阅读说明：本技术 使用人类间充质干细胞以实现细胞免疫及体液免疫的方法 (Method for achieving cellular immunity and humoral immunity by using human mesenchymal stem cells ) 是由 约书亚·M·哈尔 阿娜·玛丽·兰丁 于 2017-11-10 设计创作，主要内容包括：本发明提供通过施用治疗有效量的分离的同种异体人类间充质干细胞群治疗具有非缺血性扩张型心肌病的受试者的方法。本发明还提供通过施用治疗有效量的分离的同种异体人类间充质干细胞群治疗具有老化衰弱综合征的受试者的方法。(The present invention provides methods of treating a subject with non-ischemic dilated cardiomyopathy by administering a therapeutically effective amount of an isolated population of allogeneic human mesenchymal stem cells. The invention also provides methods of treating a subject with a debilitating aging syndrome by administering a therapeutically effective amount of an isolated population of allogeneic human mesenchymal stem cells.)

使用人类间充质干细胞以实现细胞免疫及体液免疫的方法

技术领域

本发明关于施用治疗有效量的分离的同种异体间充质干细胞群以在患有非缺血性扩张型心肌病的受试者中实现细胞免疫和体液免疫的方法。本发明还关于施用治疗有效量的分离的同种异体间充质干细胞群以在患有老化衰弱的受试者中实现细胞免疫和体液免疫的方法。

背景技术

老化衰弱(aging Frailty)和炎性衰老(inflammaging)

老化衰弱对个体的整体健康及幸福造成非常令人担忧的问题，且其特征为多系统生理失调的综合征。老化衰弱是一种特征为虚弱、低身体活动、缓慢运动机能、疲惫、及非自愿性体重减轻的老年综合征。参见Yao,X.et al.,Clinics in Geriatric Medicine 27(1)：79-87(2011)。此外，有许多显示老化衰弱与炎症之间有直接相关性的研究。参见Hubbard,R.E.et al.,Biogerontology 11(5)：635-641(2010)。

免疫衰老的特征在于称为炎性衰老的低度、慢性全身性发炎状态。参见Franceshi,C.et al.,Annals of the New York Academy of Sciences 908：244-254(2000)。在衰老及老化衰弱中发现的此种增强的发炎状态或慢性炎症导致免疫失调及先天性和适应性免疫的复杂重塑。在免疫衰老中，T细胞及B细胞库(repertoire)是偏态的(skewed)，导致重新表达CD45ra的CD8⁺T效应性记忆细胞(TEMRA)及CD19⁺晚期/衰竭性(exhausted)记忆B细胞的增加，以及CD8⁺初始T细胞和转换的记忆B细胞(CD27⁺)的减少。参见Blomberg,B.B.et al.,Immunologic Research 57(1-3)：354-360(2013)；Colonna-Romano,G.et al.,Mechanisms of Ageing and Development 130(10)：681-690(2009)；及Koch S.et al.,Immunity&Ageing：5:6(2008)。此T细胞和B细胞库的偏移导致难治性或较低效率的免疫状态。众所周知与年龄相关的全身性发炎(TNF-α、IL-6、IL-8、INFγ和CRP)的增加导致B细胞功能受损。

因为炎性衰老在免疫改变与老年人中常见的若干疾病和病症(诸如老化衰弱)之间提供关联性，所以炎性衰老已受到相当大的关注。观察到诸如细胞因子和急性期蛋白的循环发炎介质是随着老化而增加的低度炎症标志物。这些前炎性细胞因子(例如TNF-α、IL-6)损害B细胞制造抗外因性抗原和疫苗的保护性抗体的能力。此受损的B细胞反应由减少的类型转换重组(CSR，class switch recombination)测量，该类型转换重组(CSR)是免疫球蛋白从同型IgM转换成第二同型(IgG、IgA、或IgE)的能力。免疫球蛋白同型转换对于适当的免疫反应是至关重要的，因为效用功能在各同型中不同。CSR及体细胞超突变(SHM)中的关键参与者是酶，活化诱导的胞苷脱胺酶(AID)，由Aicda基因编码。CSR和SHM中，AID的基本功能是在免疫球蛋白的开关和可变区中通过将胞嘧啶转变成尿嘧啶而引发DNA断裂。由Tcfe2a(E2A)基因编码的E47是属于类别I碱性螺旋环螺旋(bHLH)蛋白质的转录因子，亦称为E蛋白。在不表达E47的情况下，B细胞特异性转录因子EBF1(早期B细胞因子)及Pax-5(成对盒蛋白)不表达。E47及Pax-5两者在B细胞谱系早期发育和成熟B细胞功能中都是关键转录因子。参见Hagman J.et al.,Immunity 27(1)：8-10(2007)；Horcher M.et al.,Immunity 14(6)：779-790(2001)；Riley R.L.et al.,Seminars inImmunology 17(5)：330-336(2005)。Pax-5基因编码在B细胞分化的所有阶段表达、但在终末分化的B细胞中不表达的B细胞谱系特异性激活蛋白(BSAP)。Pax-5通过抑制B谱系不当基因及活化B细胞特异性基因而控制B细胞定向(commitment)，使得Pax-5成为B细胞的守门人，并且在B淋巴谱系中从定向的祖B细胞至成熟的B细胞阶段专有表达。B细胞特异性转录因子Pax-5不仅在早期B细胞发育及B细胞谱系定向中非常重要，且其还涉及CSR。

在人类中已显示制造的TNF-α的量：(1)取决于系统发炎的量及(2)损害相同的B细胞被丝裂原或抗原刺激的能力。参见Frasca,D.et al.,Journal of Immunology 188(1)：279-286(2012)。因此，患有老化衰弱的受试者中的免疫反应因若干原因而受损。

