具体实施方式

：

以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。

（一）供试菌株及植物：

稻瘟病菌菌种为稻瘟病菌野生型菌株Guy11（Magnaporthe oryzae ），供试水稻为水稻易感稻瘟品种Co-39。

（二）有关培养基及溶液的配制：

（1）完全培养基（CMⅡ）：20×硝酸盐（50 mL/L），1000×微量元素（1 mL/L），1000×维生素溶液（1 mL/L），葡萄糖（10 g/L），蛋白胨（2 g/L），酸水解酪蛋白（1 g/L），酵母提取物（1 g/L ），固体培养基加入琼脂粉（20 g/L）；

1000×维生素溶液(100ml)：Biotin 0.01g，Pyridoxin 0.01g，Thiamine 0.01g，Riboflavin0.01g，PABA (p-aminobenzonic acid) 0.01g，Nicotinic acid 0.01g；

1000×微量元素(100ml)：ZnSO₄. 7H₂O 2.2g，H₃BO₃ 1.1g，MnCl₂. 4H₂O 0.5g，FeSO₄. 7H₂O 0.5g，CoCl₂. 6H₂O 0.17g，CuSO₄. 5H₂O 0.16g，Na₂MoO₄. 5H₂O 0.15g ，Na₄EDTA 5g；

（2）原生质体再生培养基（TB3）：酵母提取物（3 g/L），酸水解酪蛋白（3 g/L ），蔗糖（200 g/L），固体培养基加入琼脂粉（12 g/L）；

（3）稻杆培养基（SDC）：玉米粉（25 g/L），干稻草（150 g/L），琼脂粉（20 g/L）。用于诱导稻瘟病菌产孢。

（4）燕麦培养基（OMA）：燕麦（50 g/L），配置固体培养基加入琼脂粉（20 g/L）；

实施例1 基因的筛选

通过NCBI数据库搜索得到酵母中SPC2的蛋白序列，并以此为对象在NCBI官网通过blastp工具进行比对，得到在稻瘟病菌中与之相似的蛋白（MGG_10832），并将其命名为MoSpc2。稻瘟病菌的致病性蛋白MoSpc2，其氨基酸序列如SEQ ID No:3所示。编码该蛋白的基因为稻瘟病菌MoSpc2基因，其基因全长序列如SEQ ID No:1所示；其cDNA序列如SEQ IDNo:2所示。

实施例2 基因敲除

（1）以稻瘟病菌野生型Guy11基因组为模板，选取MoSpc2基因上游1000bp片段以MoSpc2-F1（正向）、MoSpc2-F2（反向）引物扩增得到MoSpc2上臂片段，选取MoSpc2基因下游1000bp片段以MoSpc2-F3（正向）、MoSpc2-F4（反向）扩增得到MoSpc2下臂片段(图1)。之后将上臂、潮霉素磷酸转移酶基因HPH（SEQ ID No:4）和下臂片段进行融合，将融合产物以MoSpc2-nest F和MoSpc2-nest R进行大量扩增得到大量DNA融合产物。将融合产物进行原生质体转化以取代稻瘟病菌SPC2基因。

（2） 原生质体转化过程：

①加入10 μL的上述DNA融合产物于分装好的野生型稻瘟病菌原生质体中，轻轻混匀，静置20-25 min（使原生质体与DNA充分接触）；

②加入1 mL PTC，轻轻混匀，静置20-25 min；

③加入适量的TB3液体培养基，轻轻混匀，用封口膜将管口封号，于28℃培养箱中黑暗复苏12-16 h。

④在熔解好的TB₃固体培养基中加入所需浓度的潮霉素（600μL/200ml），倒入复苏的离心管中。混匀后，倒入无菌的15 cm培养皿中，待培养基冷却凝固后，再倒入已加入对应浓度潮霉素（1200μL/200ml）的TB3培养基，使其覆盖表面，冷却凝固后，用封口膜将培养皿封口，倒置于8℃光照培养箱中培养6-10 d；

⑤待培养皿中长出转化子，小心挑取上层培养基中的单菌落接种于CMII固体培养基平板中，后续进一步对转化子进行验证；

（3） 利用MoSpc2基因内部引物MoSpc2-ko-F 和MoSpc2-ko-R进行PCR敲除验证，以阴性无条带，阳性有条带为对照选取无条带转化子进行下一步验证。利用MoSpc2-F1和潮霉素磷酸转移酶基因HPH内部引物HYG R进行潮霉素转入验证，以阴性无条带为对照，选取有条带的转化子进行southern blot的验证。

