阅读说明：本技术 制备东方火腹蟾蜍抗菌肽bombinin的方法及其应用 (Method for preparing toad antibacterial peptide bombinin and application thereof ) 是由 张小蒙 张莉 周敏 于 2019-10-09 设计创作，主要内容包括：本发明属于基因工程技术领域,涉及一种制备东方火腹蟾蜍抗菌肽bombinin的方法及其应用。该方法包括以下步骤：(1)获取东方火腹蟾蜍抗菌肽bombinin的基因,所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；(2)利用所述基因构建pBKPU01-Bombinin重组表达载体；(3)将所述载体转化到宿主菌中构建工程菌；(4)利用所述工程菌表达所述东方火腹蟾蜍抗菌肽bombinin,获取所述东方火腹蟾蜍抗菌肽bombinin。该方法能够获得大量的东方火腹蟾蜍抗菌肽bombinin。(The invention belongs to the technical field of genetic engineering, and relates to a method for preparing toad venom antibacterial peptide bombinin and application thereof. The method comprises the following steps: (1) obtaining a gene of toad venom antibacterial peptide bombinin, wherein the nucleotide sequence of the gene is shown as SEQ ID No. 1; (2) constructing a pBKPU01-Bombinin recombinant expression vector by using the gene; (3) transforming the vector into host bacteria to construct engineering bacteria; (4) and expressing the toad-fire-belly toad antibacterial peptide bombinin by using the engineering bacteria to obtain the toad-fire-belly toad antibacterial peptide bombinin. The method can obtain large amount of Bufo siccus antibacterial peptide bombinin.)

制备东方火腹蟾蜍抗菌肽bombinin的方法及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，更具体地，涉及一种制备东方火腹蟾蜍抗菌肽bombinin的方法及其应用。

背景技术

近年来，抗生素在动物养殖业中的大量滥用，导致抗生素耐药性菌株不断出现、药物残留、环境污染和生态破坏等诸多问题，严重威胁到人类健康和畜牧业的发展。因此，寻找一种替代抗生素的药物制剂迫在眉睫。

抗菌肽是昆虫体内产生的一类分子量在2000～7000左右，由20～60个氨基酸残基组成的具有抗菌活性的碱性多肽。多数抗菌肽具有强碱性、广谱抗菌性、热稳定性好、无毒、无残留、无副作用、安全高效、对环境无污染且不易产生细菌耐药性等优点。

东方火腹蟾蜍抗菌肽Bombinin是由东方火腹蟾蜍产生的一种碱性小分子多肽，cDNA全长60bp，分子量为2382Da，编码20个氨基酸。研究表明该类抗菌肽依靠电荷效应来杀菌，并且还具有免疫激活和调节等作用。

因此，亟需一种制备东方火腹蟾蜍抗菌肽bombinin的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种制备东方火腹蟾蜍抗菌肽bombinin的方法及其应用，以提高东方火腹蟾蜍抗菌肽bombinin的产量，并降低生产成本。

为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种制备东方火腹蟾蜍抗菌肽bombinin的方法。该方法包括以下步骤：

(1)获取东方火腹蟾蜍抗菌肽bombinin的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示；

(2)利用所述基因构建pBKPU01-Bombinin重组表达载体；

(3)将所述载体转化到宿主菌中构建工程菌；

(4)利用所述工程菌表达所述东方火腹蟾蜍抗菌肽bombinin，获取所述东方火腹蟾蜍抗菌肽bombinin。

在本发明中，SEQ ID No.1所示的核苷酸序列为5′-CGCGAAGCCCGACUGAACUUCUCAGCCGGACGGGAGCAGCGCGUGAAGGCAAAG-3′。该序列可以为人工合成的序列。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)包括以下步骤：

利用T4 DNA连接酶将所述基因与pBKPU01表达载体进行连接，形成pBKPU01-Bombinin重组质粒；

将所述pBKPU01-Bombinin重组质粒转入大肠杆菌DH5α中进行培养；

从培养后的所述转入大肠杆菌DH5α中提取所述pBKPU01-Bombinin重组质粒，并进行PCR和酶切鉴定，从而得到所述pBKPU01-Bombinin重组表达载体。通过步骤(2)不但能够获得所述pBKPU01-Bombinin重组表达载体，还能够进行原核表达鉴定。

本领域技术人员可以根据实际情况选择步骤(3)中的宿主菌，来构建工程菌。优选地，在步骤(3)中，所述宿主菌为毕赤酵母。可以采用电转化的方式将所述载体转化到宿主菌中。

在本发明的一种实施方式中，步骤(4)包括以下步骤：

将所述工程菌接种于MD液体培养基中，于25-32℃，100-130r/min的条件下，培养20-48小时，然后转接到含有甲醇的缓冲性复杂培养基(Buffered Methanol-complexMedium，简称BMMY培养基)的发酵罐中发酵18-36小时，离心，取上清，从而获得所述东方火腹蟾蜍抗菌肽bombinin。离心条件可以为10000r/min，离心5min。

