阅读说明：本技术 一种同时检测黄曲霉毒素b1和赭曲霉毒素a的电化学方法 (Electrochemical method for simultaneously detecting aflatoxin B1 and ochratoxin A ) 是由 邹小波 徐艺伟 胡雪桃 石吉勇 李艳肖 李亚惠 王鑫 于 2019-09-27 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物传感器和电化学检测领域,涉及一种同时检测黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A的电化学方法；步骤为：首先制备得到丝网印刷电极；然后制备得到AFB1适配体与OTA适配体修饰电极,再将适配体修饰电极依次浸入AFB1、OTA、Tris-HCl缓冲溶液配制的标准溶液和AFB1适配体互补链、OTA适配体互补链、Tris-HCl缓冲溶液的混合液；最后,根据二茂铁的峰电流值、亚甲基蓝的峰电流值与AFB1和OTA浓度的关系,分别建立标准曲线；通过检测待测液的二茂铁和亚甲基蓝的峰电流值,即可实现样品中AFB1和OTA的同时检测；本发明能够对两种目标物同时检测,操作简便,并具有高灵敏度和高选择性。(The invention belongs to the field of biosensors and electrochemical detection, and relates to an electrochemical method for simultaneously detecting aflatoxin B1 and ochratoxin A; the method comprises the following steps: firstly, preparing a screen printing electrode; then preparing an AFB1 aptamer and an OTA aptamer modified electrode, and sequentially immersing the aptamer modified electrode into a standard solution prepared from AFB1, OTA and Tris-HCl buffer solution and a mixed solution of an AFB1 aptamer complementary chain, an OTA aptamer complementary chain and Tris-HCl buffer solution; finally, respectively establishing a standard curve according to the relationship between the peak current value of ferrocene and the peak current value of methylene blue and the concentration of AFB1 and OTA; the AFB1 and OTA in the sample can be simultaneously detected by detecting the peak current values of the ferrocene and the methylene blue of the liquid to be detected; the invention can simultaneously detect two targets, has simple and convenient operation, and has high sensitivity and high selectivity.)

一种同时检测黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A的电化学方法

技术领域

本发明属于生物传感器和电化学检测领域，具体涉及一种同时检测黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A的电化学方法。

背景技术

真菌毒素是真菌在生长过程所产生的次级代谢物，对人类和动物具有毒害作用。黄曲霉毒素主要是黄曲霉和寄生曲霉产生的二级代谢产物，是一种毒性极强的真菌毒素。黄曲霉毒素主要对肝脏组织具有破坏作用，严重会导致肝癌甚至死亡。在污染食品的黄曲霉毒素中以黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，AFB1)最常见，毒性和致癌性也最强。赭曲霉毒素是由多种曲霉菌和青霉菌产生的化合物，共有A、B、C、D四类，其中以赭曲霉毒素A(Ochratoxin A，OTA)的污染率、污染水平和毒性最高。

真菌毒素的检测方法主要有气相色谱、高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法等。尽管这些方法可以实现真菌毒素的检测，但需要昂贵的仪器，专业的操作人员，和复杂的检测程序，难以满足现场快速检测的需要。电化学技术具有高灵敏度、易操作、低成本等优势，已经被用于真菌毒素的检测。目前，真菌毒素的电化学检测主要针对某一种真菌毒素，而同时检测两种真菌毒素的电化学检测方法却鲜见报道。本发明开发了一种同时检测AFB1和OTA两种真菌毒素的电化学方法，能够实现AFB1和OTA两种真菌毒素的同时检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于核酸适配体的AFB1和OTA的电化学同时检测方法，其检测具有操作简单、灵敏度高、特异性强等优势，可用于食品安全领域中真菌毒素的检测。

为了实现上述目的，本发明通过丝网印刷技术，制备具有两个工作电极的丝网印刷电极，采用电沉积方法在工作电极表面修饰金纳米粒子，然后通过自组装的方式在两个工作电极表面分别修饰AFB1和OTA的核酸适配体，利用真菌毒素与适配体的特异性结合，影响互补链与适配体的杂交，依据互补链末端标记物的伏安信号，实现AFB1和OTA的同时检测。本发明所提供的检测方法，以具有不同氧化还原电位的标记物的伏安信号为定量标准，同时对两种真菌毒素进行定量测定。

