阅读说明：本技术 双信号-双识别印迹电化学传感器及其制备方法和卵清蛋白的检测方法 (Double-signal-double-recognition imprinting electrochemical sensor, preparation method thereof and ovalbumin detection method ) 是由 阚显文 柴绒 于 2019-10-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种双信号-双识别印迹电化学传感器及其制备方法和卵清蛋白的检测方法,该制备方法包括：1)在电极载体的表面进行电化学聚合形成聚对氨基苯磺酸膜pABSA以得到pABSA/电极载体；2)在pABSA/电极载体的表面进行电化学聚合形成聚硫堇膜pTH以得到pTH/pABSA/电极载体；3)将pTH/pABSA/电极载体置于混合溶液中进行电化学聚合,然后将电极进行洗脱去除卵清蛋白OVA形成印迹聚合物MIP,以得到MIP/pTH/pABSA/电极载体；其中,混合溶液中含有卵清蛋白OVA、3-噻吩硼酸3-TBA。该双信号-双识别印迹电化学传感器对卵清蛋白的检测具有优异的灵敏度和选择性。(The invention discloses a double-signal-double-recognition imprinting electrochemical sensor, a preparation method thereof and an ovalbumin detection method, wherein the preparation method comprises the following steps: 1) carrying out electrochemical polymerization on the surface of the electrode carrier to form a poly-p-aminobenzene sulfonic acid membrane pABSA so as to obtain pABSA/electrode carrier; 2) performing electrochemical polymerization on the surface of the pABSA/electrode carrier to form a polythionine membrane pTH so as to obtain pTH/pABSA/electrode carrier; 3) putting the pTH/pABSA/electrode carrier into a mixed solution for electrochemical polymerization, and then eluting the electrode to remove ovalbumin OVA to form an imprinted polymer MIP so as to obtain the MIP/pTH/pABSA/electrode carrier; wherein the mixed solution contains ovalbumin OVA and 3-thiopheneboronic acid 3-TBA. The double-signal and double-recognition imprinting electrochemical sensor has excellent sensitivity and selectivity for detecting ovalbumin.)

双信号-双识别印迹电化学传感器及其制备方法和卵清蛋白 的检测方法

技术领域

本发明涉及印迹电化学传感器，具体地，涉及一种双信号-双识别印迹电化学传感器及其制备方法和卵清蛋白的检测方法。

背景技术

卵清蛋白是一种优质的蛋白质，是鸡蛋的重要组成部分。研究发现，鸡蛋具有提高人体智力、降低胆固醇含量、治疗缺铁性贫血、解毒抗癌等食疗保健作用。因此，开发用于识别和定量生物样品中卵清蛋白的高选择性和有效的分析方法是非常重要的。然而，严重的基质干扰和低浓度的复杂生物样品为卵清蛋白的识别和检测提供了很大的障碍。

到目前为止，已经开发了许多用于卵清蛋白分析的技术，如酶联免疫吸附测定，液相色谱等，但这些方法通常具有昂贵，耗时，选择性差、灵敏度低等缺点。

发明内容

本发明的目的是提供一种双信号-双识别印迹电化学传感器及其制备方法和卵清蛋白的检测方法，该双信号-双识别印迹电化学传感器对卵清蛋白OVA的检测具有优异的灵敏度和选择性进而使得其能够在OVA的检测中得以应用，同时该制备方法具有成本低廉、操作简单的优点。

为了实现上述目的，本发明提供了一种双信号-双识别印迹电化学传感器的制备方法，该制备方法包括：

1)在电极载体的表面进行电化学聚合形成聚对氨基苯磺酸膜pABSA以得到pABSA/电极载体；

2)在pABSA/电极载体的表面进行电化学聚合形成聚硫堇膜pTH以得到pTH/pABSA/电极载体；

3)将pTH/pABSA/电极载体置于混合溶液中进行电化学聚合，然后将电极进行洗脱去除卵清蛋白OVA形成印迹聚合物MIP，以得到MIP/pTH/pABSA/电极载体；

