阅读说明：本技术 一种中华鳖的趋化因子蛋白的表达方法及应用 (Expression method and application of chemotactic factor protein of Chinese softshell turtle ) 是由 徐洁皓 钱国英 徐程 于 2019-11-16 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种中华鳖的抗细菌病相关蛋白及其应用,即制备重组蛋白并鉴定重组表达产物的抑菌活性,并制备绿色饲料添加剂以及抗菌剂。本发明所提供对的中华鳖的趋化因子蛋白,其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。本发明还提供一种用于在大肠杆菌中重组表达的上述趋化因子蛋白的核苷酸片段,其核苷酸序列为SEQ ID NO:3。本发明提供的基因与免疫抗病相关,其体外重组表达的蛋白能够明显抑制革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌的增殖,因此,在中华鳖病害防治、饲料添加剂及杀菌剂等方面有应用价值。(The invention provides an antibacterial disease related protein of Chinese softshell turtles and application thereof, namely preparing a recombinant protein, identifying the bacteriostatic activity of a recombinant expression product, and preparing a green feed additive and an antibacterial agent. The amino acid sequence of the chemotactic factor protein of the Chinese softshell turtle provided by the invention is SEQ ID NO. 1. The invention also provides a nucleotide fragment of the chemotactic factor protein for recombinant expression in escherichia coli, and the nucleotide sequence is SEQ ID NO. 3. The gene provided by the invention is related to immune disease resistance, and the in vitro recombinant expressed protein can obviously inhibit the proliferation of gram-negative bacteria and gram-positive bacteria, so that the gene has application values in the aspects of disease control of the Chinese softshell turtle, feed additives, bactericides and the like.)

一种中华鳖的趋化因子蛋白的表达方法及应用

技术领域

本发明属于水产免疫防治技术领域，具体涉及一种中华鳖的抗细菌病相关蛋白及其应用。

背景技术

中华鳖(Pelodiscus sinensis)是我国传统的淡水养殖品种，在浙江、湖南、湖北、江西、安徽、江苏等省产量较高，因其肉质鲜美、营养丰富而广受消费者喜爱，具有良好的市场需求。近几年来，由于养殖密度增加、养殖环境日益恶劣，中华鳖在养殖过程中遭受了各类病害微生物的侵害，给养殖户造成了巨大的经济损失。

目前养殖户多采用抗生素等化学药物进行治疗，存在较大的生态环境污染和食品安全的隐患。因此不仅要着力于中华鳖免疫机理的研究，也要加紧研发更加环保、有效的抗生素替代品或免疫防治产品，形成利于中华鳖疾病控制和产业持续发展的新兴的养殖管理模式，维系整个中华鳖养殖产业的健康发展。

趋化因子是具有化学引诱性和分泌性的小分子蛋白，可以诱导白细胞群体的迁移和活化，并通过激活趋化因子受体来调节免疫应答。趋化因子具有杀菌抑菌活性，是潜在的抗生素替代品；并能募集白细胞，活化免疫细胞，促进CD4+T细胞的极化。此外趋化因子作为一种由宿主产生的免疫调控因子，在疫苗引发的免疫反应中，趋化因子在疫苗诱导阶段能在注射处起到抗原呈递的作用，而在后期效应阶段又能起到免疫效应分子的作用，从而加强其活性和功能或促进细胞内生物活性分子的表达与分泌，具有良好的免疫佐剂性能。

前期，基于转录组学技术和生物信息学分析筛选得到能响应外界LPS 免疫刺激的中华鳖趋化因子A。趋化因子A由巨噬细胞和白细胞分泌而来，从LPS刺激的巨噬细胞中首次分离得到，其在细胞迁移、Th1细胞分化和CD8+T细胞信号转导的调节中起重要作用。在水生动物中，趋化因子A已被证明参与某些硬骨鱼的先天性免疫和适应性免疫，在虹鳟(Oncorhynchus mykiss)中，LPS能够诱导机体肠道、卵巢以及脾脏中趋化因子A基因转录水平的上调；在卵形鲳鲹(trachinotus ovatus)中，有抗菌作用；在团头鲂，学者初步证明趋化因子A具有潜在促炎作用；石斑鱼(Epinephelus coioides)中，研究者发现LPS和poly(I:C)均能促进趋化因子A mRNA表达量的增加，同时还证明趋化因子A能够激活白细胞，诱导炎症反应，促使淋巴细胞分向Th1通路分化。