（4） Southern杂交鉴定：选取MoSpc2基因下游编码区序列设计探针（SEQ ID No:5），选取探针内没有识别位点的限制性核酸内切酶NruI分别对候选转化子与野生型菌株Guy11的基因组DNA进行酶切（图2）。在杂交验证图中，野生型泳道中出现预设的大小的条带2.07 kb，而突变体泳道中出现2.60 kb大小的条带（图2），与预测相符，说明转化子中的MoSpc2基因已成功被HPH基因替换，且为单拷贝插入。鉴定获得稻瘟病菌突变体∆MoSpc2。

（5）所用引物序列：

SEQ ID NO. 6：MoSpc2-F1：TGGCCATGTTGTTCTTCATC；

SEQ ID NO. 7：MoSpc2-F2：

CATTCATTGTTGACCTCCACTAGCTCCATGTGTACAAGAAAGTTGGTT；

SEQ ID NO. 8：MoSpc2-F3：GCAAAGGAATAGAGTAGATGCCGACCGAAATATCAAATTTCAAGTTA；

SEQ ID NO.9：MoSpc2-F4：AATAGAGCAATACGCAAGAG；

SEQ ID NO. 10：MoSpc2-nest F：ACAGCACATGGTAGTTGCTG；

SEQ ID NO. 11：MoSpc2-nest R：AGCAGCGCTCGGTGAGCATG；

SEQ ID NO. 12：MoSpc2-ko-F：GCAGCTGGTGAGCACATACT；

SEQ ID NO. 13：MoSpc-ko-R：TGTCTGCACCTGTAGCTGAT；

SEQ ID NO. 14：HYG R：CGGTGGTGCAGATGAACTTC。

（6）实验所用PCR反应体系：

扩增PCR反应体系（50μL）：模板 0.5μL，2x reaction mix 25μL，上游引物 2μL，下游引物2μL，ddH₂O 25μL。PCR反应程序为：94℃ 5min，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1kb/min，30个循环，72℃ 10min，16℃ 10min。

融合PCR反应体系（25μL）：模板上游片段、潮霉素片段和下游片段摩尔比1：3：1加入，10x PCR buffer 2.5μL，dNTP Mixture 0.5μL，LTaq酶 0.25μL，ddH₂0 21.75μL。PCR反应程序为：94℃ 3min，94℃ 35s，58℃ 5min，72℃ 5min，10个循环，16℃ 10min。

实施例3：MoSpc2基因的缺失影响稻瘟病菌的营养生长

将野生型Guy11、突变体∆MoSpc2分别接种在CMⅡ、SDC和OMA三种不同的培养基平板中，于28℃下黑暗培养7 d，培养结束后量取菌落生长直径并拍照保存。实验结果显示，在三种培养基中，突变体的菌落生长直径都小于野生型（图3），尤其是在SDC培养基中出现显著性降低的情况，说明MoSpc2基因的缺失会影响稻瘟病菌的营养生长。

实施例4： MoSpc2基因的缺失影响稻瘟病菌对外界环境胁迫应答

将野生型菌株Guy11、突变体∆MoSpc2分别接种在含有0.5 mM Diamide（二酰胺，造成氧化压力）、2 mM DTT（二硫苏糖醇，对内质网造成压力）以及400 μg/mL CFW（细胞壁抑制剂钙荧光白，对细胞壁造成压力）的CM Ⅱ培养基中28℃黑暗培养7 d。实验结果显示突变体在含有Diamide和DTT的CM Ⅱ平板上生长显著减慢，在含有CFW的CM Ⅱ平板上生长显著变快（图4）。上述结果表明，MoSpc2基因的缺失影响稻瘟病菌对外界环境胁迫应答。

实施例5：MoSpc2基因参与调控稻瘟病菌的无性繁殖过程

将野生型Guy11、突变体∆MoSpc2接种于SDC培养基平板中央，于28℃下黑暗培养5d后，将培养基表面的气生菌丝刮去，放置于28℃温室中并在黑光灯调控下诱导3 d产孢，定量统计相应菌株在SDC培养基中分生孢子的产量。实验结果显示，突变体∆MoSpc2产生的部分孢子形态异常，利用CFW对不同菌株的分生孢子进行染色，进一步观察其形态（图5）：从显微镜观察中发现野生型菌株的分生孢子基本为三细胞两隔膜，而突变体存在三种孢子形态：没有隔膜，一个隔膜和两个隔膜，其中单个隔膜的孢子比例为64.6%，且分生孢子的大小相对野生型也缩小了。另一方面，与野生型Guy11相比，突变体∆MoSpc2的产孢量也显著下降（图6）。上述结果说明MoSpc2基因对稻瘟病菌的无性繁殖过程至关重要。