其中，混合溶液中含有卵清蛋白OVA、3-噻吩硼酸3-TBA。

本发明还提供了一种双信号-双识别印迹电化学传感器，该双信号-双识别印迹电化学传感器通过上述的制备方法制备而得。

本发明进一步提供了一种卵清蛋白OVA的检测方法，该检测方法为：

1)将如上述的双信号-双识别印迹电化学传感器在缓冲溶液中进行第一次孵育；

2)将上述双信号-双识别印迹电化学传感器在缓冲溶液中进行第二次孵育，然后进行电化学检测；

其中，第一次孵育的缓冲溶液中含有卵清蛋白OVA，第二次孵育的缓冲溶液中含有二茂铁硼酸FcBA。

通过上述技术方案，本发明本发明是在电极载体的表面依次电聚合修饰聚对氨基苯磺酸膜pABSA、聚硫堇膜pTH，印迹聚合物(MIP)制得；MIP的主体为聚3-噻吩硼酸，当洗脱OVA后，聚3-噻吩硼酸的表面形成有与OVA互补的印迹孔穴，里层的pTH会通过孔穴产生一个TH的电信号。

将MIP/pTH/pABSA/电极载体置于含有OVA的缓冲溶液、含有二茂铁硼酸(FcBA)的缓冲溶液中连续孵育，由于OVA会进入印迹孔穴阻塞电子通道导致TH的电信号降低，同时结合在孔穴中的OVA会与FcBA发生硼酸亲和作用(在中性或碱性条件下，硼酸基团可以与含有顺式二醇的化合物生成可逆共价键)产生FcBA的电信号。TH和FcBA的电信号结合形成双信号，硼酸亲和力与分子印迹空间匹配腔结合形成双识别，这样构建的双信号-双识别印迹电化学传感器可实现对OVA的高选择性、高灵敏检测。

本发明的其他特征和优点将在随后的

具体实施方式

部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是实施例1中MIP/pTH/pABSA/GCE的选择性检测结果图；

图2A是实施例1中MIP/pTH/pABSA/GCE检测不同浓度OVA的DPV图；

图2B是图2A的线性拟合曲线图。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

本发明提供了一种双信号-双识别印迹电化学传感器的制备方法，该制备方法包括：

1)在电极载体的表面进行电化学聚合形成聚对氨基苯磺酸膜pABSA以得到pABSA/电极载体；

2)在pABSA/电极载体的表面进行电化学聚合形成聚硫堇膜pTH以得到pTH/pABSA/电极载体；

3)将pTH/pABSA/电极载体置于混合溶液中进行电化学聚合，然后将电极进行洗脱去除卵清蛋白OVA形成印迹聚合物MIP，以得到MIP/pTH/pABSA/电极载体；

其中，混合溶液中含有卵清蛋白OVA、3-噻吩硼酸3-TBA。

在上述制备方法的步骤1)中，电化学聚合的条件可以在宽的范围内选择，但是为了使制得的MIP/pTH/pABSA/电极载体对卵清蛋白OVA的检测具有更优异的选择性、灵敏度；优选地，在步骤1)中，电化学聚合满足以下条件：采用循环伏安法CV进行，扫描圈数为12-18圈，聚合电位为-1.5～+2.5V，扫描速率为80-120mV/s。

在上述制备方法的步骤1)中，电化学聚合的反应体系可以在宽的范围内选择，但是为了使制得的MIP/pTH/pABSA/电极载体对卵清蛋白OVA的检测具有更优异的选择性、灵敏度；优选地，在步骤1)中，电化学聚合于pH为6.5-7.5的PBS溶液中进行，对氨基苯磺酸ABSA的浓度为1×10^-4-3×10^-4mol/L。

在上述制备方法的步骤2)中，电化学聚合的条件可以在宽的范围内选择，但是为了使制得的MIP/pTH/pABSA/电极载体对卵清蛋白OVA的检测具有更优异的选择性、灵敏度；优选地，在步骤2)中，电化学聚合满足以下条件：采用循环伏安法CV进行，扫描圈数为28-32圈，聚合电位为-0.4～+0.4V，扫描速率为80-120mV/s。

在上述制备方法的步骤2)中，电化学聚合的反应体系可以在宽的范围内选择，但是为了使制得的MIP/pTH/pABSA/电极载体对卵清蛋白OVA的检测具有更优异的选择性、灵敏度；优选地，在步骤2)中，电化学聚合于pH为4.5-5.5的PBS溶液中进行，硫堇TH的浓度为4-6mmol/L。

在上述制备方法的步骤3)中，电化学聚合的条件可以在宽的范围内选择，但是为了使制得的MIP/pTH/pABSA/电极载体对卵清蛋白OVA的检测具有更优异的选择性、灵敏度；优选地，在步骤3)中，电化学聚合满足以下条件：采用循环伏安法CV进行，扫描圈数为18-22圈，聚合电位为-0.2～+1.2V，扫描速率为120-130mV/s。

