阅读说明：本技术 一种仿刺参AjAIF-1多克隆抗体的制备方法 (Preparation method of apostichopus japonicus AjAIF-1 polyclonal antibody ) 是由 王晗 王凤鑫 王际辉 刘玉佳 詹宏磊 于 2019-11-05 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种仿刺参AjAIF-1多克隆抗体的制备方法,包括如下步骤：S1、根据仿刺参基因组数据库信息,对AjAIF-1基因进行密码子优化；S2、构建表达载体,实现AjAIF-1的原核细胞的重组表达,并将表达载体转化到大肠杆菌感受态细胞中；S3、将转化大肠杆菌依次经扩大培养、诱导表达、菌体收集、菌体破碎、蛋白纯化过程,得到AjAIF-1基因表达的目的蛋白。本发明制备的AjAIF-1多克隆抗体,具有高特异性、高灵敏度和较高的效价,且具有一定的特异性,给仿刺参AjAIF-1蛋白的检测提供了的优质抗体,为仿刺参抗体的制备提供了新的方法和研究方向,为促进仿刺参养殖业的发展发挥重要作用。(The invention discloses a preparation method of an apostichopus japonicus AjAIF-1 polyclonal antibody, which comprises the following steps: s1, carrying out codon optimization on the AjAIF-1 gene according to the apostichopus japonicus genomic database information; s2, constructing an expression vector, realizing the recombinant expression of the AjAIF-1 prokaryotic cell, and transforming the expression vector into an escherichia coli competent cell; s3, carrying out amplification culture, induction expression, thallus collection, thallus crushing and protein purification on the transformed escherichia coli in sequence to obtain the target protein expressed by the AjAIF-1 gene. The AjAIF-1 polyclonal antibody prepared by the invention has high specificity, high sensitivity, higher titer and certain specificity, provides a high-quality antibody for the detection of the AjAIF-1 protein of the apostichopus japonicus, provides a new method and a new research direction for the preparation of the apostichopus japonicus antibody, and plays an important role in promoting the development of the apostichopus japonicus breeding industry.)

一种仿刺参AjAIF-1多克隆抗体的制备方法

技术领域

本发明涉及生物相关技术领域，具体为一种仿刺参AjAIF-1多克隆抗体的制备方法。

背景技术

仿刺参又名刺参。在我国，其主要分布在辽宁、山东及河北等北方沿海。因为仿刺参具有较高的营养价值和药用价值，所以成为我国重要的海水养殖种类之一。目前在黄海和渤海地区的海参养殖业正飞速发展。随着我国仿刺参养殖规模的不断扩大，在海参的养殖和运输过程对其所造成组织创伤机率增大，因而易被细菌感染导致疾病，影响海参健康状况，给养殖户带来巨大的经济损失。在此背景下，研究仿刺参的免疫相关基因的表达模式和免疫防御机制，对提高仿刺参的抗病能力，减少经济损失显得非常必要；同种异体移植物炎症因子（ Allograft Inflammatory Factor-1, AIF-1）是在炎症反应中具有重要作用的基因之一，最初由Vtans在1995年从大鼠的同种异体心脏移植物中克隆出来，此后又在人的同种异体心脏移植物中发现了该因子。最初研究表明，AIF-1参与免疫移植排斥及炎症反应。之后的研究发现AIF-1在组织损伤中会高度表达。目前AIF-1在脊椎动物人、鼠中的研究已经较为广泛和深入，在无脊柱动物海绵、海胆、牡蛎、仿刺参等物种的免疫反应过程中也起着重要作用。

目前针对仿刺参同源异体移植物炎症因子AjAIF-1的相关研究较少，尤其是对AjAIF-1的抗体制备等研究目前还无相关研究报道，研究制备仿刺参免疫相关基因AjAIF-1的多克隆抗体，将为仿刺参免疫机制的研究提供有力工具，进而为减少因仿刺参病害带来的经济损失和促进仿刺参养殖业的发展发挥重要作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种仿刺参AjAIF-1多克隆抗体的制备方法，可通过研究制备仿刺参免疫相关基因AjAIF-1的多克隆抗体，将为仿刺参免疫机制的研究提供有力工具，进而为减少因仿刺参病害带来的经济损失和促进仿刺参养殖业的发展发挥重要作用。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种仿刺参AjAIF-1多克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：

