阅读说明：本技术 一种多功能核酸基杂化纳米凝胶及其制备方法 (Multifunctional nucleic acid-based hybrid nanogel and preparation method thereof ) 是由 仰大勇 韩金鹏 崔宇辰 于 2019-09-06 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种多功能核酸基杂化纳米凝胶及其制备方法,步骤为：(1)含粘性末端的多支状核酸纳米结构的制备；(2)将步骤(1)所得的具有互补序列粘性末端的多支状核酸纳米结构进行等量混合,制备树枝状核酸网络纳米结构；(3)将步骤(2)得到的树枝状核酸网络纳米结构和多酚羟基的小分子或高分子化合物进行混合,制备多功能核酸基杂化纳米凝胶。本发明的核酸基杂化纳米凝胶,制备过程简单,方法绿色环保,通过改变树枝状核酸网络纳米结构和多酚羟基的小分子或高分子化合物的比例可精准调控纳米凝胶尺寸,实现高效的细胞摄取效率。通过充分利用核酸纳米结构的多功能性和可编程性,进行高效的基因/化学联合治疗。(The invention discloses a multifunctional nucleic acid-based hybrid nanogel and a preparation method thereof, and the preparation method comprises the following steps: (1) preparing a multi-branched nucleic acid nanostructure containing sticky ends; (2) equivalently mixing the multi-branched nucleic acid nano-structures with complementary sequence adhesive tail ends obtained in the step (1) to prepare a dendritic nucleic acid network nano-structure; (3) and (3) mixing the dendritic nucleic acid network nano structure obtained in the step (2) with micromolecules or high molecular compounds of polyphenol hydroxyl to prepare the multifunctional nucleic acid-based hybrid nano gel. The nucleic acid-based hybrid nanogel disclosed by the invention is simple in preparation process, the method is green and environment-friendly, the size of the nanogel can be accurately regulated and controlled by changing the ratio of the dendritic nucleic acid network nanostructure to the micromolecule or high-molecular compound of polyphenol hydroxyl, and the efficient cell uptake efficiency is realized. By fully utilizing the multifunctionality and programmability of nucleic acid nanostructures, efficient gene/chemical combination therapy is performed.)

一种多功能核酸基杂化纳米凝胶及其制备方法

技术领域

本发明属于核酸基纳米生物医药领域，具体涉及一种多功能核酸基杂化纳米凝胶及其制备方法。

背景技术

20世纪末以来，纳米制备与生物技术的蓬勃发展，使得纳米材料的研究越来越重要，催生出一系列的相关研究领域及产业链，在环境，能源及生物医学等领域都扮演着越来越重要的角色。纳米材料的特征尺寸在1-100nm之间，由此赋予其区别于常规尺寸材料的一些特殊物理化学特性，例如显著的表面与界面效应、小尺寸效应、量子尺寸效应以及宏观量子隧道效应等。这些特殊的性能使其在实际应用中显示出很多优势，如比表面积大，反应活性高，较强的吸附能力，较强的催化能力，以及低毒性等。随着纳米科学的进一步发展，纳米材料凭借其优异的性能，已成功在能源、信息、精细化工、生物医学等领域占据举足轻重的地位。其中，生物医学纳米材料成为近年来研究的热点，用作抗癌治疗剂，药物递送载体等。

目前，递送载体主要包括病毒载体和非病毒载体两大类。病毒载体具有安全性问题，尤其是免疫原性和致突变毒性，通常被认为是高风险的。非病毒载体主要包括有脂质体、聚合物纳米颗粒、胶束、无机纳米粒子等。但是这些载体也各有缺陷，例如较低的生物相容性，结构的不稳定性，在体内难易降解等，并还会受到注射后转染效率和全身毒性变化的限制。

发明内容

为了解决现有技术中的问题，本发明提供一种多功能核酸基杂化纳米凝胶及其制备方法，克服现有纳米载体存在的转染效率低，降解性差，结构的不稳定性以及全身毒性的问题。

本发明的技术方案概述如下：

一种多功能核酸基杂化纳米凝胶的制备方法，其制备过程主要包括三步，分别是：

(1)将等摩尔比的多条单链核酸序列进行等比例混合，加入阳离子缓冲溶液，进行聚合酶链式反应(PCR)，通过碱基互补配对的原理，制备含单链粘性末端的多支状核酸纳米结构；