在上述制备方法的步骤3)中，电化学聚合的反应体系可以在宽的范围内选择，但是为了使制得的MIP/pTH/pABSA/电极载体对卵清蛋白OVA的检测具有更优异的选择性、灵敏度；优选地，在步骤3)中，电化学聚合于pH为7.5-8.5的PBS溶液中进行，3-噻吩硼酸3-TBA的浓度为8-12mmol/L，卵清蛋白OVA的浓度为0.3-0.5mmol/L。

在上述制备方法的步骤3)中，洗脱的条件可以在宽的范围内选择，但是为了使制得的MIP/pTH/pABSA/电极载体对卵清蛋白OVA的检测具有更优异的选择性、灵敏度；优选地，在步骤3)中，洗脱为：将电极置于pH为0.2-0.4HCl溶液中浸泡15-25min。

在上述实施方式的基础上，为了进一步提高MIP/pTH/pABSA/电极载体对卵清蛋白OVA的检测的选择性、灵敏度，优选地，在步骤1)和步骤2)之后，该制备方法还包括：将电极通过用去离子水冲洗。

在上述实施方式的基础上，电极载体的种类可以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高MIP/pTH/pABSA/电极载体对卵清蛋白OVA的检测的选择性、灵敏度，优选地，电极载体选自玻碳电极GCE、碳纸电极和丝网印刷电极中的一者。

本发明还提供了一种双信号-双识别印迹电化学传感器，该双信号-双识别印迹电化学传感器通过上述的制备方法制备而得。

本发明进一步提供了一种卵清蛋白OVA的检测方法，该检测方法为：

1)将如上述的双信号-双识别印迹电化学传感器在缓冲溶液中进行第一次孵育；

2)将上述双信号-双识别印迹电化学传感器在缓冲溶液中进行第二次孵育，然后进行电化学检测；

其中，第一次孵育的缓冲溶液中含有卵清蛋白OVA，第二次孵育的缓冲溶液中含有二茂铁硼酸FcBA。

在上述检测方法中，孵育时间可以在宽的范围内选择，但是为了提高检测结果的准确性，优选地，第一次孵育、第二次孵育各自独立地满足以下条件：孵育时间为10-20min。

在上述检测方法中，第二次孵育的缓冲溶液中二茂铁硼酸FcBA的浓度可以在宽的范围内选择，但是为了提高检测结果的准确性，优选地，第二次孵育的缓冲溶液中二茂铁硼酸FcBA的浓度为0.08-0.12mmol/L。

在上述检测方法中，缓冲溶液的pH可以在宽的范围内选择，但是为了提高检测结果的准确性，进一步优选地，所述第一次孵育、第二次孵育的缓冲溶液的pH为8-9。

在上述检测方法中，电化学检测的方法可以在宽的范围内选择，但是为了提高检测结果的准确性，优选地，电化学检测采用差分脉冲伏安法DPV进行，电压为-0.5～+0.5V。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

实施例1

1)pABSA/GCE的制备

将玻碳电极GCE浸入含有2×10^-4mol/L ABSA的pH为7.0的PBS溶液中，利用CV法扫描15圈，聚合电位为-1.5～+2.5V，扫速为100mV/s，将聚合好的电极用去离子水冲洗，即可得到pABSA/GCE。

2)pTH/pABSA/GCE的制备

将pABSA/GCE浸入含有5mmol/L TH的pH为5.0的PBS溶液中，利用CV法扫描30圈，聚合电位为-0.4～+0.4V，扫速为100mV/s，将聚合好的电极用去离子水冲洗，即可得到pTH/pABSA/GCE。

3)印迹电化学传感器的制备

将pTH/pABSA/GCE浸入含有10mmol/L 3-TBA和0.4mg/mL OVA的pH为8.0的PBS溶液中，采用CV法进行电聚合：电位范围为-0.2～+1.2V，扫速为125mV/s，聚合圈数为20圈。然后将得到的修饰电极浸入pH为0.3的HCl溶液中浸泡20min来洗脱OVA，即可得到MIP/pTH/pABSA/GCE。

实施例2

1)pABSA/GCE的制备

将玻碳电极GCE浸入含有1×10^-4mol/L ABSA的pH为7.5的PBS溶液中，利用CV法扫描18圈，聚合电位为-1.5～+2.5V，扫速为80mV/s，将聚合好的电极用去离子水冲洗，即可得到pABSA/GCE。

