阅读说明：本技术 一种抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体制备方法及应用 (Preparation method and application of anti-herpes simplex virus composite IgY antibody ) 是由 付宇 于 2019-09-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体制备方法及应用,属于抗单纯疱疹病毒技术领域,包括以下步骤：步骤一：免疫原制备,取单纯疱疹病毒1型和单纯疱疹病毒2型混合后分别与福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂混合,搅拌乳化,制成油包水福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂单纯疱疹病毒免疫原；步骤二：免疫,将福氏完全佐剂免疫原注射给产蛋母鸡。本发明通过施于眼结膜、鼻腔、口腔、既无全身用药的局限性和副作用,又有局部用药起效快用药量少疗效好不吸收不破坏眼结膜鼻腔口腔表面正常微生态环境,且无毒副作用,用于防治由单纯疱疹病毒1型和单纯疱疹病毒2型,以及与其有共同抗原的病毒引起的口唇性疱疹、疱疹性皮肤炎和带状疱疹疾病。(The invention discloses a preparation method and application of an anti-herpes simplex virus composite IgY antibody, belonging to the technical field of anti-herpes simplex virus, comprising the following steps: the method comprises the following steps: preparing immunogen, mixing herpes simplex virus type 1 and herpes simplex virus type 2, mixing with Freund's complete adjuvant and Freund's incomplete adjuvant, stirring and emulsifying to obtain water-in-oil Freund's complete adjuvant and Freund's incomplete adjuvant herpes simplex virus immunogen; step two: and (4) immunizing, and injecting the Freund's complete adjuvant immunogen into the laying hens. The invention is applied to the conjunctiva, the nasal cavity and the oral cavity of eyes, has no limitation and side effect of systemic medication, has quick response, small dosage, good curative effect, no absorption, no damage to the normal micro-ecological environment of the surfaces of the conjunctiva, the nasal cavity and the oral cavity of eyes, conjunctiva and the oral cavity, and no toxic or side effect, and is used for preventing and treating herpes simplex virus type 1 and herpes simplex virus type 2, and herpes labialis, herpetic dermatitis and herpes zoster diseases caused by viruses with common antigens.)

一种抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体制备方法及应用

技术领域

本发明涉及复合IgY制备及应用，特别是涉及一种抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体制备方法及应用，属于抗单纯疱疹病毒技术领域。

背景技术

单纯疱疹病毒Herpessimplexvirus，HSV和水痘-带状疱疹病毒Varicella-zostervirus，VZV同属于α疱疹病毒亚科Herpesviridae，其特点是增殖速度快，引起细胞气球样变和破溃病变。单纯疱疹病毒根据血清学反应特征分为单纯疱疹病毒1型(HSV-1和单纯疱疹病毒2型HSV-2，水痘-带状疱疹病毒VZV只有一个血清型。HSV呈球形，完整病毒由核心、衣壳、被膜、囊膜组成核心含双股DNA，缠绕成纤丝卷轴。HSV衣壳呈二十面体对称，由162壳微粒组成，直径100nm。衣壳外一层被膜覆盖，厚薄不匀，最外层为典型的脂质双层囊膜，上有突起。有囊膜的病毒直径为150～200nm。11种囊膜糖蛋白gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gJ、gK、gL、gM，其中gB和gD与病毒吸附和穿入细胞有关，是与细胞上特异性受体相互作用的病毒配体分子；11种囊膜糖蛋白聚能产生中和抗体，其中gD诱导产生中和抗体的能力最强；gC是补体C3b结合蛋白；gE是Fc受体，可与IgG的Fc端结合；gG为型特异性抗原，以此抗原能区别HSV-1和HSV-2。gH控制病毒从细胞核膜出芽释放有关；gB、gC、gD、gH诱导细胞融合有关。HSV-1和HSV-2两型病毒核苷酸序列有50％同源性，型间有共同抗原，也有特异性抗原。VZV在形态上与HSV相同，仅有一个血清型，病毒体的胞膜中也存在糖蛋白gE、gB、gH、gI、gC和gL。gE、gB和gH极为丰富，糖蛋白gB与HSV的gB有49％的氨基酸相同。

人是病毒性疱疹的唯一天生宿主。HSV发病无人群、季节、性别差异，常年发生。HSV原发感染后1周左右血中可出现中和抗体，3-4周达高峰，可持续多年。中和抗体在细胞外灭活病毒，对阻止病毒经血流播散和限制病程有一定作用，但不能消灭潜伏感染的病毒和阻止复发。细胞免疫起重要作用，NK细胞可特异性杀死HSV感染细胞；在抗体参予下，介导ADCC效应亦可将HSV感染细胞裂解；细胞毒性T细胞和各种淋巴分子如干扰素等，但HSV在人体内不产生经久免疫力。