非缺血性扩张型心肌病(NIDCM)

非缺血性扩张型心肌病(NIDCM)是目前无法治愈的进行性疾病，通常导致心脏移植。参见Felker,G.M.et al.,The New England Journal of Medicine 342：1077-84(2000)及Kirklin,J.K.et al.,J.Heart Lung Transplant.35：407-412(2016)。NIDCM是一种以主要成分的免疫失调作为潜在病因的疾病。参见Efthimiadis,I.et al.,Hippokratia15：335-342(2011)及Meng,X.et al.,Nature Reviews Cardiology 13：167-79(2016)。针对心脏病基于细胞的治疗是一种评估中有前景的新治疗策略，而主要挑战及机会在于发展同种异体的治疗。参见Patel,A.N.et al.,Lancet 387：2412-21(2016)；Assmus,B.et al.,The New England Journal of Medicine 355：1222-32(2006)；Hare,J.M.et al.,J.Am.Coll.Cardiol.54：2277-86(2009)；Heldman,A.W.et al.,JAMA 311：62-73(2014)；Perin,E.C.et al.,JAMA 307：1717-26(2012)；Golpanian,S.et al.,Physiol.Rev.96：1127-68(2016)；及Hare,J.M.et al.,JAMA 308：2369-79(2012)。

间充质干细胞

间充质干细胞是能够迁移至损伤部位的多潜能细胞，且由于非测出地表达主要组织相容性复合体类别II(MHC-II)分子、以及低水平地表达MHC-I分子而被免疫豁免。参见LeBlanc,K.et al.,Lancet 371(9624)：1579-1586(2008)和Klyushnenkova E.et al.,J.Biomed.Sci.12(1)：47-57(2005)。就此而言，同种异体间充质干细胞对治疗及再生医学而言有很大的希望，且已一再显示在针对多种疾病过程的临床试验中具有高安全性及疗效分布。参见Hare,J.M.et al.,Journal of the American College of Cardiology 54(24)：2277-2286(2009)；Hare,J.M.et al.,Tex.Heart Inst.J.36(2)：145-147(2009)；和Lalu,M.M.et al.,PloS One 7(10)：e47559(2012)。它们还已显示在移植到患者体内后不发生恶性转变。参见Togel F.et al.,American Journal of Physiology RenalPhysiology 289(1)：F31-F42(2005)。使用间充质干细胞的治疗已显示改善严重的移植物抗宿主疾病、防止缺血性急性肾衰竭、有助于糖尿病中胰岛和肾小球的修复、逆转暴发性肝衰竭、使受损的肺组织再生、减弱败血症、及逆向重建和改善心肌梗塞后的心脏功能。参见Le Blanc K.et al.,Lancet 371(9624)：1579-1586(2008)；Hare,J.M.et al.,Journal ofthe American College of Cardiology 54(24)：2277-2286(2009)；Togel F.et al.,American Journal of Physiology Renal Physiology 289(1)：F31-F42(2005)；LeeR.H.et al.,PNAS 103(46)：17438-17442(2006)；Parekkadan,B.et al.,PloS One 2(9)：e941(2007)；Ishizawa K.et al.,FEBS Letters 556(1-3)：249-252(2004)；Nemeth K.etal.,Nature Medicine 15(1)：42-49(2009)；Iso Y.et al.,Biochem.Biophys.Res.Comm.354(3)：700-706(2007)；Schuleri K.H.et al.,Eur.HearthJ.30(22)：2722-2732(2009)；及Heldman A.W.et al.,JAMA 311(1)：62-73(2014)。此外，间充质干细胞亦还是用于组织工程的多种细胞类型的潜在来源。参见Gong Z.et al.,Methods in Mol.Bio.698：279-294(2011)；Price,A.P.et al.,Tissue Engineering PartA 16(8)：2581-2591(2010)；及Togel F.et al.,Organogenesis 7(2)：96-100(2011)。

间充质干细胞具有免疫调节能力。它们控制发炎以及淋巴细胞和骨髓衍生免疫细胞的细胞因子的产生而没有免疫抑制毒性的证据，并且是低免疫原性的。参见BernardoM.E.et al.,Cell Stem Cell 13(4)：392-402(2013)。

间充质干细胞还具有不仅分化成中胚层来源细胞且分化成内胚层和外胚层来源细胞的能力。参见Le Blanc K.et al.,Exp.Hematol.31(10)：890-896(2003)。举例而言，在体外，在气道生长介质中培养的间充质干细胞分化以表现肺特异性上皮标志物，例如表面活性物质蛋白C、Clara细胞分泌蛋白、及甲状腺转录因子1。参见Jiang Y.et al.,Nature418(6893)：41-49(2002)及Kotton D.N.et al.,Development 128(24)：5181-5188(2001)。

