阅读说明：本技术 一种血型检测卡及其制备方法 (Blood type detection card and preparation method thereof ) 是由 王小波 毛亚琳 黄谦 于 2019-09-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种用于血型检测的凝胶微球,其微球上连接有血型抗体。本发明还公开了一种用于血型检测的凝胶微球的制备方法,包括如下步骤：包括如下步骤：1)活化位于凝胶微球表面的基团,使所述基团能够与血型抗体发生化学反应而相接合；2)将血型抗体与被活化的基团相接合；3)使用封闭剂封闭未接合血型抗体的被活化的基团,洗涤,得到可特异性结合血型抗原的凝胶。本发明的血型检测卡相比现有的血型检测卡,具有更高的稳定性、灵敏度,应用前景良好。(The invention discloses a gel microsphere for blood type detection, which is connected with a blood type antibody. The invention also discloses a preparation method of the gel microsphere for blood type detection, which comprises the following steps: the method comprises the following steps: 1) activating groups on the surface of the gel microsphere to enable the groups to be combined with the blood group antibody through chemical reaction; 2) binding the blood group antibody to the activated group; 3) blocking the activated groups of the unbound blood group antibodies with a blocking agent, and washing to obtain a gel capable of specifically binding blood group antigens. Compared with the existing blood type detection card, the blood type detection card has higher stability and sensitivity and good application prospect.)

一种血型检测卡及其制备方法

技术领域

本发明属于输血检测领域，涉及一种血型检测卡的制备方法，检测的血型包括但不限于ABO血型系统的检测和Rh血型系统D、C、c、E、e抗原的检测。

背景技术

众所周知，血型检测与输血密切相关，在所有可能需要输血的手术前，都必须由输血科提供有效的血型检测结果。若受血者输入异体供血者血液时，可能产生同种异体抗体，发生输血性不良反应，其中最严重的是ABO、RhD血型不合所导致的急性或迟发性溶血反应。因此，检测血型有非常重要的临床意义。

至今为止，发现的人类血型系统已有30多种。ABO血型系统是最先发现，也是最重要的血型系统，根据红细胞上有无A抗原、B抗原将血型分为A型、B型、AB型和O型。Rh血型系统是最为复杂的血型系统，也是除ABO血型系统以外最重要的血型系统，根据红细胞上有无D抗原将血型分为RhD阳性和RhD阴性。Rh血型系统中，D、C、c、E、e是Rh血型系统中五种最重要的抗原，有重要的临床意义。当受血者输入异体供血者血液时，可能产生同种异体抗体，如D、C、c、E、e抗原阴性的个体输入相应抗原阳性的红细胞时，受相应抗原的刺激可产生相应的免疫性抗体，发生溶血性输血反应。对Rh系统的D、C、c、E、e五种抗原进行检测，以达到同型输血的目的，可有效减少溶血性输血反应的发生。

目前国内各级医院进行血型检查的方法有盐水法、聚凝胺法、蛋白酶法、微柱凝胶法等。微柱凝胶法相比传统的盐水法和聚凝胺法更简单、更敏感、更准确，且结果可长期保存，目前其应用最广，也是FDA的推荐方法。随着该技术配套的全自动血型分析仪的问世，血型分析卡式微柱离心法在全世界范围内得到了广泛应用，深受广大用户的好评。

微柱凝胶法的原理是：红细胞加入到与其表面抗原对应的抗体体系中时，红细胞会发生凝集，而加入到不含对应的抗体体系中时，红细胞不会发生凝集，利用凝胶的空间位阻，经低速离心后，凝集的红细胞分布于凝胶上层，未凝集的红细胞则沉于凝胶底部，因此可以通过检测红细胞是位于凝胶上层还是凝胶底部来判断其表面抗原。