在本发明的一种优选实施方式中，所述方法还包括：(5)对所述东方火腹蟾蜍抗菌肽bombinin进行检测。具体操作为，采用琼脂扩散法对抗菌肽bombinin的抑菌活性进行检测。例如，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、鲍氏不动杆菌或者克柔假丝酵母的抑菌活性进行检测。

所述东方火腹蟾蜍抗菌肽bombinin的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。所述SEQID No.2的核苷酸序列为5′-REARLKFSAGREQRVKAK-3′。

本发明第二方面提供一种上述方法制备的所述东方火腹蟾蜍抗菌肽bombinin在制备抑制和/或杀死菌株的制剂中的应用。

优选地，所述菌株为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、鲍氏不动杆菌和克柔假丝酵母中的至少一种。

本发明第三方面提供一种上述方法制备的所述东方火腹蟾蜍抗菌肽bombinin在动物饲料添加剂中的应用。

利用本发明提供的制备东方火腹蟾蜍抗菌肽bombinin的方法能够获得大量的东方火腹蟾蜍抗菌肽bombinin。

利用本发明提供的制备东方火腹蟾蜍抗菌肽bombinin的方法能够获得一株在毕赤酵母中高效表达，并且有实际生产能力的产抗菌肽Bombinin的菌株。

本发明提供的制备东方火腹蟾蜍抗菌肽bombinin的方法能够应用于实际生产中。

本发明的其它特征和优点将在随后

具体实施方式

部分予以详细说明。

附图说明

通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。

图1示出了PCR扩增东方火腹蟾蜍抗菌肽Bombinin基因凝胶电泳图。图中，M代表5000bp DNA marker；1代表PCR产物。

图2示出了抗菌肽Bombinin溶血实验结果。

图3示出了不同温度处理后的抗菌肽Bombinin分别作用于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的结果图。图中，A代表金黄色葡萄球菌；B代表大肠杆菌。

图4示出了不同pH值处理后的抗菌肽Bombinin分别作用于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的结果图。图中，A代表金黄色葡萄球菌；B代表大肠杆菌。

图5示出了不同浓度胰蛋白酶处理后的抗菌肽Bombinin分别作用于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的结果图。图中，A代表金黄色葡萄球菌；B代表大肠杆菌。

具体实施方式

下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。

下述实施例和测试例所用的材料如下：

质粒和菌株

毕赤酵母购自Invitrogen公司；pBKPU01表达载体由本实验室构建并保存；金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等微生物购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。

主要试剂和仪器

质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、蛋白小分子量Marker等购自生工生物工程(上海)股份有限公司；EcoR V酶、胰蛋白酶等购自宝生物工程(大连)有限公司；培养基、血液琼脂等购自江苏凯基生物技术股份公司；其他化学试剂为国产分析纯。

PCR仪(美国Thermo Scientific公司)；超净工作台(上海博迅医疗生物仪器股份有限公司)；凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)；小型垂直蛋白电泳仪(北京六一生物科技有限公司)；恒温震荡器(上海金鹏分析仪器有限公司)；恒温培养箱和恒温培养摇床(上海和呈仪器制造有限公司)。

实施例1

本实施例提供东方火腹蟾蜍抗菌肽bombinin的基因。

根据已知东方火腹蟾蜍抗菌肽Bombinin的氨基酸序列(如SEQ ID No.2所示)，以毕赤酵母密码子偏好性为原则，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成东方火腹蟾蜍抗菌肽Bombinin基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

实施例2

本实施例用于构建pBKPU01-Bombinin重组表达载体。

将实施例1制备的东方火腹蟾蜍抗菌肽bombinin的基因与pBKPU01表达载体用T4DNA连接酶进行连接，转入大肠杆菌DH5α中进行培养，挑选10个单菌落进行测序鉴定。测序鉴定结果显示，基因序列100％正确且无碱基突变。

实施例3

本实施例用于转化pBKPU01-Bombinin重组表达载体。

将实施例2中经过鉴定的含有pBKPU01-Bombinin重组表达载体的大肠杆菌接种到LB培养基中进行培养，然后用质粒提取试剂盒进行提取，EcoR V酶切线性化后用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，用胶回收试剂盒进行回收。再将线性化的质粒通过电击导入到毕赤酵母中，30℃培养4h。各取200μL涂布于6个MD固体培养上。30℃培养4天后，每个平板挑取5个圆形、表面湿润、边缘整齐的不透明菌落，共30个，分别用1～30进行编号。详见下述的测试例2。

实施例4

本实施例用于表达pBKPU01-Bombinin重组表达载体。

将实施例3挑取的30个单菌落分别接种于MD液体培养基中30℃，120r/min培养4天，之后转接到BMMY培养基中，30℃，120r/min开始诱导，每24h加一次浓度为0.5％的甲醇，分别在24h、48h、72h取样，并且10000r/min离心5min，取上清液备用。