上述的基于核酸适配体的AFB1和OTA两种真菌毒素的电化学同时检测方法，其具体步骤如下：

(1)制备得到丝网印刷电极，所述丝网印刷电极包括对电极、工作电极一、工作电极二和参比电极；

丝网印刷电极制备的具体步骤：首先，使用计算机绘图软件设计电极形状，通过激光打印方法，分别制备用于印刷银浆、碳浆和绝缘油墨的三块网版；首先印刷银浆，干燥后得到三个平行且相互独立的银浆图案，其中位于中间的银浆图案为Y形，Y形两侧的银浆图案为条形；然后，再印刷碳浆，干燥后得到三个独立的碳浆图案，其中一个碳浆图案为弧形，与其中一个条形银浆图案的末端相连，另外两个碳浆图案为椭圆形，分别与Y形银浆图案的两个末端相连；最后，印刷绝缘油墨干燥后得到矩形的绝缘油墨图案，所述矩形绝缘油墨覆盖碳浆图案与银浆图案的连接处以及部分银浆图案；所述干燥的条件均为70～90℃，干燥时间均为10～60min。

(2)适配体修饰电极的制备：

S1、首先，将步骤(1)制备的丝网印刷电极浸入氯金酸溶液中，在丝网印刷电极的2个工作电极上施加恒定电位，保持一段时间后，取出丝网印刷电极，再次置于硫酸溶液中，进行循环伏安扫描，活化金纳米粒子，得到金纳米粒子修饰的丝网印刷电极；

S2、取三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液与AFB1适配体储备液混合反应得到混合溶液A；再取三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液与OTA适配体储备液混合反应得到混合溶液B；使用Tris-HCl缓冲溶液，将混合溶液A和混合溶液B分别稀释至一定浓度；

S3、取S2中稀释后的混合溶液A滴涂于S1中得到的金纳米粒子修饰的丝网印刷电极工作电极一的表面；再取S2中稀释后的混合溶液B，滴涂于S1中浸泡后的丝网印刷电极工作电极二的表面，在一定温度条件下静置一段时间后，使用Tris-HCl缓冲溶液冲洗工作电极一和工作电极二的表面，冲洗后分别在工作电极一和工作电极二的表面滴涂巯基己醇溶液，在恒温条件下保存一段时间，再用Tris-HCl缓冲溶液冲洗工作电极一和工作电极二的表面，冲洗后得到适配体修饰电极；

(3)AFB1和OTA的电化学同时检测：首先，将AFB1和OTA加入Tris-HCl缓冲溶液中，配制不同浓度的标准溶液；取若干个步骤(2)制备的适配体修饰电极分别浸入不同浓度的标准溶液中，在恒温条件下保存一段时间；然后，取出适配体修饰电极，再次浸入AFB1适配体互补链、OTA适配体互补链和Tris-HCl缓冲溶液组成的混合溶液C中，在一定温度条件下静置一段时间；

最后，取出适配体修饰电置于电解池中，以磷酸缓冲溶液为电解质，通过差分脉冲伏安法记录OTA适配体互补链所修饰的亚甲基蓝和AFB1适配体互补链所修饰的二茂铁的电信号；依据伏安图谱中二茂铁的峰电流值与AFB1浓度的关系、以及亚甲基蓝的峰电流值与OTA浓度的关系，分别建立标准曲线；

(4)样品检测：首先，将样品粉碎，获得样品粉末，加入乙醇溶液中，充分震荡，离心后收集上清液，与Tris-HCl缓冲溶液混合，得到样品提取液；然后，使用步骤(2)所制备的适配体修饰电极，按照步骤(3)中的检测程序，区别是将AFB1和OTA共存的标准溶液替换为所要检测的样品提取液，获得样品提取液的伏安曲线，将伏安曲线中二茂铁和亚甲基蓝的峰电流值代入步骤(3)所建立的标准曲线方程中，即可实现样品中AFB1和OTA的同时检测。

优选的，步骤(2)的S1中，所述氯金酸溶液的浓度为0.2～2mmol/L；所述工作电极上施加的恒定电位为-3.0～-0.3V，保持一段时间为1～10min；所述硫酸溶液的浓度为0.1～1.0mol/L。

优选的，步骤(2)的S1中，所述循环伏安扫描的低电位为0～0.2V，高电位为1.4～1.6V，扫描速度为10～100mV/s，扫描圈数为5～20圈。

优选的，步骤(2)的S2中，所述AFB1适配体储备液的浓度为100μmmol/L，三(2-羧乙基)膦盐酸盐的浓度为100mmol/L；所述AFB1适配体储备液与三(2-羧乙基)膦盐酸盐的体积比为10:1，混合反应的时间为30～60min。

优选的，步骤(2)的S2中，所述OTA适配体储备液的浓度为100μmmol/L，三(2-羧乙基)膦盐酸盐的浓度为100mmol/L，所述OTA适配体储备液与三(2-羧乙基)膦盐酸盐的体积比为10:1，混合反应的时间为30～60min。