S1、根据仿刺参基因组数据库信息，对AjAIF-1基因进行密码子优化；

S2、构建表达载体，实现AjAIF-1的原核细胞的重组表达，并将表达载体转化到大肠杆菌感受态细胞中；

S3、将转化大肠杆菌依次经扩大培养、诱导表达、菌体收集、菌体破碎、蛋白纯化过程，得到AjAIF-1基因表达的目的蛋白；

S4、将纯化的AjAIF-1蛋白作为抗原用生理盐水稀释，并作为免疫原对动物进行二次免疫，收集动物被免疫后的血清；

S5、将含AjAIF-1抗体血清进行ELISA效价检测，并选择效价高的抗体。

优选的，S2中，所述大肠杆菌感受态菌体为大肠杆菌BL21感受态菌体。

优选的，S3中，在纯化蛋白过程中利用His标签蛋白纯化试剂盒进行蛋白纯化。

优选的，S4中，所述的动物选自6-8周的昆明鼠。

优选的，S4中，所述AjAIF-1蛋白作为抗原需要免疫动物两次，其中，第一次免疫：每只小鼠免疫量为AjAIF-1抗体蛋白20µg，使用五周标准鼠单抗/多抗制备佐剂；第二次免疫：第21天，每只小鼠免疫量为AjAIF-1抗体蛋白20µg,使用五周标准鼠单抗/多抗制备佐剂。

优选的，S4中，在第35天收集小鼠免疫后的血清样本。

优选的，S5中，所述的抗体作为免疫原，需用终浓度为0.25mmol/L的IPTG在20℃条件下诱导，诱导时间为16-20h。

本发明提供了一种仿刺参AjAIF-1多克隆抗体的制备方法，具备以下有益效果：

通过本发明方法制备的AjAIF-1多克隆抗体，可以成功应用于蛋白免疫印迹方法对仿刺参样品AjAIF-1蛋白的检测，且本发明方法制备的AjAIF-1多克隆抗体，不仅具有高特异性、高灵敏度，且具有一定的特异性和较高的效价，给仿刺参AjAIF-1蛋白的检测提供了的优质抗体，为仿刺参抗体的制备提供了新的方法和研究方向，进而为减少因仿刺参病害带来的经济损失和促进仿刺参养殖业的发展发挥重要作用。

具体实施方式

实施例1：

一种仿刺参AjAIF-1多克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：

S1、根据仿刺参基因组数据库信息，对AjAIF-1基因进行密码子优化；

S2、构建表达载体，实现AjAIF-1的原核细胞的重组表达，并将表达载体转化到大肠杆菌感受态细胞中；

S3、将转化大肠杆菌依次经扩大培养、诱导表达、菌体收集、菌体破碎、蛋白纯化过程，得到AjAIF-1基因表达的目的蛋白；

S4、将纯化的AjAIF-1蛋白作为抗原用生理盐水稀释，并作为免疫原对动物进行二次免疫，收集动物被免疫后的血清；

S5、将含AjAIF-1抗体血清进行ELISA效价检测，并选择效价高的抗体。

优选的，S2中，所述大肠杆菌感受态菌体为大肠杆菌BL21感受态菌体。

优选的，S3中，在纯化蛋白过程中利用His标签蛋白纯化试剂盒进行蛋白纯化。

优选的，S4中，所述的动物选自6周的昆明鼠。

优选的，S4中，所述AjAIF-1蛋白作为抗原需要免疫动物两次，其中，第一次免疫：每只小鼠免疫量为AjAIF-1抗体蛋白20µg，使用五周标准鼠单抗/多抗制备佐剂；第二次免疫：第21天，每只小鼠免疫量为AjAIF-1抗体蛋白20µg,使用五周标准鼠单抗/多抗制备佐剂。

