阅读说明：本技术 一种β-甘露聚糖酶密码子优化序列及提高毕赤酵母工程菌表达水平的方法 (Beta-mannase codon optimization sequence and method for improving pichia pastoris engineering bacteria expression level ) 是由 郑宏臣 宋诙 徐健勇 甄杰 付晓平 于 2018-07-02 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物技术领域,具体公开了一种β-甘露聚糖酶密码子优化序列及提高毕赤酵母工程菌表达水平的方法。本发明为提高耐热酸性β-甘露聚糖酶Man5AS11R在毕赤酵母工程菌中的诱导表达量,首先应用Gene Designer(DNA2.0,Menlo Park,CA,USA)软件对man5AS11R基因的核苷酸序列进行密码子偏向性优化,通过pPIC9k-man5AS11R-opt重组载体,成功构建了毕赤酵母工程菌GS115/man5AS11R-opt。在此基础上,通过重组载体pPICZ-αA-vgb在菌株GS115/man5AS11R-opt中完成了血红蛋白VHb的共表达,显著促进了毕赤酵母工程菌发酵过程中的溶氧水平,提高了该工程菌发酵密度和产量,10L发酵罐发酵产酶达到20000U/mL以上,较原始菌株GS115/man5AS11R产量提高了一倍,显示了良好的产业化生产前景。(The invention relates to the technical field of biology, and particularly discloses a beta-mannase codon optimization sequence and a method for improving the expression level of pichia pastoris engineering bacteria. In order to improve the inducible expression quantity of the heat-resistant acidic beta-mannase Man5AS11R in pichia pastoris engineering bacteria, firstly, Gene Designer (DNA2.0, Menlo Park, CA, USA) software is applied to perform codon bias optimization on a nucleotide sequence of Man5AS11R Gene, and through a pPIC9k-Man5AS11R-opt recombinant vector, the pichia pastoris engineering bacteria GS115/Man5AS11R-opt is successfully constructed. On the basis, the co-expression of the hemoglobin VHb is completed in the strain GS115/man5AS11R-opt through the recombinant vector pPICZ-alpha A-vgb, the dissolved oxygen level in the fermentation process of the pichia pastoris engineering bacteria is obviously promoted, the fermentation density and the yield of the engineering bacteria are improved, the fermentation enzyme production of a 10L fermentation tank reaches over 20000U/mL, the yield is doubled compared with the yield of the original strain GS115/man5AS11R, and the good industrial production prospect is displayed.)

一种β-甘露聚糖酶密码子优化序列及提高毕赤酵母工程菌表 达水平的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种β-甘露聚糖酶密码子优化序列及提高毕赤酵母工程菌表达水平的方法。

背景技术

近年来随着对自然界半纤维素资源的开发、利用，饲粮中甘露聚糖抗营养因子的消除以及甘露低聚糖药用价值的发现，使得对β-甘露聚糖酶的需求量越来越大。目前，市场上β-甘露聚糖酶商品酶制剂有美国chengem公司生产的和美酵素，还有国内博士奥集团生产的华分酶及挑战集团的β-甘露聚糖酶等，但因为产量小，产品的相对价格很高，大大降低了该酶的应用范围。

毕赤酵母表达系统已经发展成为一个成熟的外源蛋白表达系统，工业上常用来大规模表达外源蛋白。但对于一些来源于细菌的基因，其表达水平往往偏低，即使经过密码子优化，而不一定能够达到理想的表达水平。另外，毕赤酵母的高密度发酵也是实现外源蛋白高水平表达的关键，而毕赤酵母在高密度发酵时需要消耗大量氧气，溶氧的水平常常直接影响异源蛋白的表达水平。因此，应用透明颤菌的血红蛋白 （Vitreoscialla hemoglobin,VHb）作为一种氧调节蛋白，理论上可以结合游离氧，从而使发酵液中的氧含量提高，改善细胞生长条件，促进细胞总蛋白的合成和外源蛋白的积聚。