实施例6： MoSpc2基因参与调控稻瘟病菌的致病过程

收集野生型Guy11、突变体∆MoSpc2的分生孢子悬浮液（1×10⁵个/mL），分别接种于三周龄的水稻叶片上进行水稻喷雾实验，于6 d后观察叶片病斑。结果显示，在水稻叶片上，野生型Guy11能产生典型的稻瘟病病斑，而突变体∆MoSpc2未产生病斑（图7）。综上结果表明，MoSpc2基因的缺失使稻瘟病菌致病性显著下降，说明MoSpc2基因在稻瘟病菌致病过程中具有重要作用。

实施例7： MoSpc2基因的缺失延缓了附着胞的成熟

分别收集了野生型Guy11、突变体∆MoSpc2菌株的分生孢子，在疏水性条件下诱导其附着胞的萌发。通过显微镜分别观察不同菌株在4 h、8 h和16 h时附着胞的萌发与形成。实验发现（图8），野生型Guy11菌株的分生孢子在4 h时已经基本萌发，而突变体∆MoSpc2的分生孢子萌发出现迟缓的情况，在16 h时其萌发率也只有82%。根据统计结果显示，突变体∆MoSpc2分生孢子的附着胞形成率与萌发率的结果相似，野生型的分生孢子在8 h时已经基本形成附着胞，但突变体在16 h时附着胞形成率只有61%。上述结果表明MoSpc2基因的缺失延缓了附着胞的发育。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建农林大学