2)pTH/pABSA/GCE的制备

将pABSA/GCE浸入含有4mmol/L TH的pH为5.5的PBS溶液中，利用CV法扫描32圈，聚合电位为-0.4～+0.4V，扫速为80mV/s，将聚合好的电极用去离子水冲洗，即可得到pTH/pABSA/GCE。

3)印迹电化学传感器的制备

将pTH/pABSA/GCE浸入含有8mmol/L 3-TBA和0.3mg/mL OVA的pH为8.5的PBS溶液中，采用CV法进行电聚合：电位范围为-0.2～+1.2V，扫速为120mV/s，聚合圈数为22圈。然后将得到的修饰电极浸入pH为0.4的HCl溶液中浸泡20min来洗脱OVA，即可得到MIP/pTH/pABSA/GCE。

实施例3

1)pABSA/GCE的制备

将玻碳电极GCE浸入含有3×10^-4mol/L ABSA的pH为6.5的PBS溶液中，利用CV法扫描12圈，聚合电位为-1.5～+2.5V，扫速为120mV/s，将聚合好的电极用去离子水冲洗，即可得到pABSA/GCE。

2)pTH/pABSA/GCE的制备

将pABSA/GCE浸入含有6mmol/L TH的pH为4.5的PBS溶液中，利用CV法扫描28圈，聚合电位为-0.4～+0.4V，扫速为120mV/s，将聚合好的电极用去离子水冲洗，即可得到pTH/pABSA/GCE。

3)印迹电化学传感器的制备

将pTH/pABSA/GCE浸入含有12mmol/L 3-TBA和0.5mg/mL OVA的pH为7.5的PBS溶液中，采用CV法进行电聚合：电位范围为-0.2～+1.2V，扫速为130mV/s，聚合圈数为18圈。然后将得到的修饰电极浸入pH为0.2的HCl溶液中浸泡20min来洗脱OVA，即可得到MIP/pTH/pABSA/GCE。

应用例1

MIP/pTH/pABSA/GCE电化学检测分为两步，第一步是将洗脱后的电极置于pH为6.0的PBS溶液中在-0.5～+0.5V范围内采用差示脉冲伏安法DPV检测，取出冲洗后将其置于含有一定浓度的OVA的pH为8.5的PBS溶液及含有0.1mmol/L FcBA的pH为8.5的PBS溶液连续孵育。然后进行电化学检测的第二步，将孵育后的电极置于pH为6.0的PBS溶液中在-0.5～+0.5V范围采用差分脉冲伏安法DPV检测。

1)将实施例1中MIP/pTH/pABSA/GCE置于含有1ng/mL的干扰物和OVA的pH为8.5的PBS溶液及含有0.1mmol/L FcBA的pH为8.5的PBS溶液连续孵育(每次孵育15min)，采用DPV在-0.5～+0.5V范围内进行选择性检测；检测结果见图1。

图1中干扰物为辣根过氧化物酶(HRP)、菠萝蛋白酶(Bromelian)、牛血清白蛋白(BSA)、牛血红蛋白(BHb)，由图1可知，传感器对OVA的电流响应远大于其他干扰物，说明传感器对OVA有优异的选择性识别能力。

2)将实施例1中MIP/pTH/pABSA/GCE置于含不同浓度的OVA的pH为8.5的PBS溶液及含有0.1mmol/L FcBA的pH为8.5的PBS溶液连续孵育(每次孵育15min)，采用DPV在-0.5～+0.5V范围内进行灵敏度检测。

图2A是MIP/pTH/pABSA/GCE传感器检测不同浓度OVA(浓度的依次为：0、0.001、0.01、0.1、1、10、100ng/mL)的DPV图，可以看到，随着OVA浓度的增加，TH的峰电流逐渐减小，同时FcBA的峰电流逐渐增加。以|Δi_TH|+|Δi_FcBA|为输出信号，|Δi_TH|指的是洗脱后与连续孵育后产生的TH峰电流值变化的绝对值，|Δi_FcBA|指的是第二次孵育后产生的FcBA峰电流值的绝对值，得到图2B的线性拟合曲线，由图2B可知，线性范围是0.001-100ng/mL，检出限是0.00082ng/mL，灵敏度远优于现有的检测方法。

按照上述方法1)和方法2)对OVA进行检测，所不同的是将传感器换为实施例2-3的传感器，检测结果与实施例1的传感器的检测结果基本一致。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。