由于趋化因子蛋白含有跨膜结构域，且分子量较小，在原核表达和蛋白纯化中存在一定的困难。本发明对趋化因子A的核苷酸进行了优化，解决其表达难、纯化难的问题，并进一步提高其表达量。同时中华鳖中尚未有该趋化因子的研究，也未有将其应用于抗菌性免疫的相关研究。故本项目我们不仅提出了一种可行的核苷酸改造方法以获得体外蛋白，还进一步研究趋化因子A在体内的免疫应答，在体外的抗菌功能，探索其是否具有作为抗菌药物、免疫佐剂的应用推广价值，为中华鳖病害的免疫防治奠定基础。

发明内容

本发明提供一种中华鳖的抗细菌病相关蛋白及其应用，即制备重组蛋白并鉴定重组表达产物的抑菌活性，并制备绿色饲料添加剂以及抗菌剂。

本发明首先提供一种中华鳖的趋化因子蛋白，包含有：

1)氨基酸序列为SEQ ID NO:1的蛋白；

2)在1)中蛋白序列上取代、缺失、添加一个或几个氨基，具有1)蛋白功能，由1)所衍生的蛋白；

MKVSVAALAVLLIAAFCSQASSAPIGSDPPTACCFTYASRKIPRTLVE DYYDTNSMCSQPAIVFITKKGREICANPQADWVQEYVAYLDQN(SEQ ID NO:1)；

编码上述趋化因子蛋白的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO:2；

ATGAAGGTCTCCGTGGCTGCCCTCGCCGTCCTGCTCATCGCGGCC TTCTGCTCCCAGGCCTCCTCCGCCCCAATTGGCTCCGACCCCCCGACT GCCTGCTGCTTTACCTACGCCTCTCGGAAGATCCCGCGCACCTTGGTGGAGGATTATTATGATACCAACAGCATGTGCTCCCAGCCTGCCATTGTCT TCATCACAAAGAAGGGCCGGGAGATCTGTGCCAACCCCCAGGCGGA CTGGGTCCAGGAGTATGTGGCTTACTTGGATCAGAACTGA；

本发明还提供一种用于在大肠杆菌中重组表达的上述趋化因子蛋白的核苷酸片段，其核苷酸序列为SEQ ID NO:3：

ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTG CCGCGCGGCAGCCATATGACCTATGCGAGCCGCAAAATTCCGCGCAC CCTGGTGGAAGATTATTATGATACCAACAGCATGTGCAGCCAGCCGGC GATTGTGTTCATTACCAAAAAAGGCCGCGAAATTTGCGCGAACCCGC AGGCGGATTGGGTGCAGGAATATGTGGCGTATCTGGATCAGAACACCT ATGCGAGCCGCAAAATTCCGCGCACCCTGGTGGAAGATTATTATGATA CCAACAGCATGTGCAGCCAGCCGGCGATTGTGTTCATTACCAAAAAA GGCCGCGAAATTTGCGCGAACCCGCAGGCGGATTGGGTGCAGGAATA TGTGGCGTATCTGGATCAGAACCTCGAGCACCACCACCACCACCACT GA；

本发明再一个方面提供一种重组表达载体，所述的重组表达载体携带有上述的核苷酸序列为SEQ ID NO:3的片段；

本发明还提供一种重组大肠杆菌工程菌，所述的重组大肠杆菌工程菌转化有上述的重组表达载体；

本发明的重组大肠杆菌工程菌重组表达的蛋白用于制备中华鳖抗细菌病防治的制品、饲料添加剂和抗菌剂。

本发明提供的基因与免疫抗病相关，其体外重组表达的蛋白能够明显抑制革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌的增殖，因此，在中华鳖病害防治、饲料添加剂及杀菌剂等方面有应用价值。