(2)将步骤(1)所得的具有互补核酸序列粘性末端的多支状核酸纳米结构进行等量混合，混合温度为4～40℃，振动转速为0～3000rpm，反应时间为0.5h～3d，制备树枝状核酸网络纳米结构；

(3)将步骤(2)得到的树枝状核酸网络纳米结构和多酚羟基的小分子或高分子化合物按适当比例混合，室温下静置，制备多功能核酸基杂化纳米凝胶。

所述的单链核酸序列既存在与其它单链互补的碱基序列，同时还存在未互补的粘性末端碱基序列，两部分序列长度的比例为1:1～5:1，核酸序列的条数为2～5条，且核酸序列可以为脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。

所述的阳离子为Na⁺，Mg²⁺、Ca²⁺、Zn²⁺或Fe²⁺等的任意一至多种混合，优选为Mg²⁺；所述的缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液、醋酸盐缓冲溶液、TAE缓冲液等的任意一种或至少两种的混合，优选为TAE缓冲液。

所述多支状核酸纳米结构的等量混合指的是多支状核酸纳米结构互补的粘性末端的数量是等量混合的，确保形成均一完整的树枝状核酸网络纳米结构。

所述的多酚羟基的小分子或高分子化合物为含苯环上的酚羟基的化合物，包括没食子酸，焦性没食子酸，内啡肽，单宁酸，表没食子儿茶素没食子酸酯，茶多酚，邻苯三酚，多巴胺，3，4，5-三羟基苯丙氨酸或邻苯二酚或三酚基团改性的高分子化合物。其中邻苯二酚或三酚基团改性的高分子化合物中所指的高分子化合物包括聚乙二醇，葡聚糖，纤维素，甲基纤维素，透明质酸，壳聚糖，明教，聚乳酸，聚乙烯醇或聚乙烯吡咯烷酮。

所述的树枝状核酸网络纳米结构和多酚羟基的小分子或高分子化合物按适当比例混合，具体为树枝状核酸网络纳米结构溶液浓度为0.1μM～50μM，多酚羟基的小分子或高分子化合物溶液质量浓度为0.1w/v％～50w/v％，两者混合体积比为(1～100):(1～100)。

根据上述方法制备得到的多功能核酸基杂化纳米凝胶。

本发明的有益效果：本发明方法通过改变所用物质的不同配比即可精准调节纳米颗粒的尺寸大小从而形成核酸-多酚羟基化合物纳米材料，制备的多功能核酸基杂化纳米凝胶，可以弥补其他载体的局限性，充分发挥其高度的生物相容性，结构可设计性，以及功能可编程性，用于基因或药物的高效递送系统。

本发明采用绿色环保的方法制备一种新型的多功能核酸基杂化纳米凝胶，其制备过程简单，制备方法绿色环保，通过改变树枝状核酸网络纳米结构和多酚羟基的小分子或高分子化合物的比例可精准调控纳米凝胶尺寸，实现高效的细胞摄取效率。此外，通过充分利用核酸纳米结构的多功能性和可编程性，该纳米凝胶可同时负载多种具有不同生物效应的核酸序列，同时其核酸碱基的疏水性可负载疏水性药物，进行高效的基因/化学联合治疗，在纳米生物医药领域具有十分广泛的应用前景。

本发明的设计原理是充分利用核酸分子碱基互补配对以及可编程性原则，通过其与多酚羟基化合物或其衍生物间的氢键、π-π堆积等相互作用形成一种新型的核酸纳米材料，并可通过调节多酚羟基化合物或其衍生物与核酸分子的浓度配比，来调节核酸纳米颗粒的尺寸大小。