体内研究已显示当人类间充质干细胞移植至胎羊中时，该人类间充质干细胞经历位置特异性分化成各种细胞类型，包括肌细胞及心肌细胞。参见Airey J.A.et al.,Circulation 109(11)：1401-1407(2004)。在非免疫抑制的免疫活性宿主中，这些间充质干细胞在移植后在多个组织中可持续长达13个月。其他使用啮齿动物、狗、山羊和狒狒的体内研究类似地证明人类间充质干细胞异种移植不引起受体中淋巴细胞增生或全身性同种抗体产生。参见Klyushnenkova E.et al.,J.Biomed.Sci.12(1)：47-57(2005)；AggarwalS.et al.,Blood 105(4)：1815-22(2005)；Augello A.et al.,Arthritis and Rheumatism56(4)：1175-86(2007)；Bartholomew A.et al.,Exp Hematol.30(1)：42-48.(2002)；DokicJ.et al.,European Journal of Immunology 43(7)：1862-72(2013)；Gerdoni E.et al.,Annals of Neurology 61(3)：219-227(2007)；Lee S.H.et al.,Respiratory Research11：16(2010)；Urban V.S.et al.,Stem Cells 26(1)：244-253(2008)；Yang H.et al.,PloS One 8(7)：e69129(2013)；Zappia E.et al.,Blood 106(5)：1755-1761(2005)；Bonfield T.L.et al.,American Journal of Physiology Lung Cellular andMolecular Physiology 299(6)：L760-70(2010)；Glenn J.D.et al.,World Journal ofStem Cells.6(5)：526-39(2014)；Guo K.et al.,Frontiers in Cell and DevelopmentalBiology 2：8(2014)；Puissant B.et al.,British Journal of Haematology 129(1)：118-129(2005)；及Sun L.et al.,Stem Cells 27(6)：1421-32(2009)。总体而言，这些同种异体安全性及疗效的重复发现巩固使用间充质干细胞作为同种移植用于成功组织再生的想法。

然而，尽管作为安全的治疗剂，但间充质干细胞在文献中被报导对抗体产生及B细胞的增殖和成熟施加抑制效果。参见Uccelli,A.et al.,Trends in Immunology 28(5)：219-226(2007)。间充质干细胞还被报导抑制抗原呈现细胞的产生及功能。参见HoogduijnM.J.et al.,Int.Immunopharmacology10(12)：1496-1500(2010)。最后，间充质干细胞被报导抑制CD4+和CD8+T细胞增殖。参见Ghannam S.et al.,Stem Cell Res.&Ther.1：2(2010)。最后，一些临床前数据显示：与施用自体间充质干细胞相比，施用同种异体间充质干细胞有较高的免疫清除风险。参见例如Huang,X.P.et al.,Circulation 122：2419-29(2010)。

发明内容

出乎意料地，尽管报导指出间充质干细胞对免疫系统方面具有抑制效果，但本发明人发现一种治疗受试者中非缺血性扩张型心肌病的方法，包括对有需要的受试者施用治疗有效量的分离的同种异体人类间充质干细胞群。本发明人还发现一种治疗受试者中老化衰弱综合征的方法，包括对有需要的受试者施用治疗有效量的分离的同种异体人类间充质干细胞群。本发明人识别对非缺血性扩张型心肌病及老化衰弱具特异性的几个生物标志物，包含但不限于血清中的衰竭性B细胞(CD19⁺、CD27^-、IgD^-)的水平、转换的记忆B细胞(CD19⁺、CD27^高、IgD^-)的水平、表达细胞内TNF-α的B细胞的水平、早期活化T细胞(CD3⁺、CD69⁺)的水平、慢性活化T细胞(CD3⁺、CD25⁺)的水平、Temra细胞(CD45RA⁺、CCR7^-)的水、CD4⁺:CD8⁺T细胞比率、和TNF-α浓度。

本发明的一个方面关于一种治疗受试者中非缺血性扩张型心肌病的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的分离的同种异体人类间充质干细胞群，其中，与施用所述分离的同种异体人类间充质干细胞群之前的所述受试者血清样本中的衰竭性B细胞(CD19⁺、CD27^-、IgD^-)的数目相比，所述受试者血清样本中衰竭性B细胞的数目减少至少25％，从而治疗该非缺血性扩张型心肌病。

本发明的另一方面关于一种治疗受试者中非缺血性扩张型心肌病的方法，包括向需要的受试者施用治疗有效量的分离的同种异体人类间充质干细胞群，其中，与施用该分离的同种异体人类间充质干细胞群之前的该受试者血清样本中转换的记忆B细胞(CD19⁺、CD27^高、IgD^-)的数目相比，所述受试者血清样本中转换的记忆B细胞的数目增加至少100％，从而治疗该非缺血性扩张型心肌病。

本发明的另一方面关于一种治疗受试者中非缺血性扩张型心肌病的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的分离的同种异体人类间充质干细胞群，其中，与施用该分离的同种异体人类间充质干细胞群之前的该受试者血清样本中表达细胞内TNF-α的B细胞的数目相比，该受试者血清样本中表达细胞内TNF-α的B细胞的数目减少至少30％，从而治疗该非缺血性扩张型心肌病。

本发明的另一方面关于一种治疗受试者中非缺血性扩张型心肌病的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的分离的同种异体人类间充质干细胞群，其中，与施用该分离的同种异体人类间充质干细胞群之前的该受试者血清样本中早期活化T细胞(CD3⁺、CD69⁺)的数目相比，该受试者血清样本中早期活化T细胞的数目减少至少30％，从而治疗该非缺血性扩张型心肌病。

本发明的另一方面关于一种治疗受试者中非缺血性扩张型心肌病的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的分离的同种异体人类间充质干细胞群，其中，与施用该分离的同种异体人类间充质干细胞群之前的该受试者血清样本中慢性活化T细胞(CD3⁺、CD25⁺)的数目相比，该受试者血清样本中慢性活化T细胞的数目减少至少70％，从而治疗该非缺血性扩张型心肌病。

本发明的另一方面关于一种治疗受试者中非缺血性扩张型心肌病的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的分离的同种异体人类间充质干细胞群，其中，与施用该分离的同种异体人类间充质干细胞群之前的该受试者血清样本中Temra细胞(CD45RA⁺、CCR7^-)的数目相比，该受试者血清样本中Temra细胞的数目减少至少40％，从而治疗该非缺血性扩张型心肌病。