发明内容

1.本发明的目的在于提供一种提高耐热酸性β-甘露聚糖酶Man5AS11R在毕赤酵母工程菌中表达水平的方法，其具体步骤如下：

（1）对man5AS11R基因的核酸序列进行针对毕赤酵母菌的密码子优化，得到优化后的编码序列man5AS11R-opt，如SEQ ID NO.1所示：

ACTGGTTTCTACGTTAACGGTGGTAAGTTGTACGACTCTACTGGTTGTCC 50

ATTCTACATCGTTGGTATCAACCACGGTCACTCTTGGTTCAAGAACGACA 100

CTGCTACTGCTATCCCAGCTATCGCTAAGACTGGTGCTAACACTGTTAGA 150

ATCGTTTTGTCTAACGGTACTCAATACACTAAGGACGACTTGAACTCTGT 200

TAAGAACATCATCAACTTGGCTGAAGAAAACAAGATCGACGCTGTTTTGG 250

AAGTTCACGACGCTACTGGTAAGGACGACTTCAACTCTTTGGACGCTGCT 300

GTTAACTACTGGATCTCTATCAAGGAAGCTTTGATCGGTAAGGAAGACAG 350

AGTTATCGTTAACATCGCTAACGAATGGTACGGTACTTGGAACGGTTCTG 400

CTTGGGCTGACGGTTACAAGAAGGCTATCCCAAAGTTGAGAGACGCTGGT 450

ATCAAGAACACTTTGATCGTTGACGCTGCTGGTTGGGGTCAATACCCACA 500

ATCTATCGTTGACTACGGTCAATCTGTTTTCGCTGCTGACTCTCAAAAGA 550

ACACTGCTTTCTCTATCCACATCTACGAATACGCTGGTAAGGACGCTGCT 600

ACTGTTAAGTCTAACATCGAAAACGTTTTGAACAAGGGTTTGGCTTTGAT 650

CGAAGGTGAATTCGGTGGTTACCACACTAACGGTGACGTTGACGAATACG 700

CTATCATCAAGTACGGTTTGGAAAAGGGTGTTGGTTGGTTGGCTTGGTCT 750

TGGTACGGTAACGGTATCAAGTGGAACTACTTGGACTTGGCTACTGGTCC 800

AAACGGTTCTTTGACTTCTTACGGTAACACTGTTGTTAACGACACTTACG 850

GTATCAAGAACACTTCTCAAAAGGCTGGTATCTTCTGTGGTGACGACGGT 900

GTTGGTGACGGTGGTCCAGGTGACTCTAACGGTACTAAGACTACTTTGTA 950

CAACTTCGAAACTGGTACTGAAGGTTGGTCTGGTAAGAACATCGAAACTG 1000

GTCCATGGTCTGTTAACGAATGGGCTGCTAAGGGTAACCACTCTTTGAAG 1050

GCTGACGTTAACTTGGGTGACAACTCTGAACACTACTTGAAGTTGACTCA 1100

AAACTTGAACTTCTCTGGTAAGTCTCAATTGACTGCTACTGTTAAGCACG 1150

CTGACTGGGGTAACTTCGGTGACGAAATCAACGCTAAGTTGTACGTTAAG 1200

ACTGAATCTGACTGGTAA 1218

（2）应用优化后序列man5AS11R-opt构建重组表达载体pPIC9k-man5AS11R-opt，并将其转化到毕赤酵母GS115中，得到重组表达菌株GS115/man5AS11R-opt；

（3）将透明颤菌的血红蛋白基因vgb（GenBank AY278220）合成到载体pPICZ-αA的多克隆位点中，将其转化到GS115/man5AS11R-opt工程菌中，得到高产工程菌GS115/man5AS11R-opt-VHb。

2. 高产工程菌GS115/man5AS11R-opt-VHb较原始菌株GS115/man5AS11R产量提高了一倍，10L发酵罐酶活可达到20000U/ml以上。

附图说明

图1 Man5AS11R和VHb共表达的重组载体构建

图2 Man5AS11R密码子优化后的10L发酵罐产酶情况

图3 Man5AS11R和VHb共表达的10L发酵罐产酶情况

图4 Man5AS11R密码子优化后和VHb共表达的10L发酵罐产酶情况。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1 Man5AS11R和VHb共表达的重组载体构建

通过PCR技术扩增出man5AS11R基因序列，两端分别是EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点，双酶切纯化后与同样双酶切的pPIC9k载体连接，构建克隆载体pPIC9k-man5AS11R，转化Escherichiacoli DH5α感受态细胞，挑取单克隆进行PCR鉴定和酶切鉴定，基因测序正确后获得构建成功的融合表达质粒。VHb基因GenBank收录号为AY278220.1，由华大基因合成。合成的VHb基因两端含有BstBⅠ和NotⅠ酶切位点。双酶切纯化后将VHb片段与同样双酶切的pPICZ载体连接，构建克隆载体pPICZ–VHb。转化Escherichia coli DH5α感受态细胞，挑取单克隆进行PCR、酶切鉴定和基因测序，获得正确的融合载体。重组载体如图1所示，将构建好的两个重组载体线性化后，先后转化到毕赤酵母GS115中，得到高产工程菌GS115/man5AS11R-opt-VHb。