附图说明

图1：本发明的趋化因子基因扩增图，其中泳道1，3是小肠样本和大肠样本中β-actin电泳；泳道2，4是小肠样本和大肠样本中的趋化因子A；

图2：qRT-PCR定量检测基因在健康中华鳖成鱼各个组织中的表达水平图，其中横坐标表示中华鳖不同的组织(Ki:肾脏Lu:肺IC:大肠Li: 肝脏In:小肠Sp:脾脏He:心脏Mu:肌肉)，纵坐标表示基因在不同组织中的表达量；

图3：中华鳖趋化因子A基因在LPS刺激感染后免疫相关组织中的表达分析图；横坐标表示感染后不同时间点，纵坐标表示抗细菌病相关基因在不同组织中的表达量。共检测了6个组织，包括：肠(Intestine)，肺(Lung)，肝脏(Liver)，脾脏(Spleen)。

图4：使用序列为SEQ ID NO:2的核苷酸片段进行重组蛋白的诱导表达图，其中泳道1-6分别是：1.未诱导的菌液；2. 0.5mmol IPTG 28℃诱导12h 3. 0.5mmol IPTG 37℃诱导12h 4. 1mmol IPTG 28℃诱导12 h 5. 1mmol IPTG 37℃诱导12h 6. 1mmol IPTG 37℃诱导24h；

图5：使用改造的序列为SEQ ID NO:3的核苷酸片段进行重组蛋白的诱导表达图，其中图a是趋化因子A-like原核表达质粒小量表达BL21表达蛋白电泳图，M：大分子量蛋白marker；1：未诱导；2：诱导1小时； 3：诱导2小时；4：诱导4小时；5：诱导过夜；

图b是重组蛋白的可溶性分析图，M：大分子量蛋白marker；1：未诱导菌液；2：全菌；3：超声波破碎后沉淀；4：超声波破碎后上清；

图6：改造后中华鳖趋化因子A重组蛋白的分离纯化图，其中图a中 M:大分子量蛋白marker；1-6：每0.5mL Elution Buffer D依次洗脱得到的溶液；7：未诱导菌液；8：诱导菌液；图b中M：大分子量蛋白marker；1-6 每0.5mL Elution Buffer E依次洗脱得到的溶液。

图7：重组蛋白体外抑菌活性分析图，其中(1)趋化因子A的重组蛋白抑制革兰氏阴性菌大肠杆菌(E.coli)和嗜水气单胞菌(A.hydrophila)效果示意图，0μg/mL为PBS作为阴性对照组；其余为3个不同浓度的重组蛋白作为实验组：1μg/mL，2μg/mL和4μg/mL(2)趋化因子A的重组蛋白抑制革兰氏阳性菌苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)效果示意图，0μg/mL为PBS作为阴性对照组；其余为3个不同浓度的重组蛋白作为实验组，分别是1μg/mL，2μg/mL和4μg/mL。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术路线和优点更加清晰明确，下面结合附图对本发明举例进行详细描述。

实施例1：中华鳖趋化因子A基因的克隆及其序列分析

发明人首先通过对以前筛选出来的中华鳖外源刺激后转录组学数据的分析，发现了本趋化因子基因能够及时响应外源刺激，获得了基因的全长 cDNA序列。

1)实验方法：Trizol法提取RNA、cDNA的合成、PCR扩增

Trizol法提取RNA：取大约100mg左右的组织块，放入加了1mL Trizol 试剂的无酶离心管中，用研磨棒冰上研磨，静置10min后4℃/12000rpm 离心10min，弃沉淀；加入200μL氯仿，剧烈摇动30s后静置5min使之充分混匀，4℃，12000rpm离心15min；吸取上清液，加入等体积的异丙醇，充分混匀后室温静置10min，4℃，12000rpm离心10min，弃清液；再用75％的乙醇洗涤两次，4℃下12000rpm离心3min并小心弃上清液；室温放置干燥5min尽量除尽乙醇；加入适量RNase-Free H₂O，将RNA沉淀充分溶解；用琼脂糖凝胶电泳检测总RNA质量，RNA/DNA分光光度计测定RNA纯度及浓度；将提取的RNA放在-80℃保存。

cDNA合成：将提取的RNA按PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Code No.RR047A)(Takara公司)试剂盒说明反转录成cDNA，合成的cDNA-20℃保存。

