阅读说明：本技术 一种筛选肿瘤特异性t细胞及tcr的方法 (Method for screening tumor specific T cells and TCR ) 是由 罗微 毛晓帆 余思菲 张贝莹 林凯容 金亚彬 于 2019-09-17 设计创作，主要内容包括：本公开提供了一种筛选肿瘤特异性T细胞及TCR的方法,具体步骤为：(1)首先将肿瘤组织进行浸润单细胞消化分离；(2)然后从分离的单细胞中流式分选出CD3<Sup>+</Sup>T细胞；(3)利用免疫磁珠去除流式分选出CD3<Sup>+</Sup>T细胞中的死细胞；(4)将去除死细胞后的CD3<Sup>+</Sup>T细胞进行单细胞转录组建库、VDJ建库及测序；(5)将测序后的数据进行分析,然后筛选肿瘤特异CD8<Sup>+</Sup>T细胞及TCR。所述方法针对每个未知抗原的样本,能够在其肿瘤抗原未知的情况下,筛选出其肿瘤特异性T细胞及TCR。(The present disclosure provides a method for screening tumor specific T cells and TCRs, comprising the steps of: (1) firstly, carrying out infiltration unicellular digestion and separation on tumor tissues; (2) the separated single cells were then flow sorted for CD3 + A T cell; (3) flow sorting of CD3 using immunomagnetic bead removal + Dead cells in T cells; (4) removing CD3 after dead cells + Performing single cell transcriptome bank building, VDJ bank building and sequencing on the T cells; (5) analyzing the sequenced data, and then screening the tumor specific CD8 + T cells and TCR. The method can be used for each sample of unknown antigenCan screen out the tumor specific T cells and TCR under the condition that the tumor antigen is unknown.)

一种筛选肿瘤特异性T细胞及TCR的方法

技术领域

本公开涉及生物技术领域，具体涉及一种筛选肿瘤特异性T细胞及TCR的方法。

背景技术

目前传统手术、放疗和化疗无法彻底清除肿瘤细胞，无法解决肿瘤转移复发的问题。免疫系统对突变细胞和肿瘤细胞执行监视、清除、调节和免疫记忆功能，通过免疫疗法激活患者自体免疫系统，依靠自身的免疫机能杀灭肿瘤细胞，因而能防止肿瘤的复发和转移。随着近年肿瘤免疫治疗方面的研究突飞猛进，人们攻克癌症的梦想已越来越近，嵌合抗原受体T细胞疗法(Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells，CAR-T)可以治愈90％的白血病，PD-1/CTLA-4抗体通过调节T细胞功能使免疫正常化，极大提高了多种实体瘤的缓解率和5年生存率，并获2018年诺贝尔生理医学奖。因而，越来越多的学者坚信，免疫治疗将是人类战胜肿瘤的终极武器。

免疫系统对肿瘤细胞的识别和清除主要依赖T细胞介导的细胞免疫，通过增强抗肿瘤细胞免疫反应，修复机体免疫监视、防御和调控功能的过继T细胞(adoptive celltransfer therapy，ACT)疗法克服了传统治疗技术的局限性，经过大半个世纪的发展，已从基础理论研究发展到临床应用阶段，以突出的安全性和有效性，为中晚期患者实现长期“带瘤生存”提供了一条新路。

ACT疗法包括肿瘤浸润T细胞(Tumor Infiltrating Lymphocytes，TIL)疗法、CAR-T细胞疗法、和T细胞受体(T cell receptor，TCR)疗法。TIL过继回输治疗在以黑色素瘤为代表的多种恶性肿瘤中均显示了良好的临床疗效，但因体外扩增获得足够数量的TIL非常困难，其临床应用受到了极大地限制。CAR-T细胞疗法和TCR疗法作为当前ACT领域两大最新技术，因经过基因工程修饰患者外周血中的T细胞，使其表达CAR或新的能识别癌细胞的TCR，从而人为赋予普通T细胞靶向识别肿瘤的能力，且基于遗传改造技术可获得特异性功能加强版T细胞，而受到广泛的关注并成为研究热点，在已进行的临床试验中，被证实具有良好的疗效，研究成果被Science、Nature等顶级杂志争相报道。与TCR不同的是，CAR是将识别肿瘤相关抗原的单链抗体(scFv)与T细胞活化序列嵌合，故其应用仅限于已知靶抗原的肿瘤，如CD19⁺的B细胞淋巴瘤，且易引发“细胞因子风暴”和“脱靶效应”，产生较强的副反应，且已有的临床研究发现，CAR-T对实体瘤的治疗效果远不如TCR-T。