实施例2 GS115/man5AS11R-opt的10L发酵罐产酶

将GS115/man5AS11R与GS115/man5AS11R-opt分别进行10L发酵罐的诱导产酶发酵，结果如图2所示，GS115/man5AS11R-opt发酵120h甘露聚糖酶酶活最高达到14641U/ml，较GS115/man5AS11R发酵120h的酶活提高了38%，可见密码子优化可显著提高Man5AS11R在毕赤酵母中的表达水平。

实施例3 GS115/man5AS11R- VHb的10L发酵罐产酶

将GS115/man5AS11R与GS115/man5AS11R-VHb分别进行10L发酵罐的诱导产酶发酵，结果如图3所示，GS115/man5AS11R-VHb发酵120h甘露聚糖酶酶活最高达到15641U/ml，较GS115/man5AS11R发酵120h的酶活提高了48%，可见共表达VHb可显著提高Man5AS11R在毕赤酵母中的表达水平。

实施例4 GS115/man5AS11R-opt-VHb的10L发酵罐产酶

将GS115/man5AS11R与GS115/man5AS11R-opt-VHb分别进行10L发酵罐的诱导产酶发酵，结果如图4所示，GS115/man5AS11R-VHb发酵120h甘露聚糖酶酶活最高达到20760U/ml，较GS115/man5AS11R发酵120h的酶活提高了1倍，可见密码子优化和VHb共表达相结合可显著提高Man5AS11R在毕赤酵母中的表达水平，使高产工程菌GS115/man5AS11R-opt-VHb具有良好的产业化生产前景。

以上说明对本发明而言只是说明性的，而非限制性的，对于本领域普通技术人员来说，在不脱离所附权利要求限定的精神和范围情况下，可做成许多修改、变化或等效，但都将落在本发明的保护范围和公开范围之内。

序列表

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 一种β-甘露聚糖酶密码子优化序列及提高毕赤酵母工程菌表达水平的方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 3

<211> 1218

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

actggtttct acgttaacgg tggtaagttg tacgactcta ctggttgtcc attctacatc 60

gttggtatca accacggtca ctcttggttc aagaacgaca ctgctactgc tatcccagct 120

atcgctaaga ctggtgctaa cactgttaga atcgttttgt ctaacggtac tcaatacact 180

aaggacgact tgaactctgt taagaacatc atcaacttgg ctgaagaaaa caagatcgac 240

gctgttttgg aagttcacga cgctactggt aaggacgact tcaactcttt ggacgctgct 300

gttaactact ggatctctat caaggaagct ttgatcggta aggaagacag agttatcgtt 360

aacatcgcta acgaatggta cggtacttgg aacggttctg cttgggctga cggttacaag 420

aaggctatcc caaagttgag agacgctggt atcaagaaca ctttgatcgt tgacgctgct 480

ggttggggtc aatacccaca atctatcgtt gactacggtc aatctgtttt cgctgctgac 540

tctcaaaaga acactgcttt ctctatccac atctacgaat acgctggtaa ggacgctgct 600

actgttaagt ctaacatcga aaacgttttg aacaagggtt tggctttgat cgaaggtgaa 660

ttcggtggtt accacactaa cggtgacgtt gacgaatacg ctatcatcaa gtacggtttg 720

gaaaagggtg ttggttggtt ggcttggtct tggtacggta acggtatcaa gtggaactac 780

ttggacttgg ctactggtcc aaacggttct ttgacttctt acggtaacac tgttgttaac 840

gacacttacg gtatcaagaa cacttctcaa aaggctggta tcttctgtgg tgacgacggt 900

gttggtgacg gtggtccagg tgactctaac ggtactaaga ctactttgta caacttcgaa 960

actggtactg aaggttggtc tggtaagaac atcgaaactg gtccatggtc tgttaacgaa 1020

tgggctgcta agggtaacca ctctttgaag gctgacgtta acttgggtga caactctgaa 1080

cactacttga agttgactca aaacttgaac ttctctggta agtctcaatt gactgctact 1140

gttaagcacg ctgactgggg taacttcggt gacgaaatca acgctaagtt gtacgttaag 1200

actgaatctg actggtaa 1218