疱疹病毒主要通过直接密切接触和性接触传播。HSV经口腔、呼吸道、生殖道粘膜和破损皮肤等多种途径侵入机体，人感染非常普遍，感染率达80～90％。疱疹病毒感染后潜居于人体粘膜、血液、唾液及神经节细胞内。HSV-1病毒多引起腰以上皮肤疱疹、口腔疱疹及角膜结膜炎；HSV-2病毒多引起腰以下皮肤疱疹及外生殖器疱疹。常见的临床表现是粘膜或皮肤局部先发痒，微痛或刺痛，并出现内含透明液体的水泡状的***成簇出现的单房性小水疱。其中HSV-2病毒常常引起外生殖器小水泡、点状小溃疡，可伴有发热全身不适及***炎，具有反复发作性和传染性。孕妇感染了生殖器疱疹据报道容易导致胎儿流产、死胎及畸形。

单纯疱疹可分为原发型和继发型单纯疱疹。原发性感染多为隐性，大多无临床症状或呈显亚临床症状，仅有个人可出现临床症状。HSV原发感染之后产生免疫力，将部分病毒清除，部分病毒可沿神经髓鞘到达三叉神经节HSV-1和脊神经节HSV-2细胞中或周围星形神经胶质细胞内，以潜伏状态持续存在，与机体处于相对平衡，不引起临床症状。健康人群中约有50％以上为本病毒的携带者。HSV在人体内不产生经久免疫力，每当机体抵抗力下时，如发热、受寒、日晒、胃肠功效紊乱、月经、妊娠、情绪紧张、使用垂体或肾上腺皮质激素、遭受某些细菌病毒感染等，体内隐匿的HSV被激活，神经纤维索下行至感觉神经末梢，至附近表皮细胞内继续增殖，引起复发性局部疱疹，其特点是每次复发病变往往发生于同一部位。1、原发型指首次感染HSV者一般潜伏期为2～12天，平均6天，临床可有以下几种类型：1.隐性或亚临床感染；2.疱疹性龈口炎：好发于口腔、牙龈、舌、硬腭、软腭、咽等部位，迅速发生群集性小水疱，很快破溃形成浅表溃疡，也可开始即表现为红斑，浅溃疡，可伴有发热，咽痛及局部***肿痛，病程约2周。3..新生儿单纯疱疹；4.疱疹性湿疹；5.接种性单纯疱疹。2、继发型指部分患者原发感染消退后受到诱发因素刺激而在同一部位反复发作，出现***性疱疹、疱疹性角膜炎、疱疹性皮肤炎、疱疹性尿道炎、疱疹性***炎、疱疹性***，甚至***性疾病等，男性则可引起尿道炎、膀胱炎及***炎等，甚至脑膜炎、脑炎等。典型症状主要是在上述部位出现散在广泛分布的红斑、丘疹、水疱，数个、数十个或更多，1周内成为脓疱、糜烂或溃疡。可伴有瘙痒、疼痛及腹股沟***肿大。在发病后的第6-7天，局部症状逐渐加重，到10天时达最严重。一般3-4周皮损消退，但可发生新的损害。全身症状发生率高，在疾病早期即可出现发热、头痛不适及肌痛，在皮损发生后3-4天内达高潮，持续3-4天后逐渐消失。HSV-2潜伏期为2-14天，平均为6天。男性好发部位为***、***、***和***；女性好发部位为大大小***、***和***等。HSV-2引起的性传播病，导致的表现一般小片群集发生，有轻度发痒和烧的的感觉，几天后就变干而结成棕色的痴，痴脱落后有轻微的色素沉着但也很快就消失，不治疗约一周左右也可自愈，但在劳累、感冒等免疫力下降时易复发。复发感染：感觉神经元的潜伏感染是嗜神经HSV和VZV的一种特征。人受HSV原发感染后，HSV常在感觉神经节中终身潜伏，有时也能在迷走神经、肾上腺组织和脑中检出。约1％的受感染细胞携带病毒基因，病毒的DNA以游离环状附加体形式存在，每个受感染细胞约有20个拷贝。潜伏状态下只有很少的病毒基因表达。当机体受到多种因素如紫外线太阳暴晒、发热、创伤和情绪紧张、细菌或病毒感染以及使用肾上腺素等影响后，潜伏的病毒被激活，病毒沿感觉神经纤维轴索下行至神经末梢，感染上皮细胞，特别在骨髓移植或大剂量化疗后，在缺少预防的状态下，约有80％的病人复发。VZV病变皮肤出现簇集成群水疱，沿一侧周围神经呈带状分布；有明显的神经痛，伴局部***肿大；中间皮肤正常。HSV好发于皮肤与黏膜交接处，分布无一定规律，水疱较小易破，疼痛不著，多见于发热尤其高热病的过程中，常易复发；通常有在同一部位，有多次复发的病史。