现有的微柱凝胶法的灵敏度高度依赖凝胶介质(凝胶微球)的粒径：凝胶微球体积越小，其空间位阻越大，其制备的检测卡灵敏度越高，但容易造成假阳性；凝胶微球体积越大，其空间位阻越小，其制备的检测卡灵敏度越低，又容易造成假阴性。然而，凝胶微球生产工艺复杂，批间差异的控制比较困难，导致不同批次的凝胶微球的粒径差异较大，因而试剂卡的灵敏度会随原料的批间差异而明显变化，影响检测结果的准确性，也不利于检测结果的标准化。

因此，急需对现有的微柱凝胶法进行改进，克服结果不准确、难以标准化的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的血型检测卡，它能克服前述的假阴性，并进一步克服其带来的批次间不稳定的问题。

本发明的技术方案包括：

一种用于血型检测的凝胶微球，凝胶微球上连接有血型抗体。

进一步地，所述血型抗体选自下述抗体中的一种或多种：针对ABO血型的抗A抗体、抗B抗体，Rh血型的抗D抗体、抗C抗体、抗c抗体、抗E抗体、抗e抗体。

如前述的微球，血型抗体与凝胶微球通过位于二者表面的基团反应相连；

优选地，凝胶微球表面的基团为甲苯磺酰基、环氧基、羧基、氨基或链霉亲和素。

如前述的微球，微球表面还连接了封闭剂，封闭剂与微球表面的基团反应连接，封闭剂所反应的微球表面的基团与抗体所反应的基团相同；

优选地，所述的封闭剂为非蛋白类封闭剂。

如前所述的微球，血型抗体与凝胶微球通过微球表面的羧基与血型抗体的氨基反应连接；所述封闭剂为可结合羧基的非蛋白类封闭剂，优选为带氨基的化合物，进一步优选为带氨基的聚乙二醇，比如：JSR公司的Blockmaster CE210或JSR公司的BlockmasterCE510。

如前所述的微球，所述的凝胶微球是葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶微球；优选为羧基聚丙烯酰胺凝胶微球。

一种血型检测卡，所述检测卡中的微球是前述微球。

一种用于血型检测的凝胶微球的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)活化位于凝胶微球表面的基团，使所述基团能够与血型抗体发生化学反应而相接合；

2)将血型抗体与被活化的基团相接合；

3)使用封闭剂封闭未接合血型抗体的被活化的基团，洗涤，得到可特异性结合血型抗原的凝胶；

优选地，步骤1)所述的基团选自甲苯磺酰基、环氧基、羧基、氨基和链霉亲和素中的一种或两种以上；

进一步优选地，步骤1)所述的基团为羧基；进一步优选地，步骤2)活化羧基所用试剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐；

更进一步优选地，步骤3)所述封闭剂为可结合羧基的非蛋白类封闭剂，优选为带氨基的化合物，进一步优选为带氨基的聚乙二醇；更进一步优选地，步骤3)所述封闭剂是JSR公司的Blockmaster CE210(简称“CE210”)或JSR公司的Blockmaster CE510(简称“CE510”)。

如前述的凝胶微球的制备方法，所述血型抗体选自下述抗体中的一种或多种：针对ABO血型的抗A抗体、抗B抗体，Rh血型的抗D抗体、抗C抗体、抗c抗体、抗E抗体、抗e抗体。

如前述的凝胶微球的制备方法：

步骤1)所述凝胶微球是羧基聚丙烯酰胺凝胶微球；

和/或，步骤2)使用终浓度为0.25-1mg/ml的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐活化所述基团。

