccc gaggtagtgt ctctggtcgg cagcgaaatg gtagcgcctc gacgcaccga 240

actggcgcag acagtgaacg tgggcatacc ctcggcaact cacaacccag ctcaccatcg 300

acaagcgaac aaaagcgaaa acggaagaag actggtggtt tgctgtcgtt gctcgggtgt 360

tgcggcgtcc ccgacagcgc aaacactttg gaagaaggcg aaagtgaaaa cattcacaaa 420

gtcgagaagc ttcctcaacg tcccgccaac gccaaaactc gaccgcaaaa tcctcaagag 480

caacaaattg taataaaaac actcaacgag aaagagccaa cccaagatac ttctactcca 540

ggtcacacag aaaatcaagc atcaagcagt acgcaagatc cgtcttcaaa tgttgaagga 600

gcacagcctg agacgaagga atccgccaac ccagctattg cggttgatgc tccgtcccaa 660

catgctgaga acgatgctga gacaggagac cagaccgcgg tcgcagacaa tgggaataca 720

gacatgccag acgccgggca ggacgaagtt ccagaggccc tagttaccgg tggctcggat 780

gatacgcagt tcctcacgat accgccgcct ccaatactac caccaccacc tgggcctggg 840

tccgcacttg cgcctccctc gactttgatg gagagcggac cagcagcacc tgagcagcaa 900

gcctggcttc ttccttccat tgcgccagag cacaaaggcc ggaagtgttt ggttttggac 960

ttggatgaga ctcttgtcca tagttcgttt aaaatacttc accaggcaga tttcacaatc 1020

cccgttgaga tcgagggcca ttatcacaat gtctatgtca taaagcgccc cggtgtagat 1080

gagttcatga aaagagttgg ggagctttat gaagttgtgg tcttcaccgc gtccgtctcc 1140

aagtacggcg acccgttgct ggatcagcta gatattcata aagtggtaca tcaccgtctc 1200

ttccgggaga gctgctacaa ccaccaaggg aactatgtca aggatctatc gcaaattggc 1260

cgggagctga aagataccat cattatagac aactcgccaa cttcgtacat attccacccc 1320

caacatgcgg ttccaattag cagctggttc tcggatgccc acgacaacga attactagac 1380

cttatccctg ttcttgagga cttggccggc cccaatgtag ccgattcttc ccctcgtgcc 1440

gcttcaccag ttagcgcctc tggtgccagt actggcgcca gcatcaaccg accatcatct 1500

cctactcctc ccggtggtcc ccgaactgcc atcagacgtc gcgctgctgc cgaccagaag 1560

gaaaagattg ccaatgctcg acctgcaagc acacggtccg ctggtgctgg cggctccagc 1620

agcaccatgc tgagactgta taccgatgaa tctccaggct tgaaagtcga tccagttatt 1680

gtcctcgtct tgtctctcgt gttcattttc agtgttgttg cactacatgt aattgccaaa 1740

attacccgac ggttctctag ctaa 1764

<210> 3

<211> 3556

<212> DNA

<213> 稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)

<400> 3