阅读说明：本技术 高茎尖诱导率和组培质量的多头菊脱毒培养基质及方法 (Chrysanthemum multocida detoxification culture medium with high stem tip induction rate and tissue culture quality and method ) 是由 郭方其 吴超 袁峰 黑银秀 柴金甫 刘君 丁晓瑜 徐智豪 黎侠 于 2019-07-15 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种高茎尖诱导率和组培质量的多头菊脱毒培养基质及方法,属于植物培育栽培技术领域,本发明的组培基质由分阶段依次顺序使用的茎段芽诱导培养基组合、脱毒茎尖诱导培养基组合、增殖培养基组合、生根培养基组合组成,诱导培养基组合包括外植体诱导与增值培养基+继代培养基、外植体初代诱导培养基+继代培养基；脱毒茎尖诱导培养基组合包括外植体诱导与增值培养基+续代培养基、茎尖诱导培养基Ⅰ+茎尖诱导基本培养基I、茎尖诱导培养基Ⅱ+续代培养基：本发明解决菊花品种退化和生长势减弱,影响切花品质,同时茎尖培养诱导率低,组培培育质量较差,种苗无法高效大规模化生产的问题。(The invention discloses a detoxification culture medium and a detoxification culture method for a multi-headed chrysanthemum with high stem tip induction rate and tissue culture quality, belonging to the technical field of plant cultivation, wherein the tissue culture medium consists of a stem section bud induction medium combination, a detoxification stem tip induction medium combination, a proliferation medium combination and a rooting medium combination which are sequentially used in stages, and the induction medium combination comprises an explant induction and increment culture medium + a subculture medium, an explant primary induction culture medium + a subculture medium; the combination of the detoxification stem tip induction culture medium comprises an explant induction and proliferation culture medium, a subculture medium, a stem tip induction culture medium I, a stem tip induction basic culture medium I, a stem tip induction culture medium II and a subculture medium: the invention solves the problems that the chrysanthemum varieties are degenerated and the growth vigor is weakened, the cut flower quality is influenced, meanwhile, the stem tip culture induction rate is low, the tissue culture quality is poor, and the seedlings cannot be efficiently produced in a large scale.)

高茎尖诱导率和组培质量的多头菊脱毒培养基质及方法

技术领域

本发明属于植物培育栽培基质及培育技术领域，具体为一种高茎尖诱导率和组培苗质量的多头菊脱毒培养基质及方法。

背景技术

浙江省现有切花菊种植面积4165亩，年销售1亿枝，销售额达0.7亿元，并且持续保持快速增长的态势。浙江省切花菊生产地区主要分布于新昌县、柯桥区、平阳市、椒江区和长兴县等地，各地通过多年栽培积累了一些生产经验，产品质量有所提高，生产的切花菊大量出口到日本和韩国，目前我省生产的切花菊在日本市场已有较高的占有率。

多头菊是国际上流行切花菊品种之一，多头菊的品种主要来源于欧美，一部分来源于日本，特别是市场流行的切花品种几乎全部出自欧美育种家之手，近年南京农业大学和浙江省农业科学院开展多头菊新品种选育工作，部分品种已在生产上应用。但多头菊并不是采用以往的传统独本菊进行多花生产，而是培育花序分枝性较强和花朵较小的新品种，受农户种植管理水平较低影响，产品质量不稳定，此外，以出口为导向的菊花生产对产品质量要求越来越高，实际生产中因种苗培育、栽培、采收处理和长距离冷链运输不规范等，造成出口产品损失严重，因产品质量问题的索赔情况仍比较严重，而目前浙江省菊花生产中存在的突出问题是缺乏规范的种苗繁育技术，病毒病侵传严重，导致品种退化和种苗质量下降。