PCR扩增：根据序列分析的结果设计扩增引物，片段长度为358bp，覆盖编码区序列，

引物序列如下：

试剂	使用量
		Tap PCR master Mix	25μL
ddH2O	21μL
		Primer F	1μL
Primer R	1μL
		DNA template	2μL
Total	50μL

PCR反应程序如下：

(3)全长cDNA的获取及同源性分析

将PCR产物回收，连接、转化，挑取阳性克隆送往生工测序，确定 NCBI上序列的正确性。该基因的cDNA全长为630bp，CDS区域为276bp (SEQ ID NO:2)，该基因的开放阅读框编码一个91个氨基酸的蛋白(SEQ ID NO:1)，与爬行类、禽类同源性高。

实施例2：中华鳖趋化因子A在健康中华鳖不同组织的表达水平分析

(1)设计定量引物并验证引物的特异性

根据抗细菌病相关基因序列设计目的基因定量扩增引物，进行普通 PCR扩增，电泳检测，克隆测序，若电泳条带单一明亮，且阴性对照无条带，克隆测序分析为目的基因序列，初步断定此引物特异；另外再进行荧光定量PCR上机，观察峰图、CT值以及扩增效率，若荧光定量PCR发现峰图单一，且内参基因与目的基因的扩增效率几乎完全一致，证明引物特异，可以用来进行实时定量PCR实验。

引物序列如下：

(2)用荧光定量PCR方法检测趋化因子A基因在不同组织的表达水平

首先取健康中华鳖的4个组织，分别为肝脏、脾脏、肺、肠，用Trizol 法提取RNA并反转录成cDNA。

荧光定量PCR：用上述引物进行荧光定量PCR反应检测趋化因子A 基因在各个组织中的相对表达量。根据SYBR Green Real time PCR Master Mix试剂盒说明书，配制体系，设计程序，扩增得到该基因在各组织的CT 值。根据2-ΔΔCt法计算每个组织的相对表达量，并以内源性对照基因β-actin为参照进行标准化计算。所有数据均用平均值(标准差)的方式表示，采用SPSS16.0对实验数据进行统计分析

荧光定量PCR结果显示(图2)，趋化因子A-like基因在中华鳖肾脏、肺、大肠、肝脏、小肠、脾脏、心脏、肌肉中均有不同程度的表达，其中，在肾脏中的相对表达量最低，脾脏中的表达量最高，是肾脏中表达量的6.79 倍；其次是肝脏和大肠，表达量分别是肾脏中的6.08倍和4.02倍。。

实施例3：中华鳖趋化因子A基因在感染LPS免疫相关组织中的相对表达量分析

以LPS代替革兰氏阴性菌，对中华鳖进行感染实验。设置对照组和实验组，对照组注射200μL生理盐水溶液(0.75％)，实验组注射LPS粉末(Sigma，0.4mg/100g)溶于200μL生理盐水溶液(0.75％)。在注射后0h，4h，12h，24h，48h的5个时间点，分别取肝脏、脾脏、肾脏、肠、鳃和皮肤6个组织。用荧光定量PCR的方法检测抗细菌病相关基因在上述6个组织中的表达量。所用引物、试剂和实验方法均同上所述。

结果显示，在注射LPS后各组织的抗细菌病相关基因的表达水平均有不同程度的上调：在脾脏中，在4h，抗细菌病相关基因的表达量达到最高，直到48h才恢复至正常值；在肝脏中，LPS刺激组基因表达量在4h时达到最高，之后12h-48h表达量略有下降但仍显著高于对照组；在肺中，LPS 刺激组基因表达量从4h开始显著上调，12h达到最高值，48h恢复至初始值；同样的，在肠道中LPS刺激组基因表达量从4h开始显著上调，12h 达到最高值，48h恢复至初始值。这些结果表明，LPS刺激后，正常情况下中华鳖免疫相关组织中趋化因子A基因表达量极低的的表达量明显升高，表明趋化因子A基因对LPS(革兰氏阴性菌)感染有强烈的免疫防御作用(图3)。