抗菌肽Bombinin初步抗菌结果如表1所示。

表1抗菌肽Bombinin初步抗菌结果(抑菌圈直径，cm)

实施例5

本实施例用于初步鉴定抗菌株。

制备120个含金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的平板，然后用打孔器打孔，每孔加入50μL培养48小时获取的上清液，初步鉴定抗菌肽Bombinin活性。利用甲醇的浓度为0.5％的MD液体培养基，培养时间为24-96h，经多次重复筛选后获得一株表达量稳定，抗菌活性较好的pBKPU01-Bombinin-20号菌株。筛选得到pBKPU01-Bombinin-20号菌株，提取DNA，设计特异性引物，引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示：5′-CGCGAAGCCCGACUGAACUUCUCAGCCGGACGGGAGCAGCGCGUGAAGGCAAAG-3′，PCR扩增含东方火腹蟾蜍抗菌肽Bombinin的目的基因，理论应获得2510bp的基因片段，从图1中可以看出，获得的片段与理论值相等。由此说明pBKPU01-Bombinin-20号菌株表达抗菌肽Bombinin的目的基因已经和毕赤酵母染色体整合。

实施例6

本实施例对抗菌活性高的菌株进行发酵。

先将实施例5获得的pBKPU01-Bombinin-20号菌株接种到MD液体培养基中30℃，120r/min培养1天，然后转接到含有BMMY培养基的4L小型发酵罐中发酵1天，将发酵液在10000r/min的条件下，离心5min，取上清备用。

发酵液的抑菌活性检测和抗菌谱的测定。

东方火腹蟾蜍抗菌肽Bombinin菌株pBKPU01-Bombinin-20在4L小型发酵罐中发酵24h，利用打孔法每孔加入50μL发酵液提取的上清液，分别对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、鲍氏不动杆菌和克柔假丝酵母进行体外杀菌实验。结果如表2所示。

表2发酵液对不同微生物的抑制效果(抑菌圈直径，cm)

由表2可知，东方火腹蟾蜍抗菌肽Bombinin菌株对于金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、鲍氏不动杆菌和克柔假丝酵母均具有很好的抑菌杀菌效果。

测试例1

本测试例为抗菌肽Bombinin的溶血性试验。抗菌肽的溶血性直接反应了其在生物体内应用的生物安全性，通常选用哺乳动物血红细胞来测定的溶血性。

采用脱纤维绵羊血测定抗菌肽Bombinin的溶血活性。5g的血液琼脂基础培养基中入加100mL蒸馏水，消毒灭菌后，加入10mL脱纤维绵羊血，充分摇匀后做成平板，利用打孔法每孔加入50μL发酵液的上清液，28℃培养观察。结果如图2所示，东方火腹蟾蜍抗菌肽Bombinin没有显示溶血性，说明该抗菌肽Bombinin在生物体内应用是安全性的。

测试例2

本测试例提供抗菌肽Bombinin的耐性实验。

1)耐高温实验：将发酵液分别于60℃、70℃、80℃、90℃下处理1h，然后检测抗菌肽Bombinin活性变化。结果请参见图3，图3示出了不同温度处理后的抗菌肽Bombinin分别作用于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的结果图。图中，A代表金黄色葡萄球菌；B代表大肠杆菌。抗菌肽Bombinin的活性随着温度的升高活性减弱，说明该抗菌肽对温度比较敏感，不耐高温。

2)耐酸碱实验：将发酵液分别于pH值2、4、6、8、10下处理1h，然后将pH值调回5.1～5.4，然后检测抗菌肽Bombinin活性变化。结果请参见图4，图4示出了不同pH值处理后的抗菌肽Bombinin分别作用于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的结果图。图中，A代表金黄色葡萄球菌；B代表大肠杆菌。如图4所示，抗菌肽Bombinin的活性在酸碱环境下变化不大，说明该抗菌肽对酸碱不敏感，具有较好的耐受性。

3)耐消化酶实验：将发酵液分别于1U、2U、5U、10U的胰蛋白酶下37℃水浴处理1h，然后检测抗菌肽Bombinin活性变化。结果请参见图5，图5示出了不同浓度胰蛋白酶处理后的抗菌肽Bombinin分别作用于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的结果图。图中，A代表金黄色葡萄球菌；B代表大肠杆菌。如图5所示，经过胰蛋白酶处理，抗菌肽Bombinin的活性明显丧失，说明该抗菌肽消化酶处理很敏感，对消化酶的耐受性很弱。

以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。

序列表

<110> 江苏医药职业学院

<120> 制备东方火腹蟾蜍抗菌肽bombinin的方法及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 54

<212> RNA

<213> Bombina orientalis

<400> 1

cgcgaagccc gacugaacuu cucagccgga cgggagcagc gcgugaaggc aaag 54

<210> 2

<211> 18

<212> PRT

<213> Bombina orientalis

<400> 2

Arg Glu Ala Arg Leu Lys Phe Ser Ala Gly Arg Glu Gln Arg Val Lys

1 5 10 15

Ala Lys