另外，多头菊的大部分品种特性属于秋菊和寒菊，也有一少部分属于夏菊和夏秋菊，生产上一般由农户自留母本进行扦插繁殖，由于多头菊繁殖用母本长期无性繁殖，易感染病毒病和镰刀菌、丝核菌和腐霉菌等真菌性病害，而且田间存在蚜虫和蓟马等害虫等传播菊花B病毒和番茄***病毒等病毒，极易导致品种退化和生长势下降，由于茎尖诱导培养中易发生坏死等，茎尖培养诱导率低，技术难度较高，国内缺乏配套的多头菊茎尖脱毒培养技术，导致每年需要从国外进口种苗，因此提高多头菊茎尖脱毒培养初代诱导率，这对加快优良多头菊品种脱毒种苗生产，促进优质种苗规模化生产具有重大的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种高茎尖诱导率和组培质量的多头菊脱毒培养基质及方法，解决因长期的无性繁殖，导致植株体内病毒的大量积累，引起菊花品种退化和生长势减弱，影响切花品质，同时茎尖培养诱导率低，组培培育质量较差，缺乏多头菊茎尖脱毒培养方法，和基质，导致每年需要从国外进口种苗，种苗无法高效大规模化生产的问题。

本发明的第一目的是提供一种高茎尖诱导率和组培苗质量的多头菊脱毒培养基质，上述组培基质由分阶段依次顺序使用的茎段芽诱导培养基组合、脱毒茎尖诱导培养基组合、增殖培养基组合、生根培养基组合组成，

上述诱导培养基组合包括外植体诱导与增值培养基+继代培养基、外植体初代诱导培养基+继代培养基；

上述脱毒茎尖诱导培养基组合包括外植体诱导与增值培养基+续代培养基、茎尖诱导培养基Ⅰ+茎尖诱导基本培养基I、茎尖诱导培养基Ⅱ+续代培养基，上述茎尖诱导培养基Ⅰ的配方为：1/2 B5+Ca（NO3）2 500mg/L+6-BA 0.01~0.2 mg/L + NAA 0.1~0.2mg/L+AC 0.5~1.0mg/L，上述茎尖诱导培养基Ⅱ的配方为：MS+6-BA 0.1~0.2mg/L+ IBA 0.1~0.2mg/L；

壮苗培养基组合：其包括壮苗培养基+续代培养基；

生根培养基组合：其包括生根培养基+生根基本培养基。

作为优选，本发明提供的基质进一步设置为，上述茎尖诱导基本培养基I的配方为：蔗糖20~30g/L，琼脂粉4~5 g/L，pH5.6~5.8的1/2 B5+Ca（NO3）2 500mg/L培养基；上述继代培养基的配方为：蔗糖25~35g/L，琼脂粉4~5 g/L，pH5.6~5.8的MS培养基。

作为优选，本发明提供的基质进一步设置为，上述壮苗培养基的配方为：3/4MS +6-BA 0.2 mg/L+IBA 0.1mg/L 。

作为优选，本发明提供的基质进一步设置为，上述生根培养基的配方为：1/2MS +IBA 0.1~0.5mg/L +AC 0~0.5mg/L；上述生根基本培养基I的配方为蔗糖30g/L，琼脂粉4~5g/L，pH5.6~6.0的1/2MS培养基。

作为优选，本发明提供的基质进一步设置为，上述外植体初代诱导与增殖培养基的配方为：MS+6-BA0.2~1.0 mg/L + IBA 0.1~0.5mg/L。

本发明的第二目的在于提供一种高茎尖诱导率和组培苗质量的多头菊脱毒培养方法，上述方法使用如上上述的基质，上述方法包括以下步骤：

（1）培养基配置：配置组培所需的段芽诱导培养基组合、脱毒茎尖诱导培养基组合、增殖培养基组合、生根培养基组合组成；

（2）种源处理与灭菌：将经过自然低温的冬至芽取回，用1%洗洁***浸泡10min，经清水冲洗后进行种源茎段灭菌处理，备用；

（3）茎段芽的诱导培养：取取灭菌后种源茎段切成每节带一个腋芽为一段，作为外植体，接种于外植体诱导与增殖培养基上，培养至诱导出茎段芽，将该茎段芽切下转接在外植体初代诱导与增殖培养基上，当苗长高至6cm~7cm，将苗切成带1个~2个腋芽的茎段，转接至外植体诱导与增殖培养基上，重复接种培养直至足够数量用于脱毒茎尖诱导培养；