实施例4、本发明筛选基因的体外重组表达及其产物抑菌活性分析

1)中华鳖趋化因子A基因重组表达载体的构建方法：

设计原核表达载体。结果发现SEQ ID NO:2的核苷酸序列，即使调整不同的IPTG诱导浓度以及诱导温度、延长诱导时间，都无法高效地表达蛋白(图4)。

通过对目的蛋白的氨基酸序列进行分析后，确定了信号肽和跨膜区后，将密码子优化以便更好地适应大肠杆菌原核表达系统，并将优化后的序列进行串联设计，构建至原核表达载体pET-28a，转化至感受态BL21(DE3)工程菌中，高效地得到外源蛋白。经诱导，纯化，透析和复性后，体外获得中华鳖趋化因子A重组蛋白(结果见图5)。图5a显示优化后的表达质粒在诱导的1h时就开始产生重组蛋白，过夜诱导可以大大增加重组蛋白的表达量。图5b显示37℃过夜诱导，得到大量的包涵体蛋白。通过该方式表达的重组蛋白不仅提高了表达效率，且4μg/mL或16μg/mL的表达产物即可对革兰氏阴性或者阳性菌起到较强的抑制作用，效果远远优于文献记载的其它某物种趋化因子150μg/mL的作用浓度。

实现上述目标的具体方案如下：

1.抗细菌病相关基因重组表达载体的构建方法：

分析目的蛋白的氨基酸序列，设计原核表达载体，优化密码子，串联有效结构域，通过多肽合成将序列(SEQ ID NO:3)构入表达载体pET-28a，并转化至感受态BL21(DE3)中，测序正确后备用。

2.重组蛋白的诱导表达与表达产物的分析

将BL21(DE3)A-抗细菌病相关基因菌株的单克隆接种至1mL含有终浓度50μg/mLKana+的LB液体培养基中，37℃200rpm培养8h后，按1： 500的接种比例接种至200mL卡那霉素抗性的LB培养基中，扩大培养(条件同上)至OD₆₀₀为0.4-0.6。添加终浓度1mM的IPTG，采用37℃、200 rpm条件诱导6-12h。取1mL诱导表达后的菌液、对照组空载体和未诱导的菌液等三种菌液同时进行蛋白表达的SDS-PAGE电泳检测，结果表明，在10kD-20kD之间有差异表达的蛋白条带出现(图5b)。将诱导后的菌液在4℃,8000r/min离心5-10min，收集全部菌体，而后加入裂解液(裂解液：每g菌体中加入PBS缓冲液10mL，DNAase I 20U，PMSF 400μL(50mM)，溶菌酶400μL(10mg/ml)。冰浴中超声破碎20min，条件为超声1s，暂停2s。在菌液上清液和破碎后的菌体沉淀中按照1:5的比例加入6×SDS上样Buffer，煮沸5min；SDS-PAGE电泳检测表达结果，结果表明破碎后的菌体沉淀中蛋白含量明显高于上清，抗细菌病相关重组蛋白主要以包涵体的形式存在，结果见图5b。

3.中华鳖趋化因子重组蛋白的纯化和验证

利用Ni柱纯化蛋白，空柱底部置垫片，加1mL镍珠填料，另取一垫片置于胶上，用1mL dd H₂O重复洗脱3次，再用1mL Lysis Buffer B(100 mM NaH₂PO₄、10mM Tris·Cl、8Murea.pH 8)重复洗脱3次；将蛋白样品沉淀溶解于4mL Lysis Buffer B(100mM NaH₂PO₄、10mM Tris·Cl、8M urea.pH 8)，振荡至溶液为半透明状，离心10000rpm，15min，收集上清液，将该溶液加至柱中；水平摇床振荡200rmp，20min；打开柱子底部盖子，收集洗脱液；用2mL Wash Buffer C(100mM NaH₂PO₄、10mM Tris·Cl8 M urea.pH 4.5)重复洗脱2次，收集洗脱液；用0.5mL Elution Buffer D(100 mM NaH₂PO₄、10mM Tris·Cl、8M urea.pH 5.9)重复洗脱6次，收集洗脱液；用0.5mL Elution Buffer E(100mM NaH₂PO₄、10mM Tris·Cl、8Murea. pH 6.3)重复洗脱6次，收集洗脱液；采用12％浓度的SDS-PAGE电泳进行蛋白大小和纯度的检测(图6)。确定目的蛋白后用浓度梯度降低的尿素进行透析，协助蛋白进行折叠，获得复性蛋白，电泳结果显示为单一条带。采用BCA蛋白定量试剂盒对透析后的蛋白进行定量分析。