附图说明

图1为实施例1中对树枝状DNA网络纳米结构制备过程的各个阶段的产物进行了凝胶电泳表征；

图2为实施例1制备的多功能DNA杂化纳米凝胶的扫描电镜(SEM)的形貌图；

图3为实施例4制备的RNA基的杂化纳米凝胶的投射电子显微镜(TEM)的形貌图；

图4为实施例5制备的DNA-RNA杂化纳米凝胶的不同尺寸纳米凝胶的动态粒径统计结果图(DLS)，通过改变核酸的含量可以调整纳米凝胶的尺寸；

图5为实施例6制备的DNA基的杂化纳米凝胶的负载抗癌药物阿霉素(DOX)后在不同pH条件下的药物释放曲线。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。

下面的实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但并不对本发明作任何限制。

一种多功能核酸基杂化纳米凝胶的制备方法，包括如下步骤：

(1)含单链粘性末端的多支状核酸纳米结构的制备：将等摩尔比的多条单链核酸序列进行等比例混合，加入阳离子缓冲溶液，进行聚合酶链式反应(PCR)，通过碱基互补配对的原理，制备含单链粘性末端的多支状核酸纳米结构；

(2)树枝状核酸网络纳米结构的制备：将步骤(1)所得的具有互补核酸序列粘性末端的多支状核酸纳米结构进行等量混合，混合温度为4～40℃，振动转速为0～3000rpm，反应时间为0.5h～3d，制备树枝状核酸网络纳米结构；

(3)多功能核酸基杂化纳米凝胶的制备：将步骤(2)得到的树枝状核酸网络纳米结构和多酚羟基的小分子或高分子化合物按适当比例混合，室温下静置，制备多功能核酸基杂化纳米凝胶。

多功能核酸基杂化纳米凝胶的制备都可以采用上述方法。本发明公开上述方法是为了使本领域的技术人员能够实施，但并不对本发明作任何限定。

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步的说明。

实施例1

一种多功能核酸基杂化纳米凝胶的制备方法，包括如下步骤：

(1)将等摩尔比的3条DNA单链核酸序列进行等比例混合，加入含Na⁺的磷酸盐缓冲溶液，进行聚合酶链式反应，制备含单链粘性末端的三支状DNA纳米结构；将等摩尔比的2条DNA单链核酸序列进行等比例混合，加入含Na⁺的磷酸盐缓冲溶液，进行聚合酶链式反应，制备含单链粘性末端的二支状DNA纳米结构。该二支状DNA纳米结构粘性末端与三支状DNA纳米结构的粘性末端互补，每条DNA序列中与其它单链互补的碱基长度与其自身粘性末端DNA序列长度的比为1:1。

(2)将步骤(1)所得的具有互补DNA序列粘性末端的三支和二支状DNA纳米结构，按照粘性末端比例进行等量混合，混合温度为4℃，振动转速为0rpm，反应时间为0.5h，制备树枝状DNA网络纳米结构；

(3)将步骤(2)得到的树枝状DNA网络纳米结构和单宁酸按适当比例混合，室温下静置，制备多功能DNA基杂化纳米凝胶。树枝状DNA网络纳米结构溶液浓度为0.1μM，单宁酸溶液质量浓度为0.1w/v％，两者混合体积比为1：1。

本实施示例对树枝状DNA网络纳米结构制备过程的各个阶段的产物进行了凝胶电泳表征(图1)。电泳条带Y_A,Y_B,和Y_C分别为构筑三支状DNA纳米结构的三条单链，电泳条带Y为由该三条单链构成的三支状DNA纳米结构。电泳条带L₁和L₂为构筑二支状DNA纳米结构的两条单链，电泳条带L为由该两条链构成的二支状DNA纳米结构。将具有互补DNA序列粘性末端的三支和二支状DNA纳米结构，按照粘性末端比例进行等量混合半小时，制备得到Y-L的条带对应的树枝状DNA网络纳米结构，从电泳胶图中可以明显看出高分子量的电泳条带产生，证明树枝状DNA网络纳米结构的成功合成。将其与单宁酸混合，制备得到尺寸较为均匀的多功能DNA基杂化纳米凝胶，通过SEM表征可以知道该纳米凝胶的尺寸为200nm左右(图2)。