（4）脱毒茎尖诱导培养：当诱导的茎段芽扩繁一定基数后，进行热处理脱毒培养，利用高温培养条件，抑制菊花病毒的繁殖，剥取茎尖进行诱导培养，至形成生长正常的有1片~2片展开叶的幼苗；

（5）增殖培养：将上述培养的具有1片~2片展开叶的幼苗，转接至壮苗培养基和增殖培养基上进行重复增殖培养；

（6）采用高通量Small RNA测序技术进行病毒快速鉴定，通过对切花菊的病毒病高通量小RNA分析，对脱毒苗实验样本的测序数据和 NCBI 病毒基因组数据库比对分析，发现一些测序序列和病毒序列相似，然后对本次检测样本各病毒序列进行组装分析，但未组装到整条完整的病毒序列，确定上述脱毒茎尖诱导培养的组培苗未发现病毒；

（7）生根培养：将经过上述方法检测未发现菊花病毒的组培苗切成带1个~2个腋芽的茎段，转接至生根培养基上，在温度24±1℃，光照12h/d，光照强度1000~3000Lx的环境条件下培养25d~30d，形成具有5片~7片叶片和4条~6条完整根系的组培苗；

（8）选择2月下旬至4月中旬选择2月下旬至4月中旬作为组培苗移栽时间，将组培瓶苗移至具有防虫网隔离大棚的架空苗床基质上。

6. 根据权利要求1上述的高茎尖诱导率和组培苗质量的多头菊脱毒培养方法，其特征在于：步骤（3）中方法接种于外植体诱导与增殖培养基上后，具体如下：在温度24±1℃，光照12h/d，光照强度1000~3000Lx的环境条件下培养20~30d至诱导出茎段芽；将该茎段芽切下转接在外植体初代诱导与增殖培养基上，当苗长高至6cm~7cm，将苗切成带1个~2个腋芽的茎段，转接至外植体诱导与增殖培养基上，在上述环境条件下培养30~40d进行增殖培养，重复接种培养直至足够数量用于脱毒茎尖诱导培养。

作为优选，本发明提供的方法进一步设置为，步骤（4）中，具体方法：将预先培养的组培苗，当苗长高至6cm~7cm，将苗切成带1个~2个腋芽的茎段，转接至外植体诱导与增殖培养基上，在同上环境条件下培养10d~15d，当新芽萌发苗长至1cm~1.5cm时将组培瓶苗放入光照培养箱内，按昼夜温度28℃~32℃、30℃~35℃、33℃~38℃的顺序，每3d变换一档，使组培苗逐渐适应高温生长环境，然后在33℃~38℃下继续热处理脱毒培养25~30d，组培苗生长势逐渐变弱，叶色变浅，当组培苗坏死约50%~60%时，选取具有一定活力的组培苗，在无菌操作台上置组培苗于生物镜下放大100倍，剥取0.1~0.3mm的茎尖作为外植体，接种于茎尖诱导培养基Ⅰ，进行茎尖诱导培养，在温度24±1℃，光照12h/d，光照强度1000~3000Lx的环境条件下培养25d~30d，将已有萌动的茎尖转接至茎尖诱导培养基Ⅱ，在同上环境条件下培养30~40d，将明显转绿的茎尖组织转接至茎尖诱导培养基Ⅰ，在同上环境条件下培养30~40d，如此交替培养，至形成生长正常的有1片~2片展开叶的幼苗。

作为优选，本发明提供的方法进一步设置为，上述（5）增殖培养中具体方法为：将上述培养的具有1片~2片展开叶的幼苗，转接至壮苗培养基，在温度24±1℃，光照12h/d，光照强度1000~3000Lx的环境条件下培养25d~30d，形成具有5片~7片叶片的组培苗，将组培苗切成带1个~2个腋芽的茎段，转接至壮苗培养基上，在上述环境条件下培养30~40d进行增殖培养，重复转接培养直至能满足进行病毒检测取样和保留病毒检测后需要进一步扩繁组培苗数量，由于整个培养过程无丛生芽发生，只有茎段腋芽萌动和生长，组培苗未见形态变异，无玻璃化苗发生。