4.纯化的中华鳖趋化因子A重组蛋白抑菌活性分析

用平板计数法进行重组蛋白抑菌活性的检测，选用革兰氏阴性菌：大肠杆菌(Escherichia coli)、中华鳖源嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)；革兰氏阳性菌：中华鳖源苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)等三种细菌进行抑菌效果检测。将上述细菌单菌落接种于LB液体培养基，在各菌的最适温度下(37℃或者30℃，根据细菌种类别而定)摇菌至OD600 等于0.8左右，取出1mL，利用平板计数法初步得到细菌浓度。3000rpm 离心10min，舍去培养基，加入PBS将浓度调整为1×10⁵CFU/mL左右。按不同的浓度梯度加入适量蛋白孵育6h，PBS作为对照，涂平板37℃或者30℃(根据细菌种类而定)过夜，计数。

结果表明，重组蛋白对革兰氏阴性菌大肠杆菌(E.coli)和嗜水气单胞菌(A.hydrophila)、革兰氏阳性菌苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)表现出明显抑菌活性。重组蛋白对大肠杆菌(E.coli)和嗜水气单胞菌(A. hydrophila)抑菌活性随蛋白浓度增大而增强。当蛋白浓度较低时，重组蛋白对与大肠杆菌的抑菌能力随着蛋白浓度的升高而增强；而当蛋白浓度低于2μg/mL时，重组蛋白对嗜水气单胞菌(A.hydrophila)抑菌活性很低；当蛋白浓度等于4μg/mL时，重组蛋白对嗜水气单胞菌(A.hydrophila)表现出一定的抑菌活性；对革兰氏阳性菌苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)，浓度低于4μg/mL的重组蛋白无法体现抑菌活性；而蛋白浓度为16μg/mL 时，重组蛋白对苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)的抑菌活性较高(图7)。

序列表

<110> 浙江万里学院

<120> 一种中华鳖的趋化因子蛋白的表达方法及应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 91

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Lys Val Ser Val Ala Ala Leu Ala Val Leu Leu Ile Ala Ala Phe

1 5 10 15

Cys Ser Gln Ala Ser Ser Ala Pro Ile Gly Ser Asp Pro Pro Thr Ala

20 25 30

Cys Cys Phe Thr Tyr Ala Ser Arg Lys Ile Pro Arg Thr Leu Val Glu

35 40 45

Asp Tyr Tyr Asp Thr Asn Ser Met Cys Ser Gln Pro Ala Ile Val Phe

50 55 60

Ile Thr Lys Lys Gly Arg Glu Ile Cys Ala Asn Pro Gln Ala Asp Trp

65 70 75 80

Val Gln Glu Tyr Val Ala Tyr Leu Asp Gln Asn

85 90

<210> 2

<211> 276

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgaaggtct ccgtggctgc cctcgccgtc ctgctcatcg cggccttctg ctcccaggcc 60

tcctccgccc caattggctc cgaccccccg actgcctgct gctttaccta cgcctctcgg 120

aagatcccgc gcaccttggt ggaggattat tatgatacca acagcatgtg ctcccagcct 180

gccattgtct tcatcacaaa gaagggccgg gagatctgtg ccaaccccca ggcggactgg 240

gtccaggagt atgtggctta cttggatcag aactga 276

<210> 3

<211> 426

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60

atgacctatg cgagccgcaa aattccgcgc accctggtgg aagattatta tgataccaac 120

agcatgtgca gccagccggc gattgtgttc attaccaaaa aaggccgcga aatttgcgcg 180

aacccgcagg cggattgggt gcaggaatat gtggcgtatc tggatcagaa cacctatgcg 240

agccgcaaaa ttccgcgcac cctggtggaa gattattatg ataccaacag catgtgcagc 300

cagccggcga ttgtgttcat taccaaaaaa ggccgcgaaa tttgcgcgaa cccgcaggcg 360

gattgggtgc aggaatatgt ggcgtatctg gatcagaacc tcgagcacca ccaccaccac 420

cactga 426