一种高产量甲型h3n2流感病毒抗体的制备方法
阅读说明：本技术 一种高产量甲型h3n2流感病毒抗体的制备方法 (Preparation method of high-yield H3N2 influenza A virus antibody ) 是由 卢晓露 李海明 郑卓君 于 2019-09-27 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种高产量甲型H3N2流感病毒抗体的制备方法。包括以下工艺方法：在蛋鸡20周龄及以后,在每日普通饲料中添加3-7%海藻粉和4-7%蝗虫粉；制备甲型H3N2流感病毒免疫抗原、免疫产蛋母鸡,获得免疫鸡蛋、从免疫鸡蛋蛋黄液水稀释法提取甲型H3N2流感病毒抗体粗品；并对粗品进行纯化、冷冻喷雾干燥处理后,制得甲型H3N2流感病毒抗体,并进行纯度、活性检测。该工艺方法通过在鸡饲料中增加蝗虫粉和海藻粉,提高了甲型H3N2流感病毒抗体产量,并且使用蝗虫粉具有环境保护和良好的经济效益,本方法成本低、产量高、具有高特异性,可实现产业化。(The invention provides a preparation method of a high-yield H3N2 influenza A virus antibody. The method comprises the following steps: adding 3-7% of seaweed powder and 4-7% of locust powder into common feed every day after the laying hens are 20 weeks old; preparing influenza A H3N2 virus immune antigen, immunizing laying hens to obtain immune eggs, and extracting influenza A H3N2 virus antibody crude products from the immune eggs by a liquid-water dilution method; and purifying, freezing, spraying and drying the crude product to prepare the influenza A H3N2 virus antibody, and detecting the purity and the activity. The method increases locust powder and seaweed powder in chicken feed, improves H3N2 influenza A virus antibody yield, and has environmental protection and good economic benefit.)
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，特别涉及一种高产量甲型H3N2流感病毒抗体的制备方法。
背景技术
甲型流感病毒根据其表面的血凝素（HA）抗原的不同可以分为16个亚型（H1-H16），根据神经氨酸酶（NA）抗原的不同可以分为9个亚型（N1-N9）。流感病毒通过表面蛋白抗原性的累积改变(抗原漂移)或不同流感病毒发生基因重排而产生一种新的流感病毒(抗原转变)来逃避感染宿主的免疫识别，从而在感染群体中传播、繁衍。甲型H3N2流感是一种因甲型H3N2 流感病毒引起的呼吸系统疾病。1968年香港爆发的H3N2流感至使百万人失去生命。2013年初，美国东部多个州爆发H3N2季节性流感，波士顿市政府于1月9日宣布公共卫生紧急状态。目前针对人间甲型H3N2流感大流行的防控措施主要采用化学药物和疫苗，但是化学药物的过量使用多产生的副作用及疫苗开发往往滞后于疫情暴发和疫苗只能对易感人群起预防作用的弊端显著。