本发明的另一方面关于一种治疗受试者中非缺血性扩张型心肌病的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的分离的同种异体人类间充质干细胞群，其中，与施用该分离的同种异体人类间充质干细胞群之前的该受试者血清样本中的TNF-α浓度相比，该受试者血清样本中的TNF-α浓度减少至少80％，从而治疗该非缺血性扩张型心肌病。

本发明的另一方面关于一种治疗受试者中老化衰弱综合征的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的分离的同种异体人类间充质干细胞群，其中，与施用该分离的同种异体人类间充质干细胞群之前的该受试者血清样本中衰竭性B细胞(CD19⁺、CD27^-、IgD^-)的数目相比，该受试者血清样本中衰竭性B细胞的数目减少至少10％，从而治疗该老化衰弱综合症。

本发明的另一方面关于一种治疗受试者中老化衰弱综合症状的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的分离的同种异体人类间充质干细胞群，其中，与施用该分离的同种异体人类间充质干细胞群之前的该受试者血清样本中转换的记忆B细胞(CD19⁺、CD27^高、IgD^-)的数目相比，该受试者血清样本中转换的记忆B细胞的数目增加至少75％，从而治疗该老化衰弱综合症。

本发明的另一方面关于一种治疗受试者中老化衰弱综合症的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的分离的同种异体人类间充质干细胞群，其中，与施用该分离的同种异体人类间充质干细胞群之前的该受试者血清样本中表达细胞内TNF-α的B细胞的数目相比，该受试者血清样本中表达细胞内TNF-α的B细胞的数目减少至少60％，从而治疗该老化衰弱综合症。

本发明的另一方面关于一种治疗受试者中老化衰弱综合症的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的分离的同种异体人类间充质干细胞群，其中，与施用该分离的同种异体人类间充质干细胞群之前的该受试者血清样本中早期活化T细胞(CD3⁺、CD69⁺)的数目相比，该受试者血清样本中早期活化T细胞的数目减少至少30％，从而治疗该老化衰弱综合症。

本发明的另一方面关于一种治疗受试者中老化衰弱综合症的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量之分离的同种异体人类间充质干细胞群，其中，与施用该分离的同种异体人类间充质干细胞群之前的该受试者血清样本中慢性活化T细胞(CD3⁺、CD25⁺)的数目相比，该受试者血清样本中慢性活化T细胞的数目减少至少75％，从而治疗该老化衰弱综合症。

本发明的另一方面关于一种治疗受试者中老化衰弱综合症的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的分离的同种异体人类间充质干细胞群，其中，与施用该分离的同种异体人类间充质干细胞群之前的该受试者血清样本中Temra细胞(CD45RA⁺、CCR7^-)的数目相比，该受试者血清样本中Temra细胞的数目减少至少20％，从而治疗该老化衰弱综合症。

本发明的另一方面关于一种治疗受试者中老化衰弱综合征的方法，包括向需要其的受试者施用治疗有效量的分离的同种异体人类间充质干细胞群，其中，与施用该分离的同种异体人类间充质干细胞群之前的该受试者血清样本中的TNF-α浓度相比，该受试者血清样本中的TNF-α浓度减少至少50％，从而治疗该老化衰弱综合症。

本发明的另一方面关于一种治疗受试者中老化衰弱综合症状的方法，包括向需要其的受试者施用治疗有效量的分离的同种异体人类间充质干细胞群，其中，与施用该分离的同种异体人类间充质干细胞群之前的该受试者血清样本中的CD4⁺:CD8⁺T细胞的比率相比，该受试者血清样本中的CD4⁺:CD8⁺T细胞的比率增加至少100％，从而治疗该老化衰弱综合症。

在本发明的一实施方式中，受试者是人类。在本发明的另一实施方式中，受试者是表现炎性衰老的人类。

在本发明的一实施方式中，间充质干细胞是来源于骨髓的间充质干细胞。在本发明的一实施方式中，间充质干细胞不表达STRO-1。在本发明的另一实施方式中，间充质干细胞不表达CD45。在本发明的另一实施方式中，间充质干细胞不表达纤维母细胞表面标志物或不具有纤维母细胞形态。在本发明的另一实施方式中，间充质干细胞不是基因操作的(genetically manipulated)。

在本发明的另一实施方式中，分离的同种异体间充质干细胞群系以单剂量施用。在本发明的另一实施方式中，分离的同种异体间充质干细胞群系以多剂量(例如二剂量或更多剂量)施用。在本发明的另一实施方式中，分离的同种异体间充质干细胞群至少每年施用一次。

在一实施方式中，分离的同种异体间充质干细胞群是全身性地施用的。在本发明的一实施方式中，分离的同种异体间充质干细胞群是通过输注或直接注射施用的。在本发明的一实施方式中，分离的同种异体间充质干细胞群是静脉内、动脉内、肌内、腹腔内、皮下、皮内、口服、心内膜、或鼻内施用的。在进一步的实施方式中，分离的同种异体间充质干细胞群是静脉内施用。在进一步的实施方式中，分离的同种异体间充质干细胞群是肌内施用的。

在本发明的一实施方式中，分离的同种异体间充质干细胞群系以约20×10⁶的间充质干细胞的剂量施用。在本发明的另一实施方式中，分离的同种异体间充质干细胞群以约100×10⁶的间充质干细胞的剂量施用。在本发明的另一实施方式中，分离的同种异体间充质干细胞群系以约200×10⁶间充质干细胞的剂量施用。

在本发明的一实施方式中，分离的同种异体间充质干细胞群是从人类供体获得的，并且在向受试者施用所述分离的同种异体间充质干细胞群之前，不使用人类供体对受试者的MHC配型步骤。