TCR是T细胞表面的一种受体分子，它特异性识别抗原提呈细胞上的抗原肽-MHC复合物，进而触发T细胞免疫应答。由于TCR分子决定着T细胞的抗原识别特异性，如果将肿瘤抗原特异性的TCR转入普通T细胞中，能够赋予该T细胞肿瘤抗原的识别能力，经体外活化增殖后再转输入患者体内，可以发挥抗肿瘤功效。因此利用TCR基因导入的方法可以方便地获得大量识别特定抗原的T细胞，经TCR基因修饰的T细胞被称为TCR-T，近年来TCR-T已经成为肿瘤免疫治疗中的研究热点，在临床实验中显示了良好的治疗效果。

TCR分子主要由α和β两条链组成，其编码基因V，(D)J，C在T细胞发育过程中经过胚系重排，在胸腺中经过阳性选择和阴性选择过程，成为具有MHC识别限制性。机体成熟T细胞所产生的TCRαβ组成了一个能与成千万种抗原结合的抗原识别受体库(Repertoire)，从理论上估计，TCRαβ受体库的容量在1015以上。

成功获得肿瘤抗原特异性TCR是TCR-T细胞***的重要前提，目前肿瘤特异性TCR基因的筛选主要通过获得肿瘤抗原特异性识别的T细胞，然后克隆其TCR基因。方法主要有：1.基于多细胞RT-PCR的扩增技术；MHC-肽五聚体(Pentamer)流式细胞技术是一种灵敏的抗原表位特异性检测方法，荧光标记的MHC-肽五聚体与T细胞孵育后，特异性识别MHC-肽五聚体的T细胞即可被激发荧光并通过流式分选，因此可以用来分离抗原特异性的单个T细胞克隆。大致流程为从肿瘤患者外周血分离出单核细胞，其中贴壁细胞利用集落刺激因子和IL-4刺激后，得到树突状细胞(Dendritic cells，DC)，然后将合成的肿瘤抗原肽与其孵育获得负载抗原的成熟DC；上述非贴壁的T细胞经负载抗原DC多次刺激，诱导细胞毒性的T淋巴细胞(Cytotoxic lymphocyte，CTL)；根据肿瘤患者的HLA类型，制备出相应的肿瘤抗原肽-MHC五聚体，然后利用流式细胞技术筛选出单个特异性的CTL。最后通过体外扩增单个特异性CTL获得一定数量的T细胞，然后通过RT-PCR扩增获得其特异性TCR基因。2.利用单细胞RT-PCR扩增技术，基于单细胞RT-PCR扩增技术大致为，分离得到肿瘤抗原特异性T细胞单克隆后，针对该单细胞克隆进行反转录，并通过PCR克隆，根据使用引物的不同(基于5′RACE扩增或基于多重引物的PCR扩增)，特异扩增出目的序列。

但是多细胞RT-PCR扩增技术，需要先筛选出特异性识别肿瘤抗原的T细胞，经历长期的体外克隆化培养，耗时长且成本和技术要求高，不易获得足够数量的细胞用来进行PCR扩增，目前只有少数实验室成功通过此法获得肿瘤特异性的TCR基因。

单细胞RT-PCR的扩增技术虽不需要繁琐复杂的体外培养和增殖，但是这种方法无法获得表达该TCR的细胞的属性，包括细胞的状态、亚群以及表达哪种效应因子，其肿瘤反应性也无法得知，故不利于对其TCR序列应用于TCR-T的有效性评估。