鸡卵黄抗体，是母鸡在卵的发育过程中血清中的IgY有效地转移到卵黄中而得。卵黄抗体具有安全方便、简单易得、产量高、不与IgG发生交叉血清学反应；不与类风湿因子或Fc受体相结合，在免疫检测过程中可避免产生假阴性或假阳性结果的优点，且耐热、耐酸，巴氏灭菌温度下不会失活且在pH值小于3时也能保持稳定活性，这些独特的优点使鸡卵黄抗体在临床和基础科学的应用中起着重要的作用，因此卵黄抗体在医学预防领域的应用越来越受到人类的关注，甲型H3N2流感病毒抗体的研制也将带来甲型H3N2流感预防的新突破。
鸡蛋白质的摄入包括动物性蛋白和植物性蛋白，如各种昆虫和植物叶、茎、根块、籽实，这种主动寻觅竞争性的摄入，保持了构成蛋白质多种氨基酸的平衡，为免疫球蛋白的形成提供了保障，这也是野生或放养的鸡比笼养鸡免疫力强的原因之一。蝗虫是农作物的主要害虫，蝗虫粉含蛋白质74.88%，磷0.809%，是优质动物蛋白原料，添加蝗虫粉补充鸡饲料的动物蛋白，使鸡饲料的动物蛋白和植物蛋白配比合理，使鸡摄入平衡的氨基酸，可提高免疫球蛋白的产量。同时其具有环境保护和经济效益。
海藻富含海藻多糖、甘露醇、维生素和多种钾、铁、钙、磷、碘、硒、钴等常量和微量元素。在蛋鸡饲料中添加3%-7%的海藻粉，可使产蛋率提高10%以上，鸡蛋中碘含量可提高15%以上。胥保华在肉仔鸡日粮中添加纳米硒，显著提高了血清IgG水平，IgG水平最高可达到26mg/kg。郭晓尉等报道，高碘使肉鸡的免疫反应明显增强，变现在小肠上皮间上皮样淋巴细胞增多，小肠固有层、皮肤阻止中、甲状腺组织中、卵巢组织中和胰腺组织中淋巴细胞数量明显增加。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高产量甲型H3N2流感病毒抗体的制备方法
为实现本发明的上述目的，采用以下技术方案：在蛋鸡生长到20周时，在普通鸡饲料中增加4-7%蝗虫粉和3-7%海藻粉；制备甲型H3N2流感病毒，确定TCID50值，稀释后等比例混合、乳化制成甲型H3N2流感病毒免疫抗原；用该抗原注射免疫产蛋母鸡，获得免疫鸡蛋；鸡蛋外壳消毒，敲破，去除蛋清及鸡蛋黄膜，留取蛋黄部分，加入1:6-12纯化水，调节pH为5.2-6.0，4℃静置过夜，离心，取上清液，加入上清液质量4-8%PEG66000或者硅藻土，充分搅拌后，在10℃下离心，倾去上清液，沉淀部分为甲型H3N2流感病毒抗体粗品。用0.075mol/LPBS平衡DEAE-TOYOPEAL 650M离子交换树脂，用0.075mol/L PBS溶解粗品，蛋白浓度约为20mg/ml，每次上样约200ml。上样后先用平衡缓冲液将未与填料结合的杂蛋白洗脱下来，然后用0.15mol/l的pH为7.0的PBS缓冲液洗脱。透析脱盐后冷冻干燥，即得卵黄抗体纯品，4℃保存，并进行纯度、活性检测。抗体回收率70.3-71.4%，所得抗体成品纯度94.8-95.5%。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：通过在鸡饲料中增加蝗虫粉和海藻粉，提高了甲型H3N2流感病毒抗体产量，并且使用蝗虫粉具有环境保护和良好的经济效益，本方法成本低、产量高、具有高特异性，可实现产业化。
具体实施方式
以下通过具体实施例进一步描述本发明，但本发明不仅限于此。
实施例一：高产量甲型H3N2流感病毒抗体的制备
（1）在蛋鸡生长到20周时，在普通鸡饲料中增加4%蝗虫粉和3%海藻粉。
（2）甲型H3N2流感病毒的制备：将甲型H3N2流感病毒株接种到生长至单层的MDCK细胞中，CO2培养箱中培养至细胞出现细胞病变CPE++++时收获，﹣20℃冻融3次，离心分离，加入PBS稀释纯化后病毒液，确定TCID50值，56℃高温灭活30min，4℃保存。