优选的，S4中，在第35天收集小鼠免疫后的血清样本。

优选的，S5中，所述的抗体作为免疫原，需用终浓度为0.25mmol/L的IPTG在20℃条件下诱导，诱导时间为16h。

实施例2：

一种仿刺参AjAIF-1多克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：

S1、根据仿刺参基因组数据库信息，对AjAIF-1基因进行密码子优化；

S2、构建表达载体，实现AjAIF-1的原核细胞的重组表达，并将表达载体转化到大肠杆菌感受态细胞中；

S3、将转化大肠杆菌依次经扩大培养、诱导表达、菌体收集、菌体破碎、蛋白纯化过程，得到AjAIF-1基因表达的目的蛋白；

S4、将纯化的AjAIF-1蛋白作为抗原用生理盐水稀释，并作为免疫原对动物进行二次免疫，收集动物被免疫后的血清；

S5、将含AjAIF-1抗体血清进行ELISA效价检测，并选择效价高的抗体。

优选的，S2中，所述大肠杆菌感受态菌体为大肠杆菌BL21感受态菌体。

优选的，S3中，在纯化蛋白过程中利用His标签蛋白纯化试剂盒进行蛋白纯化。

优选的，S4中，所述的动物选自6-8周的昆明鼠。

优选的，S4中，所述AjAIF-1蛋白作为抗原需要免疫动物两次，其中，第一次免疫：每只小鼠免疫量为AjAIF-1抗体蛋白20µg，使用五周标准鼠单抗/多抗制备佐剂；第二次免疫：第21天，每只小鼠免疫量为AjAIF-1抗体蛋白20µg,使用五周标准鼠单抗/多抗制备佐剂。

优选的，S4中，在第35天收集小鼠免疫后的血清样本。

优选的，S5中，所述的抗体作为免疫原，需用终浓度为0.25mmol/L的IPTG在20℃条件下诱导，诱导时间为18h。

实施例3：

一种仿刺参AjAIF-1多克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：

S1、根据仿刺参基因组数据库信息，对AjAIF-1基因进行密码子优化；

S2、构建表达载体，实现AjAIF-1的原核细胞的重组表达，并将表达载体转化到大肠杆菌感受态细胞中；

S3、将转化大肠杆菌依次经扩大培养、诱导表达、菌体收集、菌体破碎、蛋白纯化过程，得到AjAIF-1基因表达的目的蛋白；

S4、将纯化的AjAIF-1蛋白作为抗原用生理盐水稀释，并作为免疫原对动物进行二次免疫，收集动物被免疫后的血清；

S5、将含AjAIF-1抗体血清进行ELISA效价检测，并选择效价高的抗体。

优选的，S2中，所述大肠杆菌感受态菌体为大肠杆菌BL21感受态菌体。

优选的，S3中，在纯化蛋白过程中利用His标签蛋白纯化试剂盒进行蛋白纯化。

优选的，S4中，所述的动物选自8周的昆明鼠。

优选的，S4中，所述AjAIF-1蛋白作为抗原需要免疫动物两次，其中，第一次免疫：每只小鼠免疫量为AjAIF-1抗体蛋白20µg，使用五周标准鼠单抗/多抗制备佐剂；第二次免疫：第21天，每只小鼠免疫量为AjAIF-1抗体蛋白20µg,使用五周标准鼠单抗/多抗制备佐剂。

优选的，S4中，在第35天收集小鼠免疫后的血清样本。

优选的，S5中，所述的抗体作为免疫原，需用终浓度为0.25mmol/L的IPTG在20℃条件下诱导，诱导时间为20h。

结论：

本发明通过对AjAIF-1基因进行密码子优化，实现AjAIF-1的原核细胞的重组表达，并将并将表达载体转化到大肠杆菌感受态细胞中，并经过经扩大培养、诱导表达、菌体收集、菌体破碎、蛋白纯化过程，得到AjAIF-1基因表达的目的蛋白，将得到的AjAIF-1蛋白作为抗原需要对动物免疫两次，然后提取动物免疫后的血清样本，并进行ELISA效价检测，选择效价高的抗体，得到AjAIF-1多克隆抗体，本发明制备方法操作简单，且简洁明了，通过本发明方法制备的AjAIF-1多克隆抗体，不仅具有高特异性、高灵敏度，且具有一定的特异性和较高的效价，给仿刺参AjAIF-1蛋白的检测提供了的优质抗体，为仿刺参抗体的制备提供了新的方法和研究方向，进而为减少因仿刺参病害带来的经济损失和促进仿刺参养殖业的发展发挥重要作用。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。