作为优选，本发明提供的方法进一步设置为，上述步骤（8）中具体方法如下：将组培瓶苗移至具有防虫网隔离大棚的架空苗床上，瓶苗上覆盖70%的遮荫网，在大棚内施置15d，使组培苗适应自然光照条件，将组培苗瓶盖打开，早晚不遮荫，中午强光时段在组培瓶苗上覆盖70%的遮荫网，对组培苗开瓶煅炼3d~5d，然后小心取出组培苗，在清水中洗去培养基，将组培苗移栽至准备好椰糠为基质的苗床中，上述种苗移栽前一星期将椰糠块铺放在苗床上，先浇透水使椰糠块松开，并在基质中施入复合肥N-P-K（15-15-15）20kg/亩，椰糠厚度6cm~8cm，种植深度以将基质覆盖到生根节位部为宜，小心将根系展开于基质中，轻压根部，然浇透定根水，3月中旬后移栽需要遮盖70%遮荫率的遮阳网，防止因强光造成叶片损伤和萎蔫，约一星期根系恢复生长后可去掉遮荫网，组培苗移栽成活率达95%以上。

作为优选，本发明提供的方法进一步设置为，上述方法还包括如下步骤：

（9）长日照处理：瓶苗移至大棚当天即开始长日照处理，采用150w高光效钠灯，每56平方米挂一个灯，使大棚内远离灯光处电照强度最低达70lux以上，每天日照时数大于16小时；

（10）适时施用水溶性配方肥：每7~10d浇1次1000~1500倍水溶性肥料，为全矿物营养液肥，含有氮、磷、钾大量元素及钙、镁、硫、铁、锰、锌、铜、硼、钼等微量元素。N︰P︰K为20︰20︰20；

（11）病虫害防治：镰刀菌、欧文氏杆菌、丝核菌等土壤传播病害为害根茎部位，主要症状：立枯、青枯、腐烂等，并定期喷25%嘧菌酯1000倍+58%可湿性粉剂甲霜锰锌800倍或烯酰锰锌1000倍，喷10%烯啶虫胺可溶性液剂 1500 倍液，或 20%啶虫脒乳油 1500 倍液或5%吡丙醚EC800倍液，或20％吡虫虫螨腈SC750倍液等杀虫剂防治蚜虫和螨虫等虫害。

有益效果

本发明提供的高茎尖诱导率和组培苗质量的多头菊脱毒培养基质及方法，具有以下优点：

（1）本发明步骤（4）脱毒茎尖诱导培养，以1/2 B5+Ca（NO₃）₂ 500mg/L为茎尖诱导基本培养基I，通过调节培养基中6-BA、 NAA 和AC的用量，对茎段诱导培养的组培苗进行脱毒培养处理，按昼夜温度28℃~32℃、30℃~35℃、33℃~38℃的顺序，每3d变换一档，使组培苗逐渐适应高温生长环境，然后在33℃~38℃下继续热处理脱毒培养25~30d，抑制菊花病毒的繁殖，但组培苗生长势也因高温影响而逐渐变弱，叶色变浅，当组培苗坏死约50%~60%时，选取具有一定活力的组培苗进行脱毒茎尖诱导培养，茎尖初代诱导率达30%以上，比直接从田间取样剥取茎尖，诱导率高20个百分点以上。

（2）本发明步骤（5）增殖培养时，其组培苗增殖培养采用壮苗培养基，由于整个培养过程无丛生芽发生，只有茎段腋芽萌动和生长，组培苗未见形态变异，且无玻璃化苗发生，而在常规增殖培养时易发生切口基部形成明显增大的愈伤组织，组培苗增殖过程中玻璃化苗占10%以上。