（3）甲型H3N2流感病毒免疫抗原的制备：根据TCID50值，将上述甲型H3N2流感病毒用0.01mol/L PBS（pH=7.2）进行稀释，并与弗氏完全佐剂按照1:1(V/V)充分乳化后制得免疫抗原。
（4）用甲型H3N2流感病毒免疫抗原免疫产蛋母鸡：取健康适龄的产蛋母鸡，在鸡翅下静脉注射，首次免疫每只鸡每次5ml，在鸡翅根处再肌注1ml加强免疫，其余五次免疫只静脉注射，每只每次5ml。首次免疫采用弗氏完全佐剂，其余采用弗氏不完全佐剂；首次免疫前收集未免疫蛋作为阴性对照品，21天后免疫第二次，以后每隔21天免疫一次；用ELISA跟踪检测免疫鸡蛋中甲型H3N2流感病毒抗体的效价，收集高效价鸡蛋（1:1024），将每日收集的免疫鸡蛋编号，4℃下保存。
（5）甲型H3N2流感病毒抗体的提取和纯化。
S1将获得的免疫鸡蛋用0.1%新洁尔灭消毒，纯化水冲洗干净，敲破，去除蛋清及蛋黄膜，留取蛋黄部分，测定所收集的蛋黄体积，水稀释法提取：按比例1：6比例加入纯化水，用1mol/L盐酸溶液调节PH为5.2，4℃条件下静置过夜，6000~10000r/min离心，取上清液，测定所收集上清液的体积。
S2在S1制得的上清液中稍慢速度搅拌下加入4%PEG6600，充分搅拌后，置于高速冷冻离心机中，在10℃下以6000~10000r/min r/min，离心，倾去上清液，沉淀部分即为甲型H3N2流感病毒抗体粗品。
S3用0.075mol/L PBS平衡DEAE-TOYOPEAL 650M离子交换树脂，用0.075mol/L PBS溶解粗品，蛋白浓度约为20mg/ml，每次上样约200ml。上样后先用平衡缓冲液将未与填料结合的杂蛋白洗脱下来，然后用0.15mol/l的pH为7.0的PBS缓冲液洗脱。透析脱盐后冷冻干燥，即得卵黄抗体纯品
实施例二：高产量甲型H3N2流感病毒抗体的制备
（1）在蛋鸡生长到20周时，在普通鸡饲料中增加5%蝗虫粉和5%海藻粉。
（2）甲型H3N2流感病毒的制备：将甲型H3N2流感病毒株接种到生长至单层的MDCK细胞中，CO2培养箱中培养至细胞出现细胞病变CPE++++时收获，﹣20℃冻融3次，离心分离，加入PBS稀释纯化后病毒液，确定TCID50值，56℃高温灭活30min，4℃保存。
（3）甲型H3N2流感病毒免疫抗原的制备：根据TCID50值，将上述甲型H3N2流感病毒用0.01mol/LPBS（pH=7.2）进行稀释，并与弗氏完全佐剂按照1:1(V/V) 充分乳化后制得免疫抗原。
（4）用甲型H3N2流感病毒免疫抗原免疫产蛋母鸡：取健康适龄的产蛋母鸡，在鸡翅下静脉注射，首次免疫每只鸡每次5ml，在鸡翅根处再肌注1ml加强免疫，其余五次免疫只静脉注射每只每次5ml。首次免疫采用弗氏完全佐剂，其余采用弗氏不完全佐剂；首次免疫前收集未免疫蛋作为阴性对照品，21天后免疫第二次，以后每隔21天免疫一次；用ELISA跟踪检测免疫鸡蛋中甲型H3N2流感病毒抗体的效价，收集高效价鸡蛋（1:1024），将每日收集的免疫鸡蛋编号，4℃下保存。
（5）甲型H3N2流感病毒抗体的提取和纯化。
S1将获得的免疫鸡蛋用0.1%新洁尔灭消毒，纯化水冲洗干净，敲破，去除蛋清及蛋黄膜，留取蛋黄部分，测定所收集的蛋黄体积，水稀释法提取：按比例1：9比例加入纯化水，用1mol/L盐酸溶液调节PH为5.6，4℃条件下静置过夜，6000~10000r/min离心，取上清液，测定所收集上清液的体积。
S2在S1制得的上清液中稍慢速度搅拌下加入6%硅藻土，充分搅拌后，置于高速冷冻离心机中，在10℃下以6000~10000r/min r/min，离心，倾去上清液，沉淀部分即为甲型H3N2流感病毒抗体粗品。
S3用0.075mol/LPBS平衡DEAE-TOYOPEAL 650M离子交换树脂，用0.075mol/L PBS溶解粗品，蛋白浓度约为20mg/ml，每次上样约200ml。上样后先用平衡缓冲液将未与填料结合的杂蛋白洗脱下来，然后用0.15mol/l的pH为7.0的PBS缓冲液洗脱。透析脱盐后冷冻干燥，即得卵黄抗体纯品