如前述的凝胶微球的制备方法：

步骤1)所述微球粒径X10为20.9-85.6微米；

和/或，所述微球粒径X90为90.1-180.3微米；

和/或，所述微球平均粒径为53.3-150.9微米；

所述X10指粒径最小的10％的微球的最大粒径；

所述X90指粒径最小的90％的微球的最大粒径。

一种血型检测卡的制备方法，它是使用前述的凝胶微球，或使用前述的凝胶微球的制备方法制备得到的凝胶微球，与缓冲液混合，灌装于验血卡片的离心管内即可；

所述缓冲液中，缓冲盐选自吗啉乙磺酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化钠中的一种或多种；

优选的，凝胶微球与缓冲液混合后，沉淀与上清的比例是2∶(0.5-2)；更进一步优选地，沉淀与上清的比例是2∶1。

本发明在血型检测卡的凝胶微球上固定抗体，大大地减少了凝胶微球粒径对检测灵敏度的影响，克服了凝胶微球的粒径差异带来的检测稳定性差的问题。

本发明特定的制备方法下，尤其是在特定的活化(25～100μl 10mg/ml的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐进行活化)和封闭(CE210和CE510作为封闭剂)步骤参数下，不仅保证了阳性信号的准确呈现，还保证了阴性对照背景清晰、无拖尾。检测效果总的来说，辨识度高，稳定性好。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的

具体实施方式

，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1是凝集强度4+对应的检测效果图。

图2是凝集强度3+对应的检测效果图。

图3是凝集强度2+对应的检测效果图。

图4是凝集强度1+对应的检测效果图。

图5是凝集强度+/-对应的检测效果图。

图6是凝集强度Dcp对应的检测效果图。

图7是凝集强度H对应的检测效果图。

图8是凝集强度-对应的检测效果图。

具体实施方式

实施例1本发明血型检测卡的制备方法

本实施例选用羧基聚丙烯酰胺凝胶微球为原料进行制备。

1.凝胶微球的洗涤：

参照下表配制buffer 1。

操作方法：取适量凝胶微球悬液于离心管内，常温下270g离心5分钟，去除上清液，然后加入和凝胶等体积的上述buffer1，混匀后置于滚轴混匀仪滚动5分钟，再次270g/5min去除上清液。按照此步骤重复洗涤3次。

目的：此步骤主要用于置换凝胶微球的保存液，避免保存液中的某些成分对后续偶联抗体造成影响。

2.凝胶微球的活化

将buffer1等体积悬浮凝胶微球，然后加入10mg/ml的EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，用buffer1配制)。EDC用量推荐：每1ml凝胶悬液，可加入25～100μlEDC，最佳使用量为50μl。加入EDC后置于滚轴混匀仪上反应30分钟进行凝胶微球表面基团(后文称“功能基团”，在本实施例中为羧基)的活化。活化完成后，用上述buffer 1洗涤凝胶微球3次，去除多余的EDC。

2.1 EDC用量筛选

实验方法：在活化过程中，分别加入不同量的EDC活化表面功能基团，耦联血型抗体(抗A单克隆抗体，效价128)，CE210封闭未结合抗体的功能基团后，与吗啉乙磺酸钠缓冲液混合(静置后，微球与上清体积比2∶1)，灌注到一次性验血卡片，制备得到检测卡，根据制备过程中凝胶微球的分布状态和成品卡样本检测结果来判断EDC的最佳用量。

EDC主要用于活化凝胶微球表面的功能基团，为后面与抗体偶联打下基础。从上表实验数据可看出EDC的用量很关键，用量少会导致凝胶微球表面功能基团活化不充分，抗体偶联不完全，造成试剂卡灵敏度偏低，而用量过大会使凝胶微球聚集，影响偶联抗体。

3.抗体偶联

3.1抗体工作液稀释：参照商品化抗体质检报告上的效价，将抗A单克隆抗体、抗B单克隆抗体、抗D单克隆抗体用生理盐水稀释到效价为128(效价128及以上均可，考虑到试剂卡灵敏度以及成本，效价为128最佳)；抗C单克隆抗体、抗c单克隆抗体、抗E单克隆抗体、抗e单克隆抗体用生理盐水稀释到效价为8(效价8及以上均可，考虑到试剂卡灵敏度以及成本，效价为8最佳)。

3.1.1抗体包被浓度筛选

实验方法：根据抗体质检报告上的效价，将抗体倍比稀释到不同效价，CE210封闭未结合抗体的功能基团后，与吗啉乙磺酸钠缓冲液混合(静置后，微球与上清体积比2∶1)，灌注到一次性验血卡片，制备得到检测卡，根据样本检测结果和检测卡的稳定性来判断各抗体的最佳用量。