HSV-1和HSV-2可能分别与唇癌、外阴癌及子***有关，特别HSV-1作为***的病因，曾受到人们重视。

HSV发病急每次复发有自限性，约1-3周即可自愈。治疗的目的是防止下次复发。但本病目前尚无特效药物，治疗原则为缩短病程，防止继发感染，减少复发。全身治疗原则：抗病毒，阿昔洛韦、万乃洛韦、病毒唑、磷甲酸钠、干扰素、白细胞介素-2、丽珠威等，减少疼痛和镇静，阿斯匹林、安乃近、消炎痛、布洛芬、新癀片、多虑平、甲氰咪胍、***赛庚啶、维生素B12、色聚肌胞等，预防继发感染。局部疗法：外洗pH4弱酸性女性护理液、酞丁胺擦剂或炉甘石洗剂外搽，涂2％龙胆紫溶液或涂新霉素糠馏油糊剂，或氧化锌油膏或泥膏、紫草生地榆油膏、0.5％新霉素软膏、或0.25％～0.1％疱疹净IDU软膏，或紫外线照射、音频电疗，激光照射，TDP频谱照射等。中医治疗：蛇丹汤加减，青黛散加香油调成糊剂换药，板蓝根和木贼草煎水外洗、或芒硝煎水外洗、或野菊花、黄柏、马齿苋煎水外洗。生殖器疱疹患者在康复后，还需继续禁止性生活三个月。

由于HSV主要在皮肤及粘膜上皮，尤其是皮肤与粘膜交界处的上皮组织中产生细胞炎症和细胞破溃，导致溃疡，反复发作是其特征和顽疾，迁延不愈，且较少发生于内脏和脑。且无有效根除方法，尤其是HSV-2导致的生殖器反复水泡、溃疡，痛苦不堪，缩手无策，且破溃细胞释放的病毒重新感染上皮细胞，而人体对HSV又无持续免疫清除率，致使患者永无宁日。HSV主要储存于神经细胞，复发时释放出来进入上皮细胞复制并致病，破溃的上皮细胞释放出病毒再次进入神经细胞休息。

根据HSV在体内的这一循环的客观规律，加之目前无针对病毒的特异性药物，以及到目前为止并没有成熟的HSV疫苗供临床使用，因此被动免疫防治HSV感染、减少HSV引起疱疹病复发、最终降低HSV负荷达到疱疹病治愈则显得尤为重要。鉴于此，我们发明了采用种属关系差距极大的禽类动物母鸡，作为产生抗体的母体，使用单纯疱疹病毒-1型(HSV-1和单纯疱疹病毒-2型(HSV-2病毒作为免疫原免疫母鸡，诱导产生抗更多种类的单纯疱疹病毒抗原决定簇的和更高效价的稳定且特异性IgY抗体，同时也能产生抗不同型具有与HSV享有共同抗原决定簇的疱疹病毒IgY抗体。这一策略可以解决既无HSV疫苗，也无抗HSV特效药物的难题，为减少HSV引起疱疹病复发、最终降低HSV负荷达到治愈疱疹病提供全新的、无毒副作用的生物治疗方法和手段。

事实上，单纯疱疹病毒HSV具有不同亚型，不但其亚型之间有共同的抗原决定簇和共同的抗原性，交叉抗原，而且还与同类疱疹病毒，如：水痘-带状疱疹病毒，VZV在病毒胞膜中有相似的糖蛋白gE、gB、gH、gI、gC和gL。gE、gB和gH，尤其是诱导细胞融合的糖蛋白gB还存在49％的氨基酸相同。因此，抗共同抗原决定簇抗体就可以和所有亚型HSV和亚类VZV等疱疹病毒产生抗原—抗体反应，达到消除不同亚型和亚类的疱疹病毒之目的。

鸡与哺乳动物由于种系进化差异的关系，其对同一种抗原诱导产生抗体的能力和产生抗不同抗原决定簇的抗体的能力与哺乳动物差异很大。鸡较哺乳动物，兔对哺乳动物类的抗原有更好的免疫应答反应，对同一种抗原产生的不同抗原决定簇的抗体种类和数量都不同。鸡比哺乳动物能产生抗更多抗原决定簇的抗体，尤其是对哺乳动物的保守的抗原更是如此，哺乳动物不能产生抗体而鸡则能产生很高效价的特异性鸡卵黄免疫球蛋白，IgY抗体，因此使用人源性的病毒免疫母鸡可以产生比病毒直接感染人产生更多种类和数量不同的抗原决定簇的抗体。

根据上述事实，采用两个亚型单纯疱疹病毒HSV-1和HSV-2免疫的特异性鸡卵黄免疫球蛋白IgY抗体就可以治疗HSV-1和HSV-2病毒引起的单纯性疱疹病，例如：特异性抗轮状病毒IgY抗体能有效地治疗所有由轮状病毒引起的秋季腹泻，特异性IgY抗体与病毒表面抗原发生特异性抗原—抗体结合，其改变病毒表面空间和电场结构、抑制病毒与靶细胞结合、抑制病毒活性、阻止病毒进入细胞、排斥了病毒在炎症部位的存在，促进巨噬细胞等吞噬病毒，并清除之。此外，也能够根据相同机理清除具有共同抗原决定簇的其它病毒和防治其产生的疾病。因此，抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体与目前的抗病毒药物和治疗方法作用原理完全不同，而且完全不会诱发耐药毒株的产生。