实施例2

一种多功能核酸基杂化纳米凝胶的制备方法，包括如下步骤：

(1)将等摩尔比的5条DNA单链核酸序列进行等比例混合，加入含Mg²⁺的TAE缓冲溶液，进行聚合酶链式反应，制备含单链粘性末端的五支状DNA纳米结构；将等摩尔比的2条DNA单链核酸序列进行等比例混合，加入含Mg²⁺的TAE缓冲溶液，进行聚合酶链式反应，制备含单链粘性末端的二支状DNA纳米结构。该二支状DNA纳米结构粘性末端与五支状DNA纳米结构的粘性末端互补，每条DNA序列中与其它单链互补的碱基长度与其自身粘性末端DNA序列长度的比为5:1。

(2)将步骤(1)所得的具有互补DNA序列粘性末端的五支和二支状DNA纳米结构，按照粘性末端比例进行等量混合，混合温度为40℃，振动转速为3000rpm，反应时间为3d，制备树枝状DNA网络纳米结构；

(3)将步骤(2)得到的树枝状DNA网络纳米结构和焦性没食子酸按适当比例混合，室温下静置，制备多功能DNA基杂化纳米凝胶。树枝状DNA网络纳米结构溶液浓度为50μM，单宁酸溶液质量浓度为50w/v％，两者混合体积比为1：100。

实施例3

一种多功能核酸基杂化纳米凝胶的制备方法，包括如下步骤：

(1)将等摩尔比的3条DNA单链核酸序列进行等比例混合，加入含Na⁺的TAE缓冲溶液，进行聚合酶链式反应，制备含单链粘性末端的三支状DNA纳米结构；将等摩尔比的2条RNA单链核酸序列进行等比例混合，加入含Na⁺的TAE缓冲溶液，进行聚合酶链式反应，制备含单链粘性末端的二支状RNA纳米结构。该二支状RNA纳米结构粘性末端与三支状DNA纳米结构的粘性末端互补，每条DNA或RNA序列中与其它单链互补的碱基长度与其自身粘性末端序列长度的比为3:1。

(2)将步骤(1)所得的具有互补碱基序列粘性末端的三支DNA纳米结构和二支状RNA纳米结构，按照粘性末端比例进行等量混合，混合温度为25℃，振动转速为1000rpm，反应时间为24h，制备树枝状DNA-RNA网络纳米结构；

(3)将步骤(2)得到的树枝状DNA-RNA网络纳米结构和表没食子儿茶素没食子酸酯按适当比例混合，室温下静置，制备多功能DNA-RNA基杂化纳米凝胶。树枝状DNA-RNA网络纳米结构溶液浓度为5μM，单宁酸溶液质量浓度为5w/v％，两者混合体积比为1：50。

实施例4

一种多功能核酸基杂化纳米凝胶的制备方法，包括如下步骤：

(1)将等摩尔比的4条RNA单链核酸序列进行等比例混合，加入含Na⁺的醋酸盐缓冲溶液，进行聚合酶链式反应，制备含单链粘性末端的四支状RNA纳米结构；将等摩尔比的3条RNA单链核酸序列进行等比例混合，加入含Na⁺的醋酸盐缓冲溶液，进行聚合酶链式反应，制备含单链粘性末端的三支状RNA纳米结构。该四支状RNA纳米结构粘性末端与三支状RNA纳米结构的粘性末端互补，每条RNA序列中与其它单链互补的碱基长度与其自身粘性末端序列长度的比为4:1。

(2)将步骤(1)所得的具有互补碱基序列粘性末端的四支RNA纳米结构和三支状RNA纳米结构，按照粘性末端比例进行等量混合，混合温度为25℃，振动转速为1200rpm，反应时间为3h，制备树枝状RNA网络纳米结构；

(3)将步骤(2)得到的树枝状RNA网络纳米结构和邻苯二酚改性的壳聚糖按适当比例混合，室温下静置，制备多功能RNA基杂化纳米凝胶。树枝状RNA网络纳米结构溶液浓度为1μM，单宁酸溶液质量浓度为1w/v％，两者混合体积比为100：1。