本发明的另一方面关于一种评估受试者中细胞免疫状态和体液免疫状态的方法，包括：

(1)从受试者获得血清样本，所述受试者是基于确定该受试者先前需治疗非缺血性扩张型心肌病且该受试者已被施用初始剂量的分离的同种异体人类间充质干细胞群而被选择用于评估的；

(2)通过将从所述受试者获得的血清样本引入测定仪器来进行被配置为检测非缺血性扩张型心肌病的标志物的一个或多个测定，所述标志物选自衰竭性B细胞(CD19⁺、CD27^-、IgD^-)、转换的记忆B细胞(CD19⁺、CD27^高、IgD^-)、表达细胞内TNF-α的B细胞、早期活化T细胞(CD3⁺、CD69⁺)、慢性活化T细胞(CD3⁺、CD25⁺)、Temra细胞(CD45RA⁺、CCR7^-)和血清TNF-α的组，所述测定仪器(i)使该血清样本与特异性结合用于检测被测定生物标志物的一种或多种抗体接触，及(ii)产生一个或多个测定结果，所述测定结果表明被测定的每个标志物结合至各自抗体，以提供一个或多个测定结果；

(3)使由所述测定仪器产生的测定结果与所述受试者的免疫状态相关联，其中，该相关联步骤包括基于该测定结果向所述受试者分配免疫状态的一个或多个未来变化的可能性；以及

(4)基于所述受试者被分配至的个体的预定亚群而治疗所述受试者，其中，所述治疗包括施用一个或多个额外剂量的分离的同种异体人类间充质干细胞群。

本发明的另一方面关于一种评估受试者中细胞免疫状态和体液免疫状态的方法，包括：

(1)从被选择用于评估的受试者获得血清样本，所述评估基于确定所述受试者先前需治疗老化衰弱综合症且所述受试者已被施用初始剂量的分离的同种异体人类间充质干细胞群；

(2)通过将从所述受试者获得的该血清样本引入测定仪器来进行被配置为检测老化衰弱标志物的一个或多个测定，所述标志物选自衰竭性B细胞(CD19⁺、CD27^-、IgD^-)、转换的记忆B细胞(CD19⁺、CD27^高、IgD^-)、表达细胞内TNF-α的B细胞、早期活化T细胞(CD3⁺、CD69⁺)、慢性活化T细胞(CD3⁺、CD25⁺)、Temra细胞(CD45RA⁺、CCR7^-)、CD4⁺:CD8⁺T细胞比率、及血清TNF-α的组，所述测定仪器(i)使该血清样本与特异性结合用于检测被测定生物标志物的一种或多种抗体接触，和(ii)产生一个或多个测定结果，所述测定结果表明被测定的每个标志物结合至各自抗体，以提供一个或多个测定结果；

(3)使由所述测定仪器产生的测定结果与所述受试者的免疫状态相关联，其中，该相关联步骤包括基于所述测定结果向所述受试者分配免疫状态的一个或多个未来变化的可能性；以及

(4)基于所述受试者被分配至的个体的预定亚群而治疗所述受试者，其中，所述治疗包括施用一个或多个额外剂量的分离的同种异体人类间充质干细胞群。

在本发明的一实施方式中，免疫状态的一个或多个未来变化包括下列的一个或多个：衰竭性B细胞(CD19⁺、CD27^-、IgD^-)的数目的增加、转换的记忆B细胞(CD19⁺、CD27^高、IgD^-)的数目的减少、表达细胞内TNF-α的B细胞的数目的增加、早期活化T细胞(CD3⁺、CD69⁺)的数目的增加、慢性活化T细胞(CD3⁺、CD25⁺)的数目的增加、Temra细胞(CD45RA⁺、CCR7^-)的数目的增加、CD4⁺：CD8⁺T细胞比率的降低、和血清TNF-α的增加。

本发明的另一方面关于一种确定受试者中非缺血性扩张型心肌病的治疗疗效的体外方法，包括：在向该受试者施用分离的同种异体人类间充质干细胞群之前及之后，确定从该受试者获得的血清中选自由以下组成的组的一种或多种生物标志物的水平：衰竭性B细胞(CD19⁺、CD27^-、IgD^-)、转换的记忆B细胞(CD19⁺、CD27^高、IgD^-)、表现细胞内TNF-α的B细胞、早期活化T细胞(CD3⁺、CD69⁺)、慢性活化T细胞(CD3⁺、CD25⁺)、Temra细胞(CD45RA⁺、CCR7^-)、和TNF-α浓度；以及将在施用所述分离的人类间充质干细胞群之前及之后获得的血清中的所述一种或多种生物标志物的水平进行比较，其中，如果以下情况，所述治疗是有效的：