根据上述原理，我们采用单纯疱疹病毒HSV-1和HSV-2联合免疫产蛋母鸡，其产生的特异性抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体制剂能够有效地防治由HSV-1和HSV-2，以及具有共同抗原决定簇的水痘-带状疱疹病毒VZV等引起的疱疹性炎症疾病，如：***性疱疹、疱疹性角膜炎、疱疹性皮肤炎、疱疹性***炎、疱疹性***等生殖器疱疹病。当IgY抗体与病毒表面抗原发生免疫反应则可以阻止病毒进入细胞，促进吞噬细胞清除病毒，从而减少病毒、减轻症状、缩短病程，控制继续感染，从而达到防治疾病的效果。

发明内容

本发明的主要目的是为了防治由疱疹病毒，以及与之具有共同抗原决定簇的病毒引起的龈口炎、唇疱疹、湿疹样疱疹、疱疹性角膜炎等以及生殖器疱疹和疱疹性***等感染而提供一种抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体制备方法及应用。

本发明的目的可以通过采用如下技术方案达到：

一种抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体制备方法，包括以下步骤：

步骤一：免疫原制备，取单纯疱疹病毒1型和单纯疱疹病毒2型混合后分别与福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂混合，搅拌乳化，制成油包水福氏不完全佐剂和福氏完全佐剂单纯疱疹病毒免疫原；

步骤二：免疫，将福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂免疫原注射给产蛋母鸡；

步骤三：抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体水提取物的制备，收集免疫母鸡的鸡蛋并取蛋黄液，将蛋黄液与蒸馏水搅拌，并调节酸碱度且低温静置过夜，取上清，过滤除菌，即得抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体水提取物。

优选的，在步骤一中免疫原制备包括：

(1)取单纯疱疹病毒1型30～70份，单纯疱疹病毒2型70～30份混合成病毒液；

(2)将等量体积的病毒液与等量体积的福氏完全佐剂混合，搅拌乳化，制成油包水福氏完全佐剂单纯疱疹病毒免疫原；

(3)将等量体积的病毒液与等量体积的福氏不完全佐剂混合，搅拌乳化，制成油包水福氏不完全佐剂单纯疱疹病毒免疫原；

(4)每毫升福氏完全佐剂免疫原和福氏不完全佐剂免疫原中均含有病毒50～300μg。

优选的，在步骤二中免疫包括：

(1)将福氏完全佐剂免疫原皮下和肌肉20～100点注射给产蛋母鸡，每只产蛋母鸡注射1.0ml～1.3ml免疫原；

(2)然后每隔1～2周使用福氏不完全佐剂免疫原1.0ml～1.3ml皮下和肌肉20～100点注射给产蛋母鸡共计8次；

(3)此后每隔1个月再使用福氏不完全佐剂免疫原1.0ml皮下和肌肉20～100点注射给产蛋母再加强免疫3次，前后共免疫12次。

优选的，在步骤三中抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体水提取物的制备包括：

(1)收集第一次免疫后30天，以及30天以后的免疫母鸡的鸡蛋，鸡蛋表面用自来水洗净、70％酒精浸泡，去蛋壳取蛋黄，去除蛋黄膜取蛋黄液；

(2)将蛋黄液与蒸馏水按体积比1:6～12的比例加蒸馏水搅拌，并用1NHCl调节酸碱度至pH4.7～5.5，在温度4℃下静置过夜；

(3)将蛋黄稀释液在4℃高速离心15～30min取上清，然后经截留分子量为10～100kDa的中空纤维超滤器中超滤浓缩10～15倍，再加入0.01％～8.0％的氯已定，并使用1NNaOH调节酸碱度至pH7.0～7.5，且在4℃静置过夜；

(4)此后高速离心10～20min取上清，即得抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体水提取物。

优选的，在步骤四中抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体纯品的制备包括：

(1)将氯已定处理后的抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体水提取物加硫酸胺至50％～60％的饱和度充分搅拌，室温静置6～12小时；

(2)然后高速离心10～15min，取沉淀，将沉淀使用蒸馏水稀释到原体积量，再加硫酸胺至30％～35％的饱和度充分搅拌，室温静置6～12小时；

(3)然后高速离心10～15min，取沉淀，用蒸馏水溶解后采用中空纤维超滤膜超滤除盐，即得抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体纯品。