<120> 稻瘟病菌MoSpc2基因及其应用

<130> 14

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1142

<212> DNA

<213> SEQ ID No.1

<400> 1

gcttactcca atccgaccac gtgttcgagg tttcgacagc aaaccaaagg acaaaaccat 60

cttccactcg cgacatccaa aattataaca tcaacaaccc aaaacaaaaa ccaactttct 120

tgtacacaat ggcggctcaa gagaagatat cggtctataa tgcagctggt gagcacatac 180

tgccttgttt cctttacaat tacttcatct tcgacttggc aagttcgtcc tccttgtttg 240

cctatgctga ctgccaacgt acgtacgcac tttcaagacc tcaagaacac atccgatgat 300

gccataccca attacctcaa ctcgctcaag ttcaagcagt cacacacgct cacggatgtg 360

cgcctgacgc ttggctattc ggcctttgcc atatcggccg cctgtttctt ctgggactac 420

aagttgggat ttgacagcac caagtactac acggccgccg ccgtcgctct atatgccatc 480

ttgaatggcg ctctcaccct ctggtctttc tttgtcgaga agaacatcgt ctacgttggc 540

acagcgccaa gcggagaaaa ggttcgttcc ttggtctcga gcatatcacc aacctggatt 600

tgtacaaagc gtcgtggcca ctactaacac gccagctgtc actcagatca ccatagcgtc 660

tagcgtcaac aagtacgacc ctacctacag gcttgccatc acaacagtcc ccaagggcgc 720

ttccaagggc cagagcatcg aggtctctcg cccttttgcc gagtggtttg actcagttgg 780

tcacttcatc gctgcacctt tccagacgat gctggctact tcagtgccgg cgatagccaa 840

ggtggattcc aaaaggcttg ccaacatccc cgccgctcag gcagagacct cggcacccaa 900

ggaagatggt tacagtgccg agatgttgga cgctattttg tcctcgtccg gatcagctac 960

aggtgcagac accaccggct cagtatcagc caagaagggt ggaaagcgcc gcaaggcttg 1020

aaaatatcaa atttcaagtt aaactaggga gactcggtag catggaattt tgtacactag 1080

actggtgttt tcatcacgta ggccgggatt ggttccagaa ttgggtgatc tattgaagtt 1140

tt 1142

<210> 2

<211> 699

<212> DNA

<213> SEQ ID No.2

<400> 2

atggcggctc aagagaagat atcggtctat aatgcagctg acctcaagaa cacatccgat 60

gatgccatac ccaattacct caactcgctc aagttcaagc agtcacacac gctcacggat 120

gtgcgcctga cgcttggcta ttcggccttt gccatatcgg ccgcctgttt cttctgggac 180

tacaagttgg gatttgacag caccaagtac tacacggccg ccgccgtcgc tctatatgcc 240

atcttgaatg gcgctctcac cctctggtct ttctttgtcg agaagaacat cgtctacgtt 300

ggcacagcgc caagcggaga aaagatcacc atagcgtcta gcgtcaacaa gtacgaccct 360

acctacaggc ttgccatcac aacagtcccc aagggcgctt ccaagggcca gagcatcgag 420

gtctctcgcc cttttgccga gtggtttgac tcagttggtc acttcatcgc tgcacctttc 480

cagacgatgc tggctacttc agtgccggcg atagccaagg tggattccaa aaggcttgcc 540

aacatccccg ccgctcaggc agagacctcg gcacccaagg aagatggtta cagtgccgag 600

atgttggacg ctattttgtc ctcgtccgga tcagctacag gtgcagacac caccggctca 660

gtatcagcca agaagggtgg aaagcgccgc aaggcttga 699

<210> 3

<211> 232

<212> PRT

<213> SEQ ID No.3

<400> 3

Met Ala Ala Gln Glu Lys Ile Ser Val Tyr Asn Ala Ala Asp Leu Lys

1 5 10 15

Asn Thr Ser Asp Asp Ala Ile Pro Asn Tyr Leu Asn Ser Leu Lys Phe

20 25 30

Lys Gln Ser His Thr Leu Thr Asp Val Arg Leu Thr Leu Gly Tyr Ser

35 40 45

Ala Phe Ala Ile Ser Ala Ala Cys Phe Phe Trp Asp Tyr Lys Leu Gly

50 55 60

Phe Asp Ser Thr Lys Tyr Tyr Thr Ala Ala Ala Val Ala Leu Tyr Ala

65 70 75 80

Ile Leu Asn Gly Ala Leu Thr Leu Trp Ser Phe Phe Val Glu Lys Asn

85 90 95

Ile Val Tyr Val Gly Thr Ala Pro Ser Gly Glu Lys Ile Thr Ile Ala

100 105 110

Ser Ser Val Asn Lys Tyr Asp Pro Thr Tyr Arg Leu Ala Ile Thr Thr

115 120 125

Val Pro Lys Gly Ala Ser Lys Gly Gln Ser Ile Glu Val Ser Arg Pro

130 135 140

Phe Ala Glu Trp Phe Asp Ser Val Gly His Phe Ile Ala Ala Pro Phe

145 150 155 160

Gln Thr Met Leu Ala Thr Ser Val Pro Ala Ile Ala Lys Val Asp Ser

165 170 175

Lys Arg Leu Ala Asn Ile Pro Ala Ala Gln Ala Glu Thr Ser Ala Pro

180 185 190

Lys Glu Asp Gly Tyr Ser Ala Glu Met Leu Asp Ala Ile Leu Ser Ser

195 200 205

Ser Gly Ser Ala Thr Gly Ala Asp Thr Thr Gly Ser Val Ser Ala Lys

210 215 220

Lys Gly Gly Lys Arg Arg Lys Ala

225 230

<210> 4

<211> 1368

<212> DNA

<213> SEQ ID No.4

<400> 4

tggagctagt ggaggtcaac aatgaatgcc tattttggtt tagtcgtcca ggcggtgagc 60

acaaaatttg tgtcgtttga caagatggtt catttaggca actggtcaga tcagccccac 120