(1)与施用该分离的同种异体人类间充质干细胞群之前的衰竭性B细胞(CD19⁺、CD27^-、IgD^-)的数目相比，衰竭性B细胞的数目减少至少25％，

(2)与施用该分离的同种异体人类间充质干细胞群之前的转换的记忆B细胞(CD19⁺、CD27^高、IgD^-)的数目相比，转换的记忆B细胞的数目增加至少100％，

(3)与施用该分离的同种异体人类间充质干细胞群之前的表达细胞内TNF-α的B细胞的数目相比，该表达细胞内TNF-α的B细胞的数目减少至少30％，

(4)与施用该分离的同种异体人类间充质干细胞群之前的早期活化T细胞(CD3⁺、CD69⁺)的数目相比，该早期活化T细胞的数目减少至少30％，

(5)与施用该分离的同种异体人类间充质干细胞群之前的慢性活化T细胞(CD3⁺、CD25⁺)的数目相比，该慢性活化T细胞的数目减少至少70％，

(6)与施用该分离的同种异体人类间充质干细胞群之前的Temra细胞(CD45RA⁺、CCR7^-)的数目相比，该Temra细胞的数目减少至少40％，和/或

(7)与施用该分离的同种异体人类间充质干细胞群之前的该受试者血清样本中的TNF-α浓度相比，该受试者血清样本中的TNF-α浓度降低至少80％。

本发明的另一方面关于一种确定治疗受试者中老化衰弱综合症的治疗疗效的体外方法，包括：在向该受试者施用分离的同种异体人类间充质干细胞群之前及之后，确定从该受试者获得的血清中选自由以下组成的组的一种或多种生物标志物的水平：衰竭性B细胞(CD19⁺、CD27^-、IgD^-)、转换的记忆B细胞(CD19⁺、CD27^高、IgD^-)、表达细胞内TNF-α的B细胞、早期活化T细胞(CD3⁺、CD69⁺)、慢性活化T细胞(CD3⁺、CD25⁺)、Temra细胞(CD45RA⁺、CCR7^-)、CD4⁺：CD8⁺T细胞比率、和TNF-α浓度；以及将在施用所述分离的人类间充质干细胞群之前及之后获得的血清中的所述一种或多种生物标志物的水平进行比较，其中，如果以下情况，所述治疗是有效的：

(1)与施用该分离的同种异体人类间充质干细胞群之前的衰竭性B细胞(CD19⁺、CD27^-、IgD^-)的数目相比，该衰竭性B细胞的数目减少至少10％，

(2)与施用该分离的同种异体人类间充质干细胞群之前的转换的记忆B细胞(CD19⁺、CD27^高、IgD^-)的数目相比，该转换的记忆B细胞的数目增加至少75％，

(3)与施用该分离的同种异体人类间充质干细胞群之前的表达细胞内TNF-α的B细胞的数目相比，该表达细胞内TNF-α的B细胞的数目减少至少60％，

(4)与施用该分离的同种异体人类间充质干细胞群之前的早期活化T细胞(CD3⁺、CD69⁺)的数目相比，该早期活化T细胞的数目减少至少30％，

(5)与施用该分离的同种异体人类间充质干细胞群之前的慢性活化T细胞(CD3⁺、CD25⁺)的数目相比，该慢性活化T细胞的数目减少至少75％，

(6)与施用该分离的同种异体人类间充质干细胞群之前的Temra细胞(CD45RA⁺、CCR7^-)的数目相比，该Temra细胞的数目减少至少20％，

(7)与施用该分离的同种异体人类间充质干细胞群之前的该受试者血清样本中的TNF-α浓度相比，该受试者血清样本中的TNF-α浓度降低至少50％，和/或

(8)与该施用分离的同种异体人类间充质干细胞群之前的该受试者血清样本中的CD4⁺：CD8⁺T细胞比率相比，该受试者血清样本中的CD4⁺：CD8⁺T细胞比率增加至少100％。

本发明的另一方面关于血清中的衰竭性B细胞(CD19⁺、CD27^-、IgD^-)的水平、转换的记忆B细胞(CD19⁺、CD27^高、IgD^-)的水平、表达细胞内TNF-α的B细胞的水平、早期活化T细胞(CD3⁺、CD69⁺)的水平、慢性活化T细胞(CD3⁺、CD25⁺)的水平、Temra细胞(CD45RA⁺、CCR7^-)的水平、和TNF-α浓度用于确定针对非缺血性扩张型心肌病的治疗是否有效的体外用途。

本发明的另一方面关于血清中的衰竭性B细胞(CD19⁺、CD27^-、IgD^-)的水平、转换的记忆B细胞(CD19⁺、CD27^高、IgD^-)的水平、表达细胞内TNF-α的B细胞的水平、早期活化T细胞(CD3⁺、CD69⁺)的水平、慢性活化T细胞(CD3⁺、CD25⁺)的水平、Temra细胞(CD45RA⁺、CCR7^-)的水平、CD4⁺：CD8⁺T细胞比率、和TNF-α浓度用于确定针对老化衰弱的治疗是否有效的体外用途。