优选的，免疫中的产蛋母鸡包括普通环境下饲养、清洁环境下饲养、以及SPF环境下饲养的海兰褐鸡、罗曼鸡、明星鸡、莱杭鸡、以及家养的土鸡。

优选的，单纯疱疹病毒1型与单纯疱疹病毒2型混合后经石炭酸灭活处理。

优选的，抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体水提取物采用ELISA方法测定，IgY抗体水提取物的纯度采用SDS-PAGE电泳测定。

一种抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体制备方法在防治疱疹病毒性疾病中的应用。

本发明的有益技术效果：按本发明的方法制取的特异性抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体局部施于眼结膜、鼻腔、口腔、咽喉及皮肤、生殖器，既无全身用药的局限性和副作用，又有局部用药起效快、用药量少、疗效好、不吸收、不破坏眼结膜、鼻腔、口腔、咽喉及皮肤、生殖器表面正常微生态环境，且无毒副作用，抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体提取物不产生急性毒性反应、慢性毒性反应、过敏反应、以及无粘膜刺激性和致畸、致突变、致癌等，故抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体提取物属于实际无毒级、无致畸、致癌、致突变的生物制品。

具体实施方式

为使本领域技术人员更加清楚和明确本发明的技术方案，下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

本实施例提供的抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体制备方法，包括以下步骤：

步骤一：免疫原制备，取单纯疱疹病毒1型和单纯疱疹病毒2型混合后分别与福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂混合，搅拌乳化，制成油包水福氏不完全佐剂和福氏完全佐剂单纯疱疹病毒免疫原；

步骤二：免疫，将福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂免疫原注射给产蛋母鸡；

步骤三：抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体水提取物的制备，收集免疫母鸡的鸡蛋并取蛋黄液，将蛋黄液与蒸馏水搅拌，并调节酸碱度且低温静置过夜，取上清，过滤除菌，即得抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体水提取物。

在步骤一中免疫原制备包括：(1)取单纯疱疹病毒1型30～70份，单纯疱疹病毒2型70～30份混合成病毒液；(2)将等量体积的病毒液与等量体积的福氏完全佐剂混合，搅拌乳化，制成油包水福氏完全佐剂单纯疱疹病毒免疫原；(3)将等量体积的病毒液与等量体积的福氏不完全佐剂混合，搅拌乳化，制成油包水福氏不完全佐剂单纯疱疹病毒免疫原；(4)每毫升福氏完全佐剂免疫原和福氏不完全佐剂免疫原中均含有病毒50～300μg。

在步骤二中免疫包括：(1)将福氏完全佐剂免疫原皮下和肌肉20～100点注射给产蛋母鸡，每只产蛋母鸡注射1.0ml～1.3ml免疫原；(2)然后每隔1～2周使用福氏不完全佐剂免疫原1.0ml～1.3ml皮下和肌肉20～100点注射给产蛋母鸡共计8次；(3)此后每隔1个月再使用福氏不完全佐剂免疫原1.0ml皮下和肌肉20～100点注射给产蛋母再加强免疫3次，前后共免疫12次。

在步骤三中抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体水提取物的制备包括：(1)收集第一次免疫后30天，以及30天以后的免疫母鸡的鸡蛋，鸡蛋表面用自来水洗净、70％酒精浸泡，去蛋壳取蛋黄，去除蛋黄膜取蛋黄液，(2)将蛋黄液与蒸馏水按体积比1:6～12的比例加蒸馏水搅拌，并用1NHCl调节酸碱度至pH4.7～5.5，在温度4℃下静置过夜；(3)将蛋黄稀释液在4℃高速离心15～30min取上清，然后经截留分子量为10～100kDa的中空纤维超滤器中超滤浓缩10～15倍，再加入0.01％～8.0％的氯已定，并使用1NNaOH调节酸碱度至pH7.0～7.5，且在4℃静置过夜；(4)此后高速离心10～20min取上清，即得抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体水提取物。

在步骤四中抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体纯品的制备包括：(1)将氯已定处理后的抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体水提取物加硫酸胺至50％～60％的饱和度充分搅拌，室温静置6～12小时；(2)然后高速离心10～15min，取沉淀，将沉淀使用蒸馏水稀释到原体积量，再加硫酸胺至30％～35％的饱和度充分搅拌，室温静置6～12小时；(3)然后高速离心10～15min，取沉淀，用蒸馏水溶解后采用中空纤维超滤膜超滤除盐，即得抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体纯品。

免疫中的产蛋母鸡包括普通环境下饲养、清洁环境下饲养、以及SPF环境下饲养的海兰褐鸡、罗曼鸡、明星鸡、莱杭鸡、以及家养的土鸡，单纯疱疹病毒1型与单纯疱疹病毒2型混合后经石炭酸灭活处理，抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体水提取物采用ELISA方法测定效价，IgY抗体水提取物的纯度采用SDS-PAGE电泳测定，福氏完全佐剂免疫原和福氏不完全佐剂免疫原的制备则为：将200ml的病毒液与200ml的福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂混合，使用高速搅拌器搅拌乳化，制成油包水福氏不完全佐剂免疫原。