本实施示例对制备得到的多功能RNA基杂化纳米凝胶进行了TEM形貌表征，通过TEM的形貌分析可知，制备的纳米凝胶形貌均匀，为球形结构，粒径大约为150nm，证明了RNA纳米凝胶的成功制备(图3)。

实施例5

一种多功能核酸基杂化纳米凝胶的制备方法，包括如下步骤：

(1)将等摩尔比的3条DNA单链核酸序列进行等比例混合，加入含Na⁺的磷酸盐缓冲溶液，进行聚合酶链式反应，制备含单链粘性末端的三支状DNA纳米结构；将等摩尔比的2条RNA单链核酸序列进行等比例混合，加入含Na⁺的磷酸盐缓冲溶液，进行聚合酶链式反应，制备含单链粘性末端的二支状RNA纳米结构。该二支状RNA纳米结构粘性末端与三支状DNA纳米结构的粘性末端互补，每条DNA或RNA序列中与其它单链互补的碱基长度与其自身粘性末端DNA序列长度的比为3:1。

(2)将步骤(1)所得的具有互补碱基序列粘性末端的三支DNA纳米结构和二支状RNA纳米结构，按照粘性末端比例进行等量混合，混合温度为25℃，振动转速为1200rpm，反应时间为8h，制备树枝状DNA-RNA网络纳米结构；

(3)将步骤(2)得到的树枝状DNA-RNA网络纳米结构和单宁酸按适当比例混合，室温下静置，制备多功能DNA-RNA基杂化纳米凝胶。单宁酸溶液质量浓度为1w/v％，树枝状DNA网络纳米结构溶液浓度为分别为1，2.5，5和10μM，两者混合体积比为1：1，以制备不同粒径尺寸的纳米凝胶。

本实施示例对制备的多功能DNA-RNA基杂化纳米凝胶进行了粒径表征，固定单宁酸的含量，通过改变树枝状DNA-RNA网络纳米结构的含量，来调控纳米凝胶的粒径，发现提高核酸的含量是可以增加纳米凝胶的尺寸，实现了对纳米凝胶尺寸的精准调控(图4)。

实施例6

一种多功能核酸基杂化纳米凝胶的制备方法，包括如下步骤：

(1)将等摩尔比的3条DNA单链核酸序列进行等比例混合，加入含Na⁺的磷酸盐缓冲溶液，进行聚合酶链式反应，制备含单链粘性末端的三支状DNA纳米结构；将等摩尔比的2条DNA单链核酸序列进行等比例混合，加入含Na⁺的磷酸盐缓冲溶液，进行聚合酶链式反应，制备含单链粘性末端的二支状DNA纳米结构。该二支状DNA纳米结构粘性末端与三支状DNA纳米结构的粘性末端互补，每条DNA序列中与其它单链互补的碱基长度与其自身粘性末端DNA序列长度的比为4:1。

(2)将步骤(1)所得的具有互补DNA序列粘性末端的三支和二支状DNA纳米结构，按照粘性末端比例进行等量混合，混合温度为37℃，振动转速为1200rpm，反应时间为7h，制备树枝状DNA网络纳米结构；

(3)将步骤(2)得到的树枝状DNA网络纳米结构和单宁酸按适当比例混合，室温下静置，制备多功能DNA基杂化纳米凝胶。树枝状DNA网络纳米结构溶液浓度为1μM，单宁酸溶液质量浓度为1w/v％，两者混合体积比为5：1。将制备的纳米凝胶负载抗癌药物阿霉素(DOX)，在不同pH条件下进行释放实验。

本实施示例对纳米凝胶的pH响应性进行了验证，实验结果显示在酸性条件下，纳米凝胶释放DOX的速率明显加快，具有明显的酸响应性，未来在针对肿瘤的药物和基因联合治疗方面具有很大的应用前景，因为其具有肿瘤酸性微环境的响应性(图5)。

实验证明，实施例1-5制备得到的多功能的核酸基的杂化纳米凝胶均可以实现对药物可控缓慢用途，并展现出明显的酸性环境响应性。