附图说明

图1是针对随机、双盲、安慰剂对照研究的符合关系图(consort diagram)，该研究调查同种异体间充质干细胞用于治疗具有衰弱的老年个体的用途。

图2提供在该随机、双盲、安慰剂对照研究中所招收的受试者的基线患者特征，该研究调查同种异体间充质干细胞用于治疗具有衰弱的年长个体的用途。

图3显示在施用同种异体人类间充质干细胞的老年受试者中TNF-α的减少。

图4显示在施用同种异体人类间充质干细胞的老年受试者中表达CD69的早期活化T细胞的减少。

图5显示在施用同种异体人类间充质干细胞的老年受试者中表达CD25的慢性/晚期活化T细胞的数目的减少。

图6显示在施用同种异体人类间充质干细胞的老年受试者中CD8+T细胞的测量值。

图7显示在施用同种异体人类间充质干细胞的老年受试者中CD4+/CD8+T细胞的比率的增加。

图8显示在接受两次人类间充质干细胞输注的具有老化衰弱的受试者中增加的免疫衰老分数。

图9显示基线血清TNF-α与基线表达IC TNF-α的B细胞之间的相关性。

图10提供在年轻对照BL、低TNF：IC TNF BL、及高TNF：IC TNFBL中表达IC TNF-α的B细胞的％。

图11提供在年轻对照BL、低TNF：转换的记忆B细胞BL、及高TNF：转换的记忆B细胞BL中转换的记忆B细胞的％。

图12提供在年轻对照BL、低TNF：衰竭性B细胞BL、及高TNF：衰竭性B细胞BL中衰竭性B细胞的％。

图13提供在年轻对照BL、低TNF：Temra细胞BL、及高TNF：Temra细胞BL中Temra细胞的％。

图14提供在年轻对照BL、低TNF：CD4：CD8 BL、及高TNF：CD4：CD8 BL中的CD4+/CD8+T细胞比率。

图15提供在安慰剂对照、低TNF-α、及高TNF-α中血清TNF-α的绝对变化(以pg/ml)。

图16显示基线血清TNF-α与血清TNF-α变化之间的相关性。

图17显示在安慰剂对照、低TNF-α、及高TNF-α中表现IC TNF-α的B细胞的绝对变化。

图18显示血清TNF-α与表达IC TNF-α的B细胞的变化之间的相关性。

图19显示在安慰剂对照、低TNF-α、及高TNF-α中转换的记忆B细胞的％的绝对变化。

图20显示在安慰剂对照、低TNF-α、及高TNF-α中衰竭性B细胞的％的绝对变化。

图21显示在安慰剂对照、低TNF-α、及高TNF-α中Temra T细胞的％的绝对变化。

图22显示血清TNF-α变化与Temra T细胞变化之间的相关性。

图23显示在安慰剂对照、低TNF-α、及高TNF-α中CD4⁺/CD8⁺T细胞比率的绝对变化。

图24显示CD4⁺/CD8⁺T细胞比率变化与Temra T细胞变化之间的相关性。

具体实施方式

在某些实施方式中，本发明关于治疗受试者中非缺血性扩张型心肌病的方法，包括对需要其的受试者施用治疗有效量的分离的同种异体人类间充质干细胞群。实施例证实体内施用分离的同种异体人类间充质干细胞群导致受试者中转换的记忆B细胞的百分比增加及衰竭性B细胞的减少。实施例还证实分离的同种异体人类间充质干细胞的体内施用导致受试者中CD4⁺：CD8⁺T细胞比率的改善。此外，如实施例中所示，血清中的表达细胞内TNF-α的B细胞的水平、早期活化T细胞(CD3⁺、CD69⁺)的水平、慢性活化T细胞(CD3⁺、CD25⁺)的水平、Temra细胞(CD45RA⁺、CCR7^-)的水平、及TNF-α浓度在已接受输注同种异体人类间充质干细胞的受试者中降低。从这些意想不到的结果，本发明人确定分离的同种异体人类间充质干细胞有利地改变通常在慢性发炎中升高的数种免疫标志物。免疫能力的恢复在具有共病传染病较高风险的受试者中具有临床相关性。

在其他实施方式中，本发明关于治疗受试者中老化衰弱综合症的方法，包括向需要其的受试者施用治疗有效量的分离的同种异体人类间充质干细胞群。实施例证实体内施用分离的同种异体人类间充质干细胞群导致受试者中转换的记忆B细胞的百分比增加及衰竭性B细胞的减少。实施例还证实体内施用分离的同种异体人类间充质干细胞导致受试者中CD4⁺：CD8⁺T细胞比率的改善。此外，如实施例中所示，血清中的表达细胞内TNF-α的B细胞的水平、早期活化T细胞(CD3⁺、CD69⁺)的水平、慢性活化T细胞(CD3⁺、CD25⁺)的水平、Temra细胞(CD45RA⁺、CCR7^-)的水平、及TNF-α浓度在已接受输注同种异体人类间充质干细胞的受试者中降低。从这些意想不到的结果，本发明人判定分离的同种异体人类间充质干细胞有效减少炎性衰老，一种在老化衰弱中的普遍特征。

定义

实施方式可在不呈现理论层面的情况下实施。此外，应理解在实施方式不受任何所呈现理论限制的情况下提出所述理解层面。

除非另外定义，否则本文使用的所有术语(包含技术及科学术语)具有在此技术领域中具有通常技术者一般所理解的相同含义。应进一步理解术语(诸如常用字典中定义的那些)应被解释为具有与其在相关领域背景中的含义相一致的含义，且不被解释为理想化或过度形式化的意义，除非本文明确如此定义。

本文使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，且不意图为限制性的。如本文所使用，除非上下文另外清楚地指出，否则单数形式的“一”及“所述”意图也包含复数形式。此外，就具体实施方式和/或权利要求书中使用的术语“包含(including/includes)”、“含有(having/has)”、“具有(with)”或其变形程度而言，这样的术语意图为包容性的，类似于术语“包含”的方式。

除非本文另外指出，否则本文数值范围的记载仅意图作为分别提及落入该范围内的各单独数值的速记方法，且各单独数值被包含在说明书中，如同其被单独记载于此。除非另外声明，否则本文提供的任何及所有实施例或示例性语言(例如“诸如”)的使用仅意图更好地阐明本发明，且不对本发明的范围造成限制。说明书中的任何语言皆不应被理解为将任何未要求保护的要素指示为实施本发明所必需的。

术语“约”或“大约”意指在由本领域普通技术人员所确定的特定数值的可接受误差范围内，其将部分取决于该数值如何被测量或确定，即测量系统的限制。举例而言，根据在本领域的实践，“约”可表示在1标准偏差内或多于1标准偏差。或者，“约”可表示参考值的±10％的范围。

剂量、持续时间、及受试者

“治疗有效量”意指刺激B细胞或T细胞依赖的免疫反应的量。此种反应的特征在于引起显著水平的IgG及调理素活性的能力。对受试者的给药剂量及剂数(例如单剂量或多剂量)将根据诸多因素而变化，包含给药途径、患者状况和特征(性别、年龄、体重、健康、体型)、症状程度、并行治疗、治疗频率及期望效果等。