抗A单克隆抗体

抗B单克隆抗体

效价

16

32

64

128

256

512

灵敏度

低

低

高

高

高

高

稳定性

差

差

较好

好

好

好

判断

不合格

不合格

不合格

合格

合格

合格

抗D单克隆抗体

效价

16

32

64

128

256

512

灵敏度

低

低

高

高

高

高

稳定性

差

差

较好

好

好

好

判断

不合格

不合格

不合格

合格

合格

合格

抗C单克隆抗体

效价

1

2

4

8

16

32

灵敏度

低

低

高

高

高

高

稳定性

差

差

差

好

好

好

判断

不合格

不合格

不合格

合格

合格

合格

抗c单克隆抗体

效价

1

2

4

8

16

32

灵敏度

低

低

高

高

高

高

稳定性

差

差

差

好

好

好

判断

不合格

不合格

不合格

合格

合格

合格

抗E单克隆抗体

效价

1

2

4

8

16

32

灵敏度

低

低

高

高

高

高

稳定性

差

差

差

好

好

好

判断

不合格

不合格

不合格

合格

合格

合格

抗e单克隆抗体

效价

1

2

4

8

16

32

灵敏度

低

低

高

高

高

高

稳定性

差

差

较好

好

好

好

判断

不合格

不合格

不合格

合格

合格

合格

根据抗体稀释后制卡的灵敏度和稳定性结果，最终确定试剂卡内各抗体的效价如下：抗A单克隆抗体128、抗B单克隆抗体128、抗D单克隆抗体128、抗C单克隆抗体8、抗c单克隆抗体8、抗E单克隆抗体8、抗e单克隆抗体8。

3.2抗体偶联：将活化后的凝胶微球分成8管，其中7管分别与抗A单克隆抗体稀释液、抗B单克隆抗体稀释液、抗D单克隆抗体稀释液、抗C单克隆抗体稀释液、抗c单克隆抗体稀释液、抗E单克隆抗体稀释液、抗e单克隆抗体稀释液等体积混匀，于滚轴混匀仪上反应1小时，即完成了抗体与凝胶微球的偶联。另一管暂不做任何处理，用作中性凝胶。

4.封闭：

待抗体偶联完成后，用buffer1洗涤三次，然后用buffer1等体积悬浮凝胶微球，往7管特异性凝胶悬液和中性凝胶悬液中加入封闭剂(每1ml凝胶悬液加入10μl CE210或CE510)，然后于滚轴混匀仪上反应1小时，即完成封闭。

封闭剂的筛选：

实验方法：在封闭过程中，分别加入不同种类的封闭剂：白蛋白、酪蛋白、赖氨酸、CE210和CE510。

后续与吗啉乙磺酸钠缓冲液混合(静置后，微球与上清体积比2∶1)，灌注到一次性验血卡片，制备得到检测卡，根据检测卡的各性能检测指标来筛选封闭剂。

使用不同封闭剂对应的检测结果如下：

凝胶微球偶联上抗体后，需要用封闭剂对凝胶微球上多余的功能基团进行封闭，避免红细胞非特异性的结合到凝胶微球上造成假阳性。不同类别的封闭剂封闭效果有差异，用大分子白蛋白进行封闭时，实验结果显示阴性结果拖尾，部分样本出现柱印记，背景着色深；酪蛋白比较难溶，其配制成的溶液进行封闭，除了背景着色深以外，检测结果的重复性也差，同一样本进行检测，凝集强度差异超过1+(凝集强度参照实施例2的结果判定规则)；赖氨酸进行封闭，试剂卡的背景着色也较深，且试剂卡稳定性较差；而带寡氨基的小分子化学合成物CE210、CE510试验结果最佳，不仅灵敏度高，特异性好，重复性和稳定性也好，且检测样本的背景着色浅，阴性结果干净，无拖尾，无柱印记。用此类化学合成聚合物的封闭剂，无动物蛋白，对蛋白质的非特异性吸附低，不存在一般生物封闭剂(BSA等)所担心的安全性，质量，纯度和较为严重的批间差等问题。