（3）本发明步骤（8）选择2月下旬至4月中旬作为组培苗移栽时间，将组培瓶苗移至具有防虫网隔离大棚的架空苗床上，瓶苗上覆盖70%的遮荫网，在大棚内施置15d，使组培苗适应自然光照条件，将组培苗瓶盖打开，早晚不遮荫，中午强光时段在组培瓶苗上覆盖70%的遮荫网，对组培苗开瓶煅炼3d~5d，再进行移栽，移栽存活率达95%以上。

（4）本发明提供的方法，能够大大减少植株体内病毒的大量积累，不会造成和品种退化和生长势减弱，有效保证了多头菊的培育品质和质量。

（5）综合使用本发明的方法，能够高效完成多头菊的培育，具有较高的经济价值，组培培育质量较高，能够完全替代进口种苗，降低了生产成本。

（6）使用本发明提供的方法，能够促进多头菊的优质种苗规模化生产，为多头菊的市场推广奠定基础和重要的大规模市场化应用保障。

具体实施方式

下面通过具体的实施例子对本发明做进一步的详细描述。

实施例1

高茎尖诱导率和组培苗质量的多头菊脱毒培养基质及方法实施地点为浙江省农业科学院园艺研究所园林花卉遗传育种实验室和嘉兴嘉德园艺有限公司菊花生产基地，方法包括如下步骤：

（1）培养基的配制：包括茎尖诱导基本培养基I和组培各阶段培养基的组分与各组分每升所含重量为：

a）基本培养基：其中，

茎尖诱导基本培养基Ⅰ为蔗糖20g/L，琼脂粉4 g/L，pH 5.8的1/2 B5+Ca（NO₃）₂ 500mg/L培养基；

外植体初代诱导和继代培养基（增殖培养基、壮苗培养基和茎尖诱导培养基Ⅱ的基本培养基）为蔗糖30g/L，琼脂粉4 g/L，pH 5.8的MS培养基；

生根基本培养基为蔗糖30g/L，琼脂粉4 g/L，pH6.0的1/2MS培养基；

b）茎尖诱导培养基Ⅰ：1/2 B5+Ca（NO₃）₂ 500mg/L+6-BA 0.2 mg/L + NAA 0.1mg/L+AC0.5mg/L；

c）茎尖诱导培养基Ⅱ：MS+6-BA 0.2mg/L+ IBA 0.1mg/L；

d）外植体初代诱导与增殖培养基：MS+6-BA0.2 mg/L + IBA 0.1mg/L；

e）壮苗培养基：3/4MS +6-BA 0.2 mg/L+IBA 0.1mg/L

f）生根培养基：1/2MS +IBA 0.1mg/L +AC 0.5mg/L；

（2）种源处理与灭菌：将经过自然低温的冬至芽取回，品种为多头菊“多丽16-86”，用1%洗洁***浸泡10min，经清水冲洗后进行种源茎段灭菌处理，备用；

（3）茎段芽的诱导培养：取灭菌后种源茎段切成每节带一个腋芽为一段，作为外植体，接种于外植体诱导与增殖培养基上，在温度24±1℃，光照12h/d，光照强度1000Lx的环境条件下培养25d至诱导出茎段芽；将该茎段芽切下转接在外植体初代诱导与增殖培养基上，当苗长高至6cm~7cm，将苗切成带1个~2个腋芽的茎段，转接至外植体诱导与增殖培养基上，在环境条件下培养30d进行增殖培养，重复接种培养直至足够数量用于脱毒茎尖诱导培养；