ttgtagcagt agcggcggcg ctcgaagtgt gactcttatt agcagacagg aacgaggaca 180

ttattatcat ctgctgcttg gtgcacgata acttggtgcg tttgtcaagc aaggtaagtg 240

gacgacccgg tcataccttc ttaagttcgc ccttcctccc tttatttcag attcaatctg 300

acttacctat tctacccaag catccaaatg aaaaagcctg aactcaccgc gacgtctgtc 360

gagaagtttc tgatcgaaaa gttcgacagc gtctccgacc tgatgcagct ctcggagggc 420

gaagaatctc gtgctttcag cttcgatgta ggagggcgtg gatatgtcct gcgggtaaat 480

agctgcgccg atggtttcta caaagatcgt tatgtttatc ggcactttgc atcggccgcg 540

ctcccgattc cggaagtgct tgacattggg gagttcagcg agagcctgac ctattgcatc 600

tcccgccgtg cacagggtgt cacgttgcaa gacctgcctg aaaccgaact gcccgctgtt 660

ctccagccgg tcgcggaggc catggatgcg atcgctgcgg ccgatcttag ccagacgagc 720

gggttcggcc cattcggacc gcaaggaatc ggtcaataca ctacatggcg tgatttcata 780

tgcgcgattg ctgatcccca tgtgtatcac tggcaaactg tgatggacga caccgtcagt 840

gcgtccgtcg cgcaggctct cgatgagctg atgctttggg ccgaggactg ccccgaagtc 900

cggcacctcg tgcatgcgga tttcggctcc aacaatgtcc tgacggacaa tggccgcata 960

acagcggtca ttgactggag cgaggcgatg ttcggggatt cccaatacga ggtcgccaac 1020

atcctcttct ggaggccgtg gttggcttgt atggagcagc agacgcgcta cttcgagcgg 1080

aggcatccgg agcttgcagg atcgccgcgc ctccgggcgt atatgctccg cattggtctt 1140

gaccaactct atcagagctt ggttgacggc aatttcgatg atgcagcttg ggcgcagggt 1200

cgatgcgacg caatcgtccg atccggagcc gggactgtcg ggcgtacaca aatcgcccgc 1260

agaagcgcgg ccgtctggac cgatggctgt gtagaagtac tcgccgatag tggaaaccga 1320

cgccccagca ctcgtccgag ggcaaaggaa tagagtagat gccgaccg 1368

<210> 5

<211> 964

<212> DNA

<213> SEQ ID No.5

<400> 5

aaatatcaaa tttcaagtta aactagggag actcggtagc atggaatttt gtacactaga 60

ctggtgtttt catcacgtag gccgggattg gttccagaat tgggtgatct attgaagttt 120

tgctgctaca ttattgccaa caggggttcc tgcaagcctt ggagtgttta ccataatctt 180

tcttcaggcc gcgagcttcg cccagctgct ccgcgcactc atggctgatt gtcgaacttc 240

cctgactggg tcgccacagg cagtagctag gacacgagaa atctgagcct tgtactggcg 300

caggagctgc tcatctatct tctctgccac ctcctggagc agttgtaaac tgagccttcg 360

acagagggcc ggattgccag gattcaccgt aagtgcagcc gcatcagtcg gcgttgcctg 420

ttgatcatga gactgttcca agcccgaggt caccatcgat atggctcctg ctacaacggc 480

ctttagttga tcctttacag catcggactt gttggctagg atttgccgaa gaacttgaag 540

agccgcctcg acatcagcca atcgtttggg cgatgacaca ctagcaatta gtatccgcgt 600

tattcgatct gtgtcctccg cgtatactgt aaattccatg tgtttcagaa catggactac 660

ggcgatggcg ttgacaactc cttgaggcct gtcttgcgtt atggggaacg actgctctag 720

tttcggcttc aacacggaga tgtaaaccca ctgctcagac aggggcctca gaatcgcgtg 780

gttttgcaca ctcagttggc ttttggcggc cagtagccct tccaggcgtg gagccatttg 840

cttcccatgc tcaccgagcg ctgctggaag ggatgcgagg atcttcacta gaccttctac 900

gtccctgtca cgccttgcca ccgctccagc agcgaatccc agagctcttg cgtattgctc 960

tatt 964

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> SEQ ID NO. 6：MoSpc2-F1

<400> 6

tggccatgtt gttcttcatc 20

<210> 7

<211> 48

<212> DNA

<213> SEQ ID NO. 7：MoSpc2-F2

<400> 7

cattcattgt tgacctccac tagctccatg tgtacaagaa agttggtt 48

<210> 8

<211> 47

<212> DNA

<213> SEQ ID NO. 8：MoSpc2-F3

<400> 8

gcaaaggaat agagtagatg ccgaccgaaa tatcaaattt caagtta 47

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> SEQ ID NO.9：MoSpc2-F4

<400> 9

aatagagcaa tacgcaagag 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> SEQ ID NO. 10：MoSpc2-nest F

<400> 10

acagcacatg gtagttgctg 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> SEQ ID NO. 11：MoSpc2-nest R

<400> 11

agcagcgctc ggtgagcatg 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> SEQ ID NO. 12：MoSpc2-ko-F

<400> 12

gcagctggtg agcacatact 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> SEQ ID NO. 13：MoSpc-ko-R

<400> 13

tgtctgcacc tgtagctgat 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> SEQ ID NO. 14：HYG R

<400> 14

cggtggtgca gatgaacttc 20