实施例三：高产量甲型H3N2流感病毒抗体的制备
（1）在蛋鸡生长到20周时，在普通鸡饲料中增加7%蝗虫粉和7%海藻粉。
（2）甲型H3N2流感病毒的制备：将甲型H3N2流感病毒株接种到生长至单层的MDCK细胞中，CO2培养箱中培养至细胞出现细胞病变CPE++++时收获，﹣20℃冻融3次，离心分离，加入PBS稀释纯化后病毒液，确定TCID50值，56℃高温灭活30min，4℃保存。
（3）甲型H3N2流感病毒免疫抗原的制备：根据TCID50值，将上述甲型H3N2流感病毒用0.01mol/L PBS（pH=7.2）进行稀释，并与弗氏完全佐剂按照1:1(V/V)充分乳化后制得免疫抗原。
（4）用甲型H3N2流感病毒免疫抗原免疫产蛋母鸡：取健康适龄的产蛋母鸡，在鸡翅下静脉注射，首次免疫每只鸡每次5ml，在鸡翅根处再肌注1ml加强免疫，其余五次免疫只静脉注射每只每次5ml。首次免疫采用弗氏完全佐剂，其余采用弗氏不完全佐剂；首次免疫前收集未免疫蛋作为阴性对照品，21天后免疫第二次，以后每隔21天免疫一次；用ELISA 跟踪检测免疫鸡蛋中甲型H3N2流感病毒抗体的效价，收集高效价鸡蛋（1:1024），将每日收集的免疫鸡蛋编号，4℃下保存。
（5）甲型H3N2流感病毒抗体的提取和纯化。
S1将获得的免疫鸡蛋用0.1%新洁尔灭消毒，纯化水冲洗干净，敲破，去除蛋清及蛋黄膜，留取蛋黄部分，测定所收集的蛋黄体积，水稀释法提取：按比例1：12比例加入纯化水，用1mol/L 盐酸溶液调节PH为6.0，4℃条件下静置过夜，6000~10000r/min离心，取上清液，测定所收集上清液的体积。
S2在S1制得的上清液中稍慢速度搅拌下加入8%PEG6000，充分搅拌后，置于高速冷冻离心机中，在10℃下以6000~10000r/min r/min，离心，倾去上清液，沉淀部分即为甲型H3N2流感病毒抗体粗品。
S3。用0.075mol/L PBS平衡DEAE-TOYOPEAL 650M离子交换树脂，用0.075mol/LPBS溶解粗品，蛋白浓度约为20mg/ml，每次上样约200ml。上样后先用平衡缓冲液将未与填料结合的杂蛋白洗脱下来，然后用0.15mol/l的pH为7.0的PBS缓冲液洗脱。透析脱盐后冷冻干燥，即得卵黄抗体纯品
实验一：甲型H3N2流感病毒抗体的含量测定
实验分为普通饲料组、7%海藻粉饲料组、7%蝗虫粉组、实施例一组、实施例二组、实施例三组，采用双波长测定卵黄抗体含量。
IgY浓度（mg/ml）=1.45×A280-0.74×A260
结果如表1。
实验二：甲型H3N2流感病毒抗体的纯度检测。
采用醋酸纤维膜电泳分离并测定甲型H3N2流感病毒抗体的纯度。醋酸纤维膜电泳是以醋酸纤维膜为支持物的电泳方法。醋酸纤维膜由二乙酸纤维素制成，它具有均一泡沫样的结构，厚度仅120微米，有强渗透性，对分子移动无阻力，作为区带电泳的支持物进行蛋白电泳有简便、快速，样品用量少，应用范围广，分离清晰，没有吸附现象等优点，目前已广泛用于血清蛋白、脂蛋白、血红蛋白、糖蛋白、同工酶的分离和鉴定。凝胶扫描图像分析纯度，分析结果见表1。
实验三：甲型H3N2流感病毒抗体的ELISA效价活性检测。
采用“ELISA法”（酶联免疫吸附试验）检测本发明的工艺制取的甲型H3N2流感病毒抗体的ELISA效价。结果表明，效价达到了1:5120。
实验四：甲型H3N2流感病毒抗体的回收率测定
IgY回收率通过以下公式进行计算：
结果见表1。
表1各组获得IgY的情况
添加7%海藻粉饲料组比普通饲料组IgY含量增加18.69%，添加7%蝗虫粉组比普通饲料组IgY含量增加19.80%，添加4%蝗虫粉和3%海藻粉比普通饲料组IgY含量增加23.22%，添加5%蝗虫粉和5%海藻粉比普通饲料组IgY含量增加29.14%，添加7%海藻粉饲料组和7%蝗虫粉组比普通饲料组IgY含量增加32.47%。