（4）脱毒茎尖诱导培养：当诱导的茎段芽扩繁一定基数后，进行热处理脱毒培养，利用高温培养条件，抑制菊花病毒的繁殖，剥取茎尖进行诱导培养，具体方法：将预先培养的组培苗，当苗长高至6cm~7cm，将苗切成带1个~2个腋芽的茎段，转接至外植体诱导与增殖培养基上，在同上环境条件下培养12d，当新芽萌发苗长至1cm~1.5cm时将组培瓶苗放入光照培养箱内，按昼夜温度28℃~32℃、30℃~35℃、33℃~38℃的顺序，每3d变换一档，使组培苗逐渐适应高温生长环境，然后在33℃~38℃下继续热处理脱毒培养30d，组培苗生长势逐渐变弱，叶色变浅，当组培苗坏死约50%~60%时，选取具有一定活力的组培苗，在无菌操作台上置组培苗于生物镜下放大100倍，剥取0.1~0.3mm的茎尖作为外植体，接种于茎尖诱导培养基Ⅰ，进行茎尖诱导培养，在温度24±1℃，光照12h/d，光照强度3000Lx的环境条件下培养25d，将已有萌动的茎尖转接至茎尖诱导培养基Ⅱ，在同上环境条件下培养30d，将明显转绿的茎尖组织转接至茎尖诱导培养基Ⅰ，在同上环境条件下培养30d，如此交替培养，至形成生长正常的有1片~2片展开叶的幼苗；

（5）增殖培养：将培养的具有1片~2片展开叶的幼苗，转接至壮苗培养基，在温度24±1℃，光照12h/d，光照强度2000Lx的环境条件下培养25d，形成具有5片~7片叶片的组培苗，将组培苗切成带1个~2个腋芽的茎段，转接至壮苗培养基上，在环境条件下培养40d进行增殖培养，重复转接培养直至能满足进行病毒检测取样和保留病毒检测后需要进一步扩繁组培苗数量，由于整个培养过程无丛生芽发生，只有茎段腋芽萌动和生长，组培苗未见形态变异，无玻璃化苗发生；

（6）采用高通量Small RNA测序技术进行病毒快速鉴定，通过对切花菊的病毒病高通量小RNA分析，对脱毒苗实验样本的测序数据和 NCBI 病毒基因组数据库比对分析，发现一些测序序列和病毒序列相似，然后对本次检测样本各病毒序列进行组装分析，但未组装到整条完整的病毒序列，确定脱毒茎尖诱导培养的组培苗未发现病毒。

（7）生根培养：将经过方法检测未发现菊花病毒的组培苗切成带1个~2个腋芽的茎段，转接至生根培养基上，在温度24±1℃，光照12h/d，光照强度2000Lx的环境条件下培养30d，形成具有5片~7片叶片和4条~6条完整根系的组培苗。

（8）选择2月下旬至4月中旬作为组培苗移栽时间，将组培瓶苗移至具有防虫网隔离大棚的架空苗床上，瓶苗上覆盖70%的遮荫网，在大棚内施置15d，使组培苗适应自然光照条件，将组培苗瓶盖打开，早晚不遮荫，中午强光时段在组培瓶苗上覆盖70%的遮荫网，对组培苗开瓶煅炼3d~5d，然后小心取出组培苗，在清水中洗去培养基，将组培苗移栽至准备好椰糠为基质的苗床中，种苗移栽前一星期将椰糠块铺放在苗床上，先浇透水使椰糠块松开，并在基质中施入复合肥N-P-K（15-15-15）20kg/亩，椰糠厚度6cm~8cm，种植深度以将基质覆盖到生根节位部为宜，小心将根系展开于基质中，轻压根部，然浇透定根水，3月中旬后移栽需要遮盖70%遮荫率的遮阳网，防止因强光造成叶片损伤和萎蔫，约一星期根系恢复生长后可去掉遮荫网，组培苗移栽成活率达95%以上。

（9）长日照处理：瓶苗移至大棚当天即开始长日照处理，采用高光效钠灯（150w），每56平方米挂一个灯，使大棚内远离灯光处电照强度最低达70lux以上，每天日照时数大于16小时。

（10）适时施用水溶性配方肥：每10d浇1次1000~1500倍水溶性肥料，为全矿物营养液肥，含有氮、磷、钾大量元素及钙、镁、硫、铁、锰、锌、铜、硼、钼等微量元素。N︰P︰K为20︰20︰20。