一种抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体制备方法在防治疱疹病毒性疾病中的应用，加入药学上可接受的附加剂制成含有抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体的滴鼻液、喷雾剂、气雾剂、搽剂、油剂、糊剂、软膏和贴剂，抗单纯疱疹病毒复合IgY防治***性疱疹、疱疹性角膜炎、疱疹性皮肤炎、带状疱疹、以及疱疹性***炎、疱疹性***、疱疹性外阴炎、***疱疹及溃疡等生殖器疱疹病。

实施例1：

制备100克抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体水提取物生产工艺流程：

步骤一：免疫原的制备

(1)单纯疱疹病毒1型50份、单纯疱疹病毒2型50份混合后经石炭酸灭活处理；

(2)将200ml的病毒液与200ml的福氏完全佐剂混合，使用高速搅拌器搅拌乳化，制成油包水福氏完全佐剂免疫原；

(3)福氏不完全佐剂免疫原的制备则为：将200ml的病毒液与200ml的福氏不完全佐剂混合，使用高速搅拌器搅拌乳化，制成油包水福氏不完全佐剂免疫原；

步骤二：免疫产蛋母鸡

(1)使用注射器将福氏完全佐剂免疫原皮下和肌肉60点注射给20周的海兰褐产蛋母鸡，每只注射1.2ml免疫原；

(2)然后隔一周使用福氏不完全佐剂免疫原1.2ml皮下和肌肉60点注射给产蛋母鸡，共8次；

(3)此后每隔一个月再使用福氏不完全佐剂免疫原1ml皮下和肌肉50点注射给产蛋母鸡加强免疫共3次，免疫母鸡总数为60只；

步骤三：抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体水提取物的制备

(1)收集第一次免疫后30～120天的免疫母鸡的鸡蛋，使用清水洗净、70％的酒精浸泡进行鸡蛋表面消毒，去蛋壳、取蛋黄、去除蛋黄膜取蛋黄液；

(2)将蛋黄液与蒸馏水按体积比1:10的比例加蒸馏水，充分搅拌，并使用1NHCl调节酸碱度至pH4.8～5.1，放置4℃冰柜过夜；

步骤四：将蛋黄稀释液高速离心10000xg，20分钟，取上清，将上清置于截留分子量50kDa的中空纤维超滤器中超滤浓缩10倍；

(1)然后加入3.0％的氯已定搅匀，并使用1NNaOH调节酸碱度至pH7.3，并放置4℃过夜；

(2)此后高速离心10000g，20分钟，取上清，将上清经0.45μ的消毒微孔滤膜过滤除菌，即得抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体水提取物；

(3)抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体水提取物经ELISA方法测定，每毫克蛋白的特异性抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体的效价为1:6000/mg蛋白，IgY抗体水提取物的纯度经SDS-PAGE电泳测定为31.8％。

实施例2：

制备100克抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体纯品生产工艺流程：

步骤一：免疫原的制备

(1)单纯疱疹病毒1型50份、单纯疱疹病毒2型50份混合后经石炭酸灭活处理；

(2)将200ml的病毒液与200ml的福氏完全佐剂混合，使用高速搅拌器搅拌乳化，制成油包水福氏完全佐剂免疫原；

(3)福氏不完全佐剂免疫原的制备则为：将200ml的病毒液与200ml的福氏不完全佐剂混合，使用高速搅拌器搅拌乳化，制成油包水福氏不完全佐剂免疫原；

步骤二：免疫产蛋母鸡

(1)使用注射器将福氏完全佐剂免疫原皮下和肌肉60点注射给20周的海兰褐产蛋母鸡，每只注射1.2ml免疫原；

(2)然后隔一周使用福氏不完全佐剂免疫原1.2ml皮下和肌肉60点注射给产蛋母鸡，共8次；

(3)此后每隔一个月再使用福氏不完全佐剂免疫原1ml皮下和肌肉50点注射给产蛋母鸡加强免疫共3次，免疫母鸡总数为60只；

步骤三：抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体水提取物的制备

(1)收集第一次免疫后30～120天的免疫母鸡的鸡蛋，使用清水洗净、70％的酒精浸泡进行鸡蛋表面消毒，去蛋壳、取蛋黄、去除蛋黄膜取蛋黄液；

(2)将蛋黄液与蒸馏水按体积比1:10的比例加蒸馏水，充分搅拌，并使用1NHCl调节酸碱度至pH4.8～5.1，放置4℃冰柜过夜；

步骤四：将蛋黄稀释液高速离心10000g，20分钟，取上清，将上清置于截留分子量50kDa的中空纤维超滤器中超滤浓缩10倍，然后加入3.0％的氯已定搅匀，并使用1NNaOH调节酸碱度至pH7.3，并放置4℃过夜，此后高速离心10000g，20分钟，取上清；