5.洗涤

参照下表配制buffer2(配制1L)

用buffer2洗涤上述封闭后的凝胶微球3次，最终使凝胶微球与上清液的体积为2∶1，即制备成了抗A特异性凝胶、抗B特异性凝胶、抗D特异性凝胶、抗C特异性凝胶、抗c特异性凝胶、抗E特异性凝胶、抗e特异性凝胶和中性凝胶(未偶联抗体)。

6.灌装封口

将特异性凝胶、中性凝胶灌装入一次性验血卡片的离心管内，灌装完成后于卡式离心机内270g离心5分钟，然后用封口膜150℃压3～5S进行覆膜，即得到血型检测卡。

其中，

ABO正反定型和RhD定型检测卡的灌装组合是：

第一个离心管灌装28μl抗A特异性凝胶，第二个离心管灌装28μl抗B特异性凝胶，第三个离心管灌装28μl抗D特异性凝胶，第四～六离心管分别灌装28μl中性凝胶。

Rh血型检测卡的灌装组合是：

第一个离心管灌装28μl抗D特异性凝胶，第二个离心管灌装28μl抗C特异性凝胶，第三个离心管灌装28μl抗c特异性凝胶，第四个离心管灌装28μl抗E特异性凝胶，第五个离心管灌装28μl抗e特异性凝胶，第六个离心管灌装28μl中性凝胶。

实施例2本发明的ABO正反定型和RhD定型检测卡、Rh血型检测卡的使用方法

1.本发明的ABO正反定型和RhD定型检测卡用于检测血型，步骤如下：

A、样本处理：将待检样本按照1000g离心5min，取10μL压积红细胞加入到1mL生理盐水中，制备成0.8％～1.0％红细胞悬液待用。

B、血型卡处理：将血型卡(使用前适当离心)正立放置，正面(空白栏一面)朝向操作者，做好适当标记，小心开启铝箔。

C、加样：正定型：1-4管分别加入待检样本0.8％～1.0％红细胞悬液各50μL；反定型：第五管加入50μL1％的A细胞，第六管加入50μL 1％的B细胞，然后再分别加入50μL待检样本的血浆。

D、离心：使用血型卡专用离心机100g离心10min。

E、结果判读：离心结束后，取出血型卡目测观察并判定结果。

本节中ABO正反定型和RhD定型检测卡简写成“血型卡”。

2.本发明的Rh血型检测卡用于检测Rh血型，步骤如下：

A、样本处理：将待检样本按照1000g离心5min，取10μL压积红细胞加入到1mL生理盐水中，制备成0.8％～1.0％红细胞悬液待用。

B、血型卡处理：将血型卡(使用前适当离心)正立放置，正面(空白栏一面)朝向操作者，做好适当标记，小心开启铝箔。

C、加样：各管分别加入待检样本0.8％～1.0％红细胞悬液各50μL。

D、离心：使用血型卡专用离心机100g离心10min。

E、结果判读：离心结束后，取出血型卡目测观察并判定结果。

本节中Rh血型检测卡简写成“血型卡”。

3.结果判定规则如下：

阴性(-)：红细胞完全沉积于凝胶柱底部，判定为阴性。

阳性(+)：红细胞凝集分布于凝胶柱表层或凝胶柱中，判定为阳性。

无效：6号柱阴性对照呈任何强度的阳性，则结果无效，需进一步查明原因。

更详细的凝集强度分级如下表所示：

以下用实验例的形式对本发明的有益效果进一步说明。

实验例1不同制备方法下，凝胶微球批间差异对检测卡性能的影响

取不同批次的凝胶微球，测定其粒径，使用本发明的方法以及传统方法制备血型检测卡，进行效果比较。

批号	X10(μm)	X50(μm)	X90(μm)	Xav(μm)
					批次1	20.9	65.2	90.1	53.3
批次2	61.2	88.1	126.7	101.7
					批次3	85.6	124.5	180.3	150.9