优选的，步骤(2)的S2中，所述Tris-HCl缓冲溶液的浓度为10～100mmol/L，pH＝7.4；所述混合溶液A稀释后的浓度为10μmol/L；混合溶液B稀释后的浓度为10μmol/L。

优选的，步骤(2)的S3中，所述稀释后的混合溶液A滴涂的用量为4～8μL；所述稀释后的混合溶液B滴涂的用量为4～8μL；所述一定温度条件为4℃，静置时间为1～15h。

优选的，步骤(2)的S3中，所述巯基己醇溶液浓度为1～10mmol/L；所述巯基己醇溶液滴涂在工作电极一和工作电极二表面的用量均为4～8μL；所述恒温条件为4℃，保存一段时间为0.5～2h；所述冲洗工作电极一和工作电极二表面的Tris-HCl缓冲溶液的浓度为10mmol/L，pH＝7.4。

优选的，步骤(3)中，所述Tris-HCl缓冲溶液的浓度为10～100mmol/L，pH＝7.4；所述标准溶液浓度范围为1～1000μg/L；所述恒温条件为37℃，保存一段时间为0.5～2h。

优选的，步骤(3)中，所述混合溶液C的浓度为10～100μmol/L；所述一定温度条件为37℃，静置时间为0.5～2h。

优选的，步骤(3)中，所述磷酸缓冲溶液的浓度为0.1～0.5mol/L，pH为6～9；所述差分脉冲伏安法的低电位为-0.6～-0.4V，高电位为0.4～0.6V。

优选的，步骤(3)中，所述标准曲线方程记为：y1＝ax1+b和y2＝cx2+d，其中y1为AFB1的浓度，μg/L；y2为OTA的浓度，μg/L；x1代表二茂铁峰电流值，μA；x2代表亚甲基蓝峰电流值，μA；a和c为方程的系数，b和d为方程的常数项。

优选的，步骤(4)中，所述样品粉末与醇溶液的用量比为1～5g：5～10mL；所述乙醇溶液浓度为80％；所述震荡的时间为20～40min；所述上清液与Tris-HCl缓冲溶液的体积比为1:8～9。

优选的，步骤(4)中，所述离心的转速为3000～6000r/min，离心时间为3～10min；所述Tris-HCl缓冲溶液的浓度为10～100mmol/L，pH＝7.4。

本发明涉及的DNA序列如表1所示：

表1本发明所涉及的DNA序列

本发明的有益效果

(1)本发明制备得到具有两个工作电极的丝网印刷电极，在两个工作电极表面分别修饰AFB1和OTA的核酸适配体，避免了两种适配体在同一工作电极表面共存的相互干扰。

(2)本发明利用适配体与AFB1和OTA的特异性结合，与单一信号的电化学传感器相比，本发明所建立的检测方法，能够对两种目标物同时检测，并具有高灵敏度和高选择性。

(3)本发明以具有不同氧化还原电位的标记物的伏安信号为定量标准，不仅能够避免复杂环境下背景物质的干扰，还可实现两种目标物的同时检测。

附图说明

图1是丝网印刷电极制备流程图，其中1-工作电极一，2-工作电极二，3-参比电极，4-对电极。

图2是适配体修饰电极的制备及同时检测AFB1和OTA两种真菌毒素的流程图；其中曲线图为电化学差分脉冲伏安法所获得的伏安曲线。

具体实施方式

实施例1：

(1)丝网印刷电极的制备：首先，使用计算机绘图软件设计电极形状，通过激光打印方法，分别制备用于印刷银浆、碳浆和绝缘油墨的三块网版；首先印刷银浆，在干燥箱中90℃条件下干燥20min后得到三个平行且相互独立的银浆图案，其中位于中间的银浆图案为Y形，Y形两侧的银浆图案为条形；然后，再印刷碳浆，在干燥箱中90℃条件下干燥20min后得到三个独立的碳浆图案，其中一个碳浆图案为弧形，与其中一个条形银浆图案的末端相连，另外两个碳浆图案为椭圆形，分别与Y形银浆图案的两个末端相连；最后，印刷绝缘油墨干燥后得到矩形的绝缘油墨图案，所述矩形绝缘油墨覆盖碳浆图案与银浆图案的连接处以及部分银浆图案；在干燥箱中70℃条件下干燥20min，得到丝网印刷电极，所述丝网印刷电极包括对电极4、工作电极一1、工作电极二2和参比电极3；