（11）病虫害防治：镰刀菌、欧文氏杆菌、丝核菌等土壤传播病害为害根茎部位，主要症状：立枯、青枯、腐烂等，并定期喷25%嘧菌酯1000倍+58%可湿性粉剂甲霜锰锌800倍或烯酰锰锌1000倍，喷10%烯啶虫胺可溶性液剂 1500 倍液，或 20%啶虫脒乳油 1500 倍液或5%吡丙醚EC800倍液，或20％吡虫虫螨腈SC750倍液等杀虫剂防治蚜虫和螨虫等虫害。

实施例2

高茎尖诱导率和组培苗质量的多头菊脱毒培养基质及方法的实施地点为浙江省农业科学院园艺研究所园林花卉遗传育种实验室和嘉兴嘉德园艺有限公司菊花生产基地，方法包括如下步骤：

（1）培养基的配制：包括茎尖诱导基本培养基I和组培各阶段培养基的组分与各组分每升所含重量为：

a）基本培养基：其中，

茎尖诱导基本培养基Ⅰ为蔗糖30g/L，琼脂粉5 g/L，pH 5.8的1/2 B5+Ca（NO₃）₂ 500mg/L培养基；

外植体初代诱导和继代培养基（增殖培养基、壮苗培养基和茎尖诱导培养基Ⅱ）为蔗糖30g/L，琼脂粉5 g/L，pH 5.8的MS培养基；

生根基本培养基为蔗糖30g/L，琼脂粉5 g/L，pH6.0的1/2MS培养基；

b）茎尖诱导培养基Ⅰ：1/2 B5+Ca（NO₃）₂ 500mg/L+6-BA 0.2 mg/L + NAA 0.1mg/L+AC0.5mg/L；

c）茎尖诱导培养基Ⅱ：MS+6-BA 0.1mg/L+ IBA 0.1mg/L；

d）外植体初代诱导与增殖培养基：MS+6-BA0.5 mg/L + IBA 0.1mg/L；

e）壮苗培养基：3/4MS +6-BA 0.2 mg/L+IBA 0.1mg/L

f）生根培养基：1/2MS +IBA 0.3mg/L +AC 0.5mg/L；

（2）种源处理与灭菌：将经过自然低温的冬至芽取回，品种为多头菊“多丽16-86”，用1%洗洁***浸泡10min，经清水冲洗后进行种源茎段灭菌处理，备用；

（3）茎段芽的诱导培养：取灭菌后种源茎段切成每节带一个腋芽为一段，作为外植体，接种于外植体诱导与增殖培养基上，在温度24±1℃，光照12h/d，光照强度2000Lx的环境条件下培养30d至诱导出茎段芽；将该茎段芽切下转接在外植体初代诱导与增殖培养基上，当苗长高至6cm~7cm，将苗切成带1个~2个腋芽的茎段，转接至外植体诱导与增殖培养基上，在环境条件下培养30d进行增殖培养，重复接种培养直至足够数量用于脱毒茎尖诱导培养；

（4）脱毒茎尖诱导培养：当诱导的茎段芽扩繁一定基数后，进行热处理脱毒培养，利用高温培养条件，抑制菊花病毒的繁殖，剥取茎尖进行诱导培养，具体方法：将预先培养的组培苗，当苗长高至6cm~7cm，将苗切成带1个~2个腋芽的茎段，转接至外植体诱导与增殖培养基上，在同上环境条件下培养15d，当新芽萌发苗长至1cm~1.5cm时将组培瓶苗放入光照培养箱内，按昼夜温度28℃~32℃、30℃~35℃、33℃~38℃的顺序，每3d变换一档，使组培苗逐渐适应高温生长环境，然后在33℃~38℃下继续热处理脱毒培养30d，组培苗生长势逐渐变弱，叶色变浅，当组培苗坏死约50%~60%时，选取具有一定活力的组培苗，在无菌操作台上置组培苗于生物镜下放大100倍，剥取0.1~0.3mm的茎尖作为外植体，接种于茎尖诱导培养基Ⅰ，进行茎尖诱导培养，在温度24±1℃，光照12h/d，光照强度2000Lx的环境条件下培养30d，将已有萌动的茎尖转接至茎尖诱导培养基Ⅱ，在同上环境条件下培养30d，将明显转绿的茎尖组织转接至茎尖诱导培养基Ⅰ，在同上环境条件下培养30d，如此交替培养，至形成生长正常的有1片~2片展开叶的幼苗；