更重要的一点是，无论是单细胞或多细胞RT-PCR技术，都需要提前获取具有已知肿瘤抗原反应性的T细胞，但实际上，目前绝大多数肿瘤抗原是未知的、不明确且多变的。现有技术瓶颈在于：无法获得靶向抗原未知肿瘤的特异性T细胞或TCR。

发明内容

本公开的目的是提供一种筛选肿瘤特异性T细胞及TCR的方法，以获得靶向未知肿瘤的特异T细胞及TCR。

为实现上述目的，技术方案如下：

一种筛选肿瘤特异性T细胞及TCR的方法，所述方法具体步骤为：

(1)首先将肿瘤组织进行浸润单细胞消化分离；

(2)然后从分离的单细胞中流式分选出CD3⁺T细胞；

(3)利用免疫磁珠去除流式分选出CD3⁺T细胞中的死细胞；

(4)将去除死细胞后的CD3⁺T细胞进行单细胞转录组建库、VDJ建库及测序；

(5)将测序后的数据进行分析，然后筛选肿瘤特异CD8⁺T细胞及TCR。

所述步骤(1)的具体操作步骤为：

(a)首先将离体新鲜手术切除肿瘤组织置于无菌平皿内，利用无菌PBS或Hank’s溶液将肿瘤组织进行反复冲洗，并减去***和脂肪组织，然后将肿瘤组织剪碎；

(b)在剪碎的肿瘤组织中加入组织消化液混匀于37℃摇床消化1-2h；

(c)将消化后的肿瘤组织中加入HBSS溶液终止消化，使用移液管将组织液转移至70μm筛网中过滤至离心管中，1800r/min，离心8min；

(d)将离心后的组织液弃去上清液，用Hank’s溶液洗涤，然后离心弃掉上清液，加入培养液重悬细胞，计数细胞。

所述步骤(2)的具体操作步骤为：

①将上述分离的计数为10-50×10⁶个组织浸润单个核细胞，离心后弃掉上清，用纯化缓冲液清洗，然后1800rpm/min 4℃离心8min；

②将离心后的上清液弃掉，用200μL纯化缓冲液将沉淀细胞重悬，加入荧光抗体，4℃避光孵育30min后，用纯化缓冲液清洗，然后1800rpm/min 4℃离心8min，弃掉上清，用500μL纯化缓冲液将沉淀细胞重悬；

③将细胞重悬液经40μm的筛网过滤去除粘连的细胞团块，然后将过滤的细胞重悬液经7-AAD染料进行表面分子染色，利用BD Aria II收集射门于单细胞中的7-AAD-CD45-V450⁺CD3-PE-CF594⁺细胞群。

所述步骤(3)的具体操作为：将上述流式分选的CD3⁺T细胞进行离心后用无菌PBS洗涤，然后取45-55μL无菌PBS重悬细胞，取等量的细胞悬液和胎盘蓝混合，利用Life Count细胞计数仪计数细胞及细胞活率，细胞活率<80％利用美天旎磁珠去死细胞磁珠做去死细胞处理。

所述步骤(4)具体步骤为：利用磁珠标签技术标记上述获得的单细胞，使同一个细胞的每条RNA都标记上同样的标签，逆转录和酶切后，分别进行转录组和VDJ扩增，最后对扩增的转录组和VDJ进行测序。

所述步骤(5)的具体操作步骤为：

(I)将上述测序后获得的数据利用单细胞测序数据处理方法，将数据转换成细胞*基因的表达矩阵以及获得每个细胞的TCR；

(II)利用Seurat软件读入表达矩阵，去除UMI过低或过高细胞数据，以前后3％为预制截取；

(III)利用Seurat软件中的CCA方法整合去除后的数据，使用细胞聚类法将细胞分为30-35个群，并计算每个细胞群体的均值表达谱；

(IV)利用SingleR软件读入细胞群体均值表达谱，根据ENCODE和BLUEPRINT数据库初步定义细胞群体，并过滤数据中的非T细胞；

(V)在CD8阳性细胞群体中，查看ITGAE基因的表达量，选出ITGAE高表达细胞群体，在高表达细胞群体中观察KLRC2和ENTPD1表达量，KLRC2表达量高的细胞群体为IEL，ENTPD1表达量高的为CD8 Trm Ex，其他细胞群体为CD8 Trm；