(1)将上清加硫酸胺至55％的饱和度充分搅拌，室温静置8小时，然后高速离心10000g10分钟，取沉淀，将沉淀使用蒸馏水稀释到原体积量，再加硫酸胺至33％的饱和度充分搅拌，室温静置6小时；

(2)然后高速离心10000g10分钟，取沉淀，用蒸馏水稀释溶解后采用中空纤维超滤膜超滤除盐，即得抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体纯品；

(3)抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体纯品经ELISA方法测定，抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体纯品中每毫克蛋白的特异性抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体的效价为1:24000/mg蛋白，IgY抗体纯品中，IgY抗体的纯度经SDS-PAGE电泳测定为83.5％。

实验例3：

单纯疱疹病毒复合免疫原按本发明的方法免疫海兰褐产蛋母鸡，取第一次免疫后140天的免疫母鸡的鸡蛋，并按本发明的方法制备出抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体的水提取物，应用ELISA方法测定抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体结合不同病毒抗原的生物学效价见表1。

表1抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体水提取物的效价

根据上述实验结果可以清楚地看到：1.按本发明的方法制备出的抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体水提取物具有特异性抗单纯疱疹病毒1型和单纯疱疹病毒2型等抗原的IgY抗体；2由上述实验可见，一种抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体可以治疗由上述病毒引起的***性疱疹、疱疹性角膜炎、疱疹性皮肤炎、疱疹性尿道炎、疱疹性***炎、疱疹性***，等；3同时也可以用一种抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体治疗由上述病毒中的任何一种病毒引起的***性疱疹、疱疹性角膜炎、疱疹性皮肤炎、疱疹性尿道炎、疱疹性***炎、疱疹性***，等；4由此还可以扩大到由与上述病毒有共同抗原决定簇的病毒引起的***性疱疹、疱疹性角膜炎、疱疹性皮肤炎、疱疹性尿道炎、疱疹性***炎、疱疹性***等，都可以使用本发明的抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体预防和治疗。

实验例4：

单纯疱疹病毒复合免疫原按本发明的方法免疫海兰褐产蛋母鸡，取第一次免疫后140天的免疫母鸡的鸡蛋，并按本发明的方法制备出抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体的纯品，应用ELISA方法测定抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体结合不同病毒抗原的生物学效价见表2。

表2抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体纯品的效价

根据上述实验结果可以清楚地看到：1.按本发明的方法制备出的抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体纯品具有特异性抗单纯疱疹病毒1型和单纯疱疹病毒2型等抗原的IgY抗体，且较实验例1中的按本发明的方法制备出抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体水提取物IgY抗体效价高；2由上述实验可见，一种抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体可以治疗由上述病毒引起的***性疱疹、疱疹性角膜炎、疱疹性皮肤炎、疱疹性尿道炎、疱疹性***炎、疱疹性***，等；3.同时也可以用一种抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体治疗由上述病毒中的任何一种病毒引起的***性疱疹、疱疹性角膜炎、疱疹性皮肤炎、疱疹性尿道炎、疱疹性***炎、疱疹性***，等；4.由此还可以扩大到由与上述病毒有共同抗原决定簇的病毒引起的***性疱疹、疱疹性角膜炎、疱疹性皮肤炎、疱疹性尿道炎、疱疹性***炎、疱疹性***等，都可以使用本发明的抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体预防和治疗。

实验例5：

比较不同鸡种的免疫应答和产生抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体的能力：以权利要求1所述的一种特异性抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体水提取物的制备方法，分别免疫海兰褐产蛋母鸡、莱杭产蛋母鸡、明星、以及土鸡产蛋母鸡，采用第一次免疫后80天的免疫母鸡的鸡蛋，并按权利要求1所述的方法提取抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体的水提取物，应用ELISA方法测定抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体结合抗原的生物学效价见表3。

表3不同鸡种的产蛋母鸡对同一抗原的免疫应答能力及特异性IgY抗体水提取物的效价

根据上述实验结果可以清楚地看到：在相同的免疫条件下，按本发明的方法制备出的不同鸡种的抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体水提取物，其特异性抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体的生物学效价基本一致。

实验例6：

按本发明将福氏完全佐剂免疫原皮下和肌肉60点注射给产蛋母鸡，每只产蛋母鸡注射1.3ml免疫原，两周后每隔1周使用福氏不完全佐剂免疫原1.3ml皮下和肌肉60点注射给产蛋母鸡共计8次，此后每隔1个月再使用福氏不完全佐剂免疫原1ml皮下和肌肉30点注射给产蛋母鸡再加强免疫3次；其与传统的3次免疫注射的方法的效果比较，抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体水提取物效价结果见表4。