（5）增殖培养：将培养的具有1片~2片展开叶的幼苗，转接至壮苗培养基，在温度24±1℃，光照12h/d，光照强度3000Lx的环境条件下培养25d，形成具有5片~7片叶片的组培苗，将组培苗切成带1个~2个腋芽的茎段，转接至壮苗培养基上，在环境条件下培养40d进行增殖培养，重复转接培养直至能满足进行病毒检测取样和保留病毒检测后需要进一步扩繁组培苗数量，由于整个培养过程无丛生芽发生，只有茎段腋芽萌动和生长，组培苗未见形态变异，无玻璃化苗发生；

（6）采用高通量Small RNA测序技术进行病毒快速鉴定，通过对切花菊的病毒病高通量小RNA分析，对脱毒苗实验样本的测序数据和 NCBI 病毒基因组数据库比对分析，发现一些测序序列和病毒序列相似，然后对本次检测样本各病毒序列进行组装分析，但未组装到整条完整的病毒序列，确定脱毒茎尖诱导培养的组培苗未发现病毒。

（7）生根培养：将经过方法检测未发现菊花病毒的组培苗切成带1个~2个腋芽的茎段，转接至生根培养基上，在温度24±1℃，光照12h/d，光照强度3000Lx的环境条件下培养30d，形成具有5片~7片叶片和4条~6条完整根系的组培苗。

（8）选择2月下旬至4月中旬作为组培苗移栽时间，将组培瓶苗移至具有防虫网隔离大棚的架空苗床上，瓶苗上覆盖70%的遮荫网，在大棚内施置15d，使组培苗适应自然光照条件，将组培苗瓶盖打开，早晚不遮荫，中午强光时段在组培瓶苗上覆盖70%的遮荫网，对组培苗开瓶煅炼3d~5d，然后小心取出组培苗，在清水中洗去培养基，将组培苗移栽至准备好椰糠为基质的苗床中，种苗移栽前一星期将椰糠块铺放在苗床上，先浇透水使椰糠块松开，并在基质中施入复合肥N-P-K（15-15-15）20kg/亩，椰糠厚度6cm~8cm，种植深度以将基质覆盖到生根节位部为宜，小心将根系展开于基质中，轻压根部，然浇透定根水，3月中旬后移栽需要遮盖70%遮荫率的遮阳网，防止因强光造成叶片损伤和萎蔫，约一星期根系恢复生长后可去掉遮荫网，组培苗移栽成活率达95%以上。

（9）长日照处理：瓶苗移至大棚当天即开始长日照处理，采用高光效钠灯（150w），每56平方米挂一个灯，使大棚内远离灯光处电照强度最低达70lux以上，每天日照时数大于16小时。

（10）适时施用水溶性配方肥：每7d浇1次1000~1500倍水溶性肥料，为全矿物营养液肥，含有氮、磷、钾大量元素及钙、镁、硫、铁、锰、锌、铜、硼、钼等微量元素。N︰P︰K为20︰20︰20。

（11）病虫害防治：镰刀菌、欧文氏杆菌、丝核菌等土壤传播病害为害根茎部位，主要症状：立枯、青枯、腐烂等，并定期喷25%嘧菌酯1000倍+58%可湿性粉剂甲霜锰锌800倍或烯酰锰锌1000倍，喷10%烯啶虫胺可溶性液剂 1500 倍液，或 20%啶虫脒乳油 1500 倍液或5%吡丙醚EC800倍液，或20％吡虫虫螨腈SC750倍液等杀虫剂防治蚜虫和螨虫等虫害。