(2)适配体修饰电极的制备；

S1、首先，采用电沉积方法在工作电极表面修饰金纳米粒子，将步骤(1)制备的丝网印刷电极浸入1mmol/L氯金酸溶液中，在丝网印刷电极的2个工作电极上施加-0.6V的恒定电位，保持5min后，取出丝网印刷电极，再次置于0.5mol/L的硫酸溶液中，在0.2V和1.6V之间的电位区间内循环伏安扫描10圈，扫描速率为100mV/s，活化金纳米粒子，得到金纳米粒子修饰的丝网印刷电极；

S2、取10mmol/L的三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液与100μmol/L的AFB1适配体储备液混合反应60min得到混合溶液A；再取10mmol/L的三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液与100μmol/L的OTA适配体储备液混合反应60min得到混合溶液B；使用10mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液，将混合溶液A和混合溶液B分别稀释至10μmol/L；

S3、取6μL S2中稀释后的混合溶液A滴涂于S1中得到的金纳米粒子修饰的丝网印刷电极工作电极一的表面；再取6μL S2中稀释后的混合溶液B，滴涂于S1中浸泡后的丝网印刷电极工作电极二的表面，4℃条件下保存12h，适配体可通过硫金键而组装在电极表面，形成适配体层，使用10mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液(pH＝7.4)冲洗电极表面，以除去未组装的适配体；分别在工作电极一和工作电极二的表面滴涂6μL浓度为1mmol/L的巯基己醇溶液，在4℃条件下保存1h，封闭电极表面非特异性位点，形成屏蔽层，使用10mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液(pH＝7.4)冲洗电极表面，以除去未结合的巯基己醇，得到适配体修饰电极，得到适配体修饰电极；

(3)AFB1和OTA的电化学同时检测：首先，使用10mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液(pH＝7.4)配制不同浓度的AFB1和OTA共存的标准溶液，标准溶液的浓度分别为1μg/L、5μg/L、10μg/L、50μg/L、100μg/L、500μg/L、1000μg/L；取若干个步骤(2)制备的适配体修饰电极分别浸入不同浓度的标准溶液中，一种浓度对应一个适配体修饰电极，在37℃条件下孵育1h，AFB1和OTA可与修饰在电极表面的适配体特异性结合，使用Tris-HCl缓冲溶液冲洗电极表面，以除去未结合的AFB1和OTA；

然后，使用10mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液(pH＝7.4)配制10μmol/L的AFB1适配体互补链和OTA适配体互补链共存的混合溶液C，将浸入标准溶液后取出的适配体修饰电极再次浸入混合溶液C中，在37℃条件下孵育1h，电极表面未结合AFB1和OTA的适配体，能够与其互补链杂交，使用10mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液(pH＝7.4)冲洗电极表面，以除去未杂交的适配体互补链；

最后，将该电极置于电解池中，以0.1mol/L的磷酸缓冲溶液(pH＝7)为电解质，通过差分脉冲伏安法记录互补链所修饰的亚甲基蓝和二茂铁的电信号，差分脉冲伏安法的电位从-0.5V扫描到0.5V；依据伏安图谱中二茂铁和亚甲基蓝的峰电流值与AFB1和OTA浓度的关系，建立标准曲线标准曲线方程记为：y1＝ax1+b和y2＝cx2+d，其中y1为AFB1的浓度，μg/L；y2为OTA的浓度，μg/L；x1代表二茂铁峰电流值，μA；x2代表亚甲基蓝峰电流值，μA；a和c为方程的系数，b和d为方程的常数项。

(4)样品检测：选择玉米作为检测样品；使用粉碎机将玉米样品粉碎，称取2.5g粉末样品加入10mL离心管中，并加入10mL的80％乙醇溶液，震荡30min，使用离心机在4000r/min转速下离心5min，收集上清液，使用10mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液(pH＝7.4)定容到100mL，制备样品提取液；

然后，使用步骤(2)所制备的适配体修饰电极，按照步骤(3)中的操作，区别是将配制标准溶液的AFB1和OTA替换为所要检测的样品提取液，对样品提取液中的AFB1和OTA进行测定，获得样品提取液的伏安曲线，将二茂铁和亚甲基蓝的峰电流值代入所建立的标准曲线方程中，即可实现玉米样品中AFB1和OTA的检测。

本发明提供的电化学方法与液相色谱-串联质谱法的检测结果如表2所示，根据表中的检测结果可知，本发明提供的电化学方法与液相色谱-串联质谱法的检测结果基本一致，证明本发明提供的检测方法具有较高的准确性。

表2玉米样品中的AFB1和OTA的检测结果

说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，均应涵盖在本发明的权利要求范围内。