上表为不同批次凝胶微球粒径检测结果(粒径分析仪检测)，表中X10、X50和X90分别表示粒径最小的10％、50％和90％的微球中最大粒径值，比如：批次3的X90为180.3μm，表示批次3中粒径最小的90％的微球的最大粒径是180.3μm(粒径低于180.3μm的微球占批次3所有微球的90％)。从上表可看出，3批次凝胶批间差异较大：批次1的凝胶微球平均粒径为53.3，整体凝胶微球体积偏小；批次2的凝胶微球平均粒径为101.7，整体凝胶微球体积大小适宜；批次3的凝胶微球平均粒径为150.9，整体凝胶微球体积偏大。现分别用本发明介绍的制备方法和传统的制备方法制备血型检测卡，观察在不同制备方法下凝胶微球的批间差异对试剂卡性能的影响。

传统的制备方法介绍如下：

(1)凝胶预处理

通过离心、换液、混匀、离心、弃液等步骤，反复洗涤凝胶，用buffer1置换凝胶的buffer体系，为下一步凝胶配制做好准备。

(2)抗体工作液配制

抗A工作液：根据抗A单克隆抗体原料效价配制抗A工作液(最终效价为128)；

抗B工作液：根据抗B单克隆抗体原料效价配制抗B工作液(最终效价为128)；

抗D工作液：根据抗D单克隆抗体原料效价配制抗D工作液(最终效价为128)；

抗C工作液：根据抗C单克隆抗体原料效价配制抗C工作液(最终效价为8)；

抗c工作液：根据抗c单克隆抗体原料效价配制抗c工作液(最终效价为8)；

抗E工作液：根据抗E单克隆抗体原料效价配制抗E工作液(最终效价为8)；

抗e工作液：根据抗e单克隆抗体原料效价配制抗e工作液(最终效价为8)。

(3)凝胶配制

取预处理完成的凝胶和抗A、抗B、抗D、抗C、抗c、抗E、抗e工作液和buffer1，通过离心、换液、混匀、离心、弃液等步骤，反复洗涤凝胶，使最终凝胶和上清体积比为2∶1。即制备完成特异性凝胶和中性凝胶。

(4)灌装封口

将特异性凝胶和中性凝胶灌装入一次性验血卡片内，灌装完成后于卡式离心机内270g离心5分钟，然后用封口膜150℃压3～5S进行覆膜，即得到血型检测卡。

2.3两种制备方法样本检测结果

2.3.1 ABO正反定型和RhD定型检测卡结果比较

2.3.2 Rh血型检测卡结果比较

从上表可看出，三批次凝胶微球用本发明介绍方法制备的ABO正反定型和RhD定型检测卡、RhD血型检测卡在检测样本时，阳性结果凝集强度无明显差异，而用传统方法制备的检测卡在检测样本时，三批次凝胶的批间差异则造成检测结果出现差别，阳性结果凝集强度差异在1+以上。

本发明介绍的方法制备的检测卡的灵敏度受凝胶微球体积的影响较小，克服了凝胶微球批间差异对检测结果的影响。

实验例2本发明方法制备的血型检测卡与市售血型检测卡临床检测效果对比

1.ABO正反定型和RhD定型检测卡检测效果对比

如下表所示，两种检测卡对ABO血型以及RhD定型检测结果一致，但本发明的ABO正反定型和RhD定型检测卡对RhD定型检测的凝集强度略高(编号为1、8、16的样本)，理论上本发明的ABO正反定型和RhD定型检测卡的灵敏度更高。

2.Rh血型检测卡检测效果对比

如下表所示，两种血型检测卡得到的血型检测结果一致，但本发明的Rh血型检测卡检测的凝集强度略高于对比厂家(编号为2、63、79的样本)，具有更高的灵敏度。

本实验例的结果表明，本发明制备的检测卡凝集强度强于比对厂家，说明本发明制备的检测卡灵敏度强于比对厂家，能减少弱抗原和弱抗体的漏检。

综上，本发明的血型检测卡稳定性高，灵敏度高，具有良好的应用前景。