表4不同免疫次数诱导的海兰褐母鸡产生高效价的特异性IgY抗体能力的比较

根据上述实验结果可以清楚地看到：按本发明的12次免疫方法免疫的海兰褐产蛋母鸡与传统的3次免疫方法免疫的海兰褐产蛋母鸡比较其特异性抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体产生能力的持久。并按本发明的方法制备出第一次免疫后80天的抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体水提取物和240天的抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体水提取物生物学效价基本相同。本发明的12次免疫方法要比传统的3次免疫方法好很多，其特异性抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体的生物学效价与之相比有差异十分显著。本发明的12次免疫方法所免疫的母鸡产生高效价的特异性抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体的时间更长。

实验例7：

单纯疱疹病毒1型和单纯疱疹病毒2型不同组成比例对特异性抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体产生的影响，第一次免疫后80天抗单纯疱疹病毒复合IgY水提取物结果见表5。

表5两种病毒不同组成比混合免疫原诱导海兰褐母鸡产生特异性IgY抗体结合效价的比较

根据上述实验结果可以清楚地看到：按本发明的方法制备的病毒组成比例不同的免疫原免疫产蛋海兰褐母鸡后，并按本发明的方法制备出第一次免疫后80天免疫母鸡鸡蛋的抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体水提取物，其抗不同组成比的病毒IgY抗体的生物学效价不同。这说明这些病毒不仅能够产生IgY抗体，而且产生特异性IgY抗体的量也根据各种抗原量的不同而相应变化。

实施例8：

抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体的喷雾剂：

成分	重量比％
		抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体提取物	0.25
水	90.38
		甘油	5
愈创木磺酸钠	0.30
		EDTA二钠	0.1
芦荟提取物	0.4
		蜂胶	2
增溶剂	0.55
		EGF	0.5
小青瓜香精	0.02
		防腐剂	0.5

经0.45μ的消毒微孔滤膜过滤除菌，无菌灌装入消毒的气雾剂的罐中。

实施例9：霜剂

抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体的霜剂：

无菌灌装入消毒的容器中。

实施例10：搽剂

抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体搽剂：

成分	重量比％
		抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体提取物	0.25
水	48.50
		720	0.10
山梨醇	5.00
		丁二醇	8.50
甘草酸二钾	0.20
		EDTA二钠	0.10
AVC	0.50
		仙人掌提取物	4.00
凡士林	7.00
		十八醇	1.20
GP200	3.50
		白油	12.00
GTCC	5.00
		薄荷脑	0.10
单甘脂	2.00
		再生硅	1.00
EGF	0.50
		小青瓜香精	0.05
防腐剂	0.50

灌装入消毒的铝箔或塑料软管。

综上所述，在本实施例中，按照本实施例的一种抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体制备方法及在防治疱疹病毒性疾病中的应用，按本发明的方法提取的抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体水提取物的纯度，经SDS-PAGE电泳测定IgY抗体的纯度达到30～34％；而经过本发明的方法提取的抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体纯品的纯度，经SDS-PAGE电泳测定IgY抗体的纯度达到80～85％及以上,按本发明的方法提取的抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体水提取物的生物学效价经ELISA方法测定，特异性抗单纯疱疹病毒1型抗原的生物学效价达到每毫克蛋白中的特异性抗单纯疱疹病毒1型抗原结合效价为1:2000～4000/mg蛋白；特异性抗单纯疱疹病毒2型抗原的生物学效价达到每毫克蛋白中的特异性抗单纯疱疹病毒2型抗原结合效价为1:2000～4000/mg蛋白；特异性抗单纯疱疹病毒复合病毒抗原的生物学效价达到每毫克蛋白中的特异性抗单纯疱疹病毒复合病毒抗原结合效价为1:4000～8000/mg蛋白,按本发明的方法提取的抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体提纯品的生物学效价经ELISA方法测定，特异性抗单纯疱疹病毒1型抗原的生物学效价达到每毫克蛋白中的特异性抗单纯疱疹病毒1型抗原结合效价为1:8000～16000/mg蛋白；特异性抗单纯疱疹病毒2型抗原的生物学效价达到每毫克蛋白中的特异性抗单纯疱疹病毒2型抗原结合效价为1:8000～16000/mg蛋白；特异性抗单纯疱疹病毒复合病毒抗原的生物学效价达到每毫克蛋白中的特异性抗单纯疱疹病毒复合病毒抗原结合效价为1:16000～32000/mg蛋白,按本发明的方法制取的特异性抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体局部施于眼结膜、鼻腔、口腔、咽喉及皮肤、生殖器，既无全身用药的局限性和副作用，又有局部用药起效快、用药量少、疗效好、不吸收、不破坏眼结膜、鼻腔、口腔、咽喉及皮肤、生殖器表面正常微生态环境，且无毒副作用。抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体提取物不产生急性毒性反应、慢性毒性反应、过敏反应、以及无粘膜刺激性和致畸、致突变、致癌等，故抗单纯疱疹病毒复合IgY抗体提取物属于实际无毒级、无致畸、致癌、致突变的生物制品。

以上所述，仅为本发明进一步的实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明所公开的范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都属于本发明的保护范围。