在本发明的一实施方式中，分离的同种异体间充质干细胞群以单剂量给药。在另一实施方式中，分离的同种异体间充质干细胞群以多剂量给药，例如二剂量或更多剂量。在其他实施方式中，分离的同种异体间充质干细胞群至少每年给药一次。

在本发明的另一实施方式中，重复施用所述分离的同种异体间充质干细胞群，诸如在第一次施用所述分离的同种异体间充质干细胞群之后的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、或18个月后，或在第一次施用所述分离的同种异体间充质干细胞群之后的2-4、2-6、2-8、2-10、3-4、3-6、3-8、3-10、4-6、4-8、4-10、6-8、6-10、6-12、或12-18个月之间重复。

在本发明的一实施方式中，分离的同种异体间充质干细胞群以约1×10⁶、2×10⁶、5×10⁶、10×10⁶、20×10⁶、30×10⁶、40×10⁶、50×10⁶、60×10⁶、70×10⁶、80×10⁶、90×10⁶、100×10⁶、110×10⁶、120×10⁶、130×10⁶、140×10⁶、150×10⁶、160×10⁶、170×10⁶、180×10⁶、190×10⁶、200×10⁶、300×10⁶、400×10⁶、500×10⁶、或10×10⁷间充质干细胞的剂量被施用。在进一步的实施方式中，分离的同种异体间充质干细胞群系以约20×10⁶的间充质干细胞的剂量被施用。在进一步的实施方式中，分离的同种异体间充质干细胞群以约100×10⁶的间充质干细胞的剂量被施用。在又进一步的实施方式中，分离的同种异体间充质干细胞群以约200×10⁶的间充质干细胞的剂量被施用。在进一步的实施方式中，分离的同种异体间充质干细胞群以从约1-400×10⁶、10-400×10⁶、100-400×10⁶、20-200×10⁶、20-400×10⁶、0.1-5×10⁶、0.1-10×10⁶、0.1-100×10⁶、1-50×10⁶、1-100×10⁶、0.01-10×10⁶、或0.01-100×10⁶的间充质干细胞的剂量被施用。

在一些实施方式中，分离的同种异体间充质干细胞群的治疗有效量足以增加受试者中CD4⁺：CD8⁺T细胞的比率，例如：与施用所述分离的同种异体间充质干细胞群之前的CD4⁺：CD8⁺T细胞的比率相比，使该比率增加为至少二倍、三倍、四倍、五倍、或六倍，即，增加CD4⁺：CD8⁺T细胞的比率至少100％、200％、300％、400％、或500％。

在一些实施方式中，分离的同种异体间充质干细胞群的治疗有效量足以增加受试者中转换的记忆B细胞(CD19⁺、CD27^高、IgD^-)的数目，例如：与施用所述分离的同种异体间充质干细胞群之前的转换的记忆B细胞的数目相比，使该数目增加为至少二倍、三倍、四倍、或五倍，即，增加转换的记忆B细胞(CD19⁺、CD27^高、IgD^-)的数目至少100％、200％、300％、或400％。在其他实施方式中，与施用所述分离的同种异体间充质干细胞群之前的转换记忆B细胞的数目相比，此B细胞的数目增加至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％。

在一些实施方式中，分离的同种异体间充质干细胞群的治疗有效量足以减少受试者中表达细胞内TNF-α的B细胞的数目，诸如：与施用所述分离的同种异体间充质干细胞群之前的此B细胞的数目相比，以至少二倍、三倍、四倍、五倍或六倍使该数目减少。在其他实施方式中，与施用所述分离的同种异体间充质干细胞群之前的表达细胞内TNF-α的B细胞的数目相比，此B细胞的数目减少至少10％、20％、30％、40％、50％、或60％。

在一些实施方式中，分离的同种异体间充质干细胞群的治疗有效量足以减少受试者中衰竭性B细胞(CD19⁺、CD27^-、IgD^-)的数目，诸如：与施用所述分离的同种异体间充质干细胞群之前的衰竭性B细胞的数目相比，以至少二倍或三倍使该数目减少。在其他实施方式中，与施用所述分离的同种异体间充质干细胞群之前的衰竭性B细胞的数目相比，此B细胞的数目减少至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、或50％。

在一些实施方式中，分离的同种异体间充质干细胞群的治疗有效量足以减少受试者中早期活化T细胞(CD3⁺、CD69⁺)的数目，诸如：与施用所述分离的同种异体间充质干细胞群之前的早期活化T细胞的数目相比，以至少二倍或三倍使该数目减少。在其他实施方式中，与施用所述分离的同种异体间充质干细胞群之前的早期活化T细胞的数目相比，此T细胞的数目减少至少10％、20％、30％、40％、或50％。

在一些实施方式中，分离的同种异体间充质干细胞群的治疗有效量足以减少受试者中慢性活化T细胞(CD3⁺、CD25⁺)的数目，诸如：与施用所述分离的同种异体间充质干细胞群之前的慢性活化T细胞的数目相比，以至少二倍或三倍使该数目减少。在其他实施方式中，与施用所述分离的同种异体间充质干细胞群之前的慢性活化T细胞的数目相比，此T细胞的数目减少至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％。

在一些实施方式中，分离的同种异体间充质干细胞群的治疗有效量足以减少受试者中Temra细胞(CD45RA⁺、CCR7^-)的数目，诸如：与施用所述分离的同种异体间充质干细胞群之前的Temra细胞的数目相比，以至少二倍或三倍使该数目减少。在其他实施方式中，与施用所述分离的同种异体间充质干细胞群之前的Temra细胞的数目相比，此Temra细胞的数目减少至少10％、20％、30％、40％、或50％。

在一些实施方式中，分离的同种异体间充质干细胞群的治疗有效量足以降低受试者血清样本中的TNF-α浓度，诸如：与施