(VI)利用SingleR软件将ITGAE基因低表达的细胞群体与GSE107011的数据作匹配，以此获取ITGAE基因低表达的细胞群体的定义和注释，所述细胞群体可被定义为：CD8EM、CD8 EM Ex progenitor、CD8

CD8 Tcm、CD8 TE、MAIT、CD4

CD4 Tcm、Th1、Th17、Th1.Th17、Th2、TFH、Treg或CD8 Tem；

(VII)具有肿瘤特异TCR的CD8细胞是在肿瘤组织中CD8 Tem和CD8 Trm Ex细胞中高度扩展的细胞，分别在CD8 Tem和CD8 Trm Ex细胞，寻找TCR频次最高细胞为特异T细胞，其序列为组织肿瘤特异TCR序列。

所述单细胞测序数据处理方法为Cell Ranger法、STAR方法或BD Rhapsody体系处理法。

使用上述筛选肿瘤特异性T细胞及TCR的方法所获取的肿瘤反应性TCR在肿瘤抗原筛选、疫苗制备、TCR-T治疗方面的应用。

本公开的有益效果是：提供了一种筛选肿瘤特异性T细胞及TCR的方法，所述方法针对每例患者，在其肿瘤抗原未知的情况下，筛选出其肿瘤特异性T细胞及TCR，可明确该T细胞处于何种活性状态、是否表达或表达何种抑制性受体，表达何种趋化因子及免疫活性因子、属于何种细胞亚群，评估其肿瘤反应性高低，获取这些信息有利于基于特定肿瘤特异性T细胞的免疫治疗或基于特定TCR序列的TCR-T治疗。

附图说明

图1为实施例2中利用Seurat CCA方法进行细胞第一步分群的结果图。

图2为实施例2中利用SingleR软件根据ENCODE和BLUEPRINT数据库初步定义细胞亚群图。

图3为实施例2中根据ITGAE基因的表达量以及GSE107011的数据对细胞进行定义分群结果图。

具体实施方式

以下各步骤仅用以说明本公开的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各步骤对本公开进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各步骤所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本公开各步骤技术方案的范围。

实施例1一种筛选肿瘤特异性T细胞及TCR的方法

1.组织浸润单细胞消化分离

(1)将离体的新鲜的手术切除组织置于无菌平皿内，用无菌PBS或Hank’s反复冲洗，并减去四周***和脂肪组织，在平皿中用眼科镊将组织剪碎，尽量剪成1～2mm3大小的小块；

(2)倒入新鲜配置的组织消化液(20mg I型胶原酶+10μL DNA酶(10mg/mL)+10mL不完全RPMI1640)，混匀，于37℃摇床中消化1～2小时；

(3)加10mL HBSS终止消化，用无菌巴氏移液管将消化好的组织液转移至70μm的筛网中，过滤至新的50mL离心管中，离心(1800rpm，8min，常温)；

(4)弃去上清液，用Hank’s洗涤2次，如果肉眼可见细胞团块有红色血细胞，弃去上清液，加入5mL红细胞裂解液，轻轻吹散细胞团块，RT静置5～10min，随时观察液体的颜色，如果变成清亮透明的状态即可以终止，加20～30mLHank’s液终止，离心洗涤两次；

(5)末次离心后，弃上清，加入全完RPMI1640培养液(500mL不完全RPMI1640溶液+50mL灭活的胎牛血清+100μg/mL青霉素+100μg/mL链霉素)重悬细胞，计数细胞；

2.流式分选CD3⁺T细胞

(1)将上述分离的10～50×10⁶个组织浸润单个核细胞，离心后弃上清，用无菌的纯化缓冲液(1L 1×PBS+5g BSA+2mM EDTA-Na2，pH7.2～7.4)洗两遍，约4mL/管，1800rpm、4℃、离心8min；

(2)弃去上清液，用200μL纯化缓冲液重悬，加荧光抗体(抗CD45-V450和抗CD3-PE-CF594各20μL)，4℃、避光孵育30min；用无菌的纯化缓冲液洗两遍，4mL/管，1800rpm、4℃、离心8min，弃去上清，用500μL纯化缓冲液重悬；

(3)细胞悬液经40μm的筛网过滤去除粘连的细胞团块，按照BD Aria II操作手册，无菌化处理分选系统，设置分选参数，上机分选前，经表面分子染色的细胞悬液加入10μL7-AAD染料，避光孵育10min，分选出射门于单细胞中的7-AAD-CD45-V450⁺CD3-PE-CF594⁺细胞群，收集射门的细胞群；

3.免疫磁珠去除死细胞

流式分选的细胞离心后用无菌PBS洗涤2次，取45μL无菌PBS重悬细胞，取10μL细胞悬液，与10μL台盼蓝混合，用Life Count细胞计数仪计数细胞及细胞活率，细胞活率＜80％时，做去死细胞处理；去死细胞流程参见美天旎磁珠去死细胞磁珠(Miltenyi Biotec,DeadCell Removal Kit,130-090-101)说明书；

4.单细胞转录组建库、VDJ建库及测序

利用磁珠标签技术标记单细胞，使同一个细胞的每条RNA都标记上相同的标签，逆转录和酶切后，转录组和VDJ分别扩增，最后使用读长大于100方法双端测序(此处可使用多种方法互相搭配，方法并不唯一)；

5.数据分析及筛选肿瘤特异CD8⁺T细胞及TCR

(1)将上述测序后获得fastq文件，利用单细胞测序对应的数据处理方法，把fastq数据转换成细胞*基因的表达矩阵以及获得每个细胞的TCR；

(2)利用Seurat软件读入表达矩阵，去除UMI过低或过高细胞，以前后3％为阈值截取；

(3)利用Seurat中提供的CCA方法，整合各样本的数据，利用Seurat中提供的细胞聚类方法，把细胞分群，调整分辨率使细胞分群达30至35群，并计算每个细胞群体的均值表达谱；

(4)利用SingleR软件，读入细胞群体均值表达谱，根据ENCODE和BLUEPRINT数据库初步定义细胞群体，并过滤数据中的非T细胞；

(5)在CD8阳性细胞群体中，查看ITGAE基因的表达量，选出ITGAE高表达细胞群体。在这些群体中，观察KLRC2表达量，KLRC2表达高的细胞群体定义为IEL；在其余细胞群体中观察ENTPD1表达量，ENTPD1高表达细胞群体为CD8 Trm Ex；其余细胞群体为CD8 Trm；

(6)下载GEO数据库中GSE107011的数据，该数据包含了血液中29种免疫细胞的表达谱，并使用singleR，把细胞群体与GSE107011的数据作匹配，以此获取对剩余的细胞群体的定义和注释，细胞群体可被定义为：CD8 EM、CD8 EM Ex progenitor、CD8

CD8Tcm、CD8 TE、MAIT、CD4

CD4 Tcm、Th1、Th17、Th1.Th17、Th2、TFH、Treg或CD8 Tem等细胞群体；

(7)筛选肿瘤特异T细胞及TCR，具有肿瘤特异TCR的CD8细胞是在肿瘤组织中CD8Tem和CD8 Trm Ex细胞中高度扩展的细胞，分别在CD8 Tem和CD8 Trm Ex细胞，寻找TCR频次最高的细胞为特异T细胞，序列为肿瘤特异TCR序列。

实施例2

利用实施例1所述方法，将肠癌病人组织样本进行筛选，在所述单细胞转录组建库、VDJ建库及测序中为利用10X单细胞建库及Illumina Hiseq4000双端150测序，最后共获得22741个细胞的基因表达谱及其TCR序列。

利用实施例1中数据分析及筛选肿瘤特异CD8⁺T细胞及TCR中的步骤(3)利用Seurat中提供的CCA方法，整合各样本的数据，把细胞分群，进行细胞第一步分群，细胞分为32个群，结果如图1，然后再利用SingleR软件，读入细胞群体均值表达谱，根据ENCODE和BLUEPRINT数据库初步定义细胞群体，并过滤数据中的非T细胞，结果如图2，显示第30和31群为非T细胞，将其过滤。

然后利用实施例1中数据分析及筛选肿瘤特异CD8⁺T细胞及TCR中的步骤(5)和(6)对各细胞群体进行注释，结果如图3，其中图3-a为细胞表达水平图(A为ITGAE(CD103)、B为KLRC2(CD159)、C为PDCD1(PD-1)、D为CTLA4、E为ENTPD1(CD39)、F为HAVCR2(TIM-3)、G为CD8A和H为CD4)，图3-b为29种细胞亚群中各T细胞亚群为参考图，图3-c为TSNE可视化展示最终的细胞分群结果图。

根据上述结果对肿瘤特异性TCR进行筛选，其中肿瘤中CD8 EM及CD8 Trm Ex高频CDR3序列，即肿瘤特异TCR序列，结果如表1，所属的细胞为特异T细胞。

表1肿瘤特异TCR序列

SEQUENCE LISTING

<110> 佛山市第一人民医院（中山大学附属佛山医院）

<120> 一种筛选肿瘤特异性T细胞及TCR的方法

<130> 2019.09.17

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Cys Ala Ser Ser Met Asp Arg Gly Asn Glu Gln Tyr Phe

1 5 10

<210> 2

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 2

Cys Ala Ala Arg Asn Arg Gly Ser Gln Gly Asn Leu Ile Phe

1 5 10

<210> 3

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 3

Cys Ala Ser Ser Met Asp Arg Gly Asn Glu Gln Tyr Phe

1 5 10

<210> 4

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 4

Cys Ala Ala Leu Thr Asp Ser Trp Gly Lys Phe Gln Phe

1 5 10

<210> 5

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 5

Cys Ala Ser Arg Gln Gly Gly Asp Lys Phe Tyr Glu Gln Tyr Phe

1 5 10 15

<210> 6

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 6

Cys Ala Thr Ser Trp Gly Lys Leu Gln Phe

1 5 10

<210> 7

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 7

Cys Ala Ser Ser Pro Gly Gln Gln Thr Gly Glu Leu Phe Phe

1 5 10

<210> 8

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 8

Cys Ala Gly Gly Leu Ile Ser Ser Gly Ser Ala Arg Gln Leu Thr Phe

1 5 10 15

<210> 9

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 9

Cys Ala Ser Asn Ser Leu Gly Glu Thr Asn Arg Tyr Asn Glu Gln Phe

1 5 10 15

Phe

<210> 10

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 10

Cys Ala Ser Ser Leu Trp Glu Leu Thr Thr Ser Ala Glu Gln Phe Phe

1 5 10 15

<210> 11

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 11

Cys Ala Met Arg Val Ile Ser Gly Gly Tyr Asn Lys Leu Ile Phe

1 5 10 15

<210> 12

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 12

Cys Ala Ser Ser Leu Ala Pro Thr Gly Asn Ser Gly Ala Asn Val Leu

1 5 10 15

Thr Phe

<210> 13

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 13

Cys Ala Ser Asn Ser Leu Gly Glu Thr Asn Arg Tyr Asn Glu Gln Phe

1 5 10 15

Phe

<210> 14

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 14

Cys Ala Val Gln Gly Ser Gly Gly Ser Asn Tyr Lys Leu Thr Phe

1 5 10 15

<210> 15

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 15

Cys Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ala Asn Tyr Gly Tyr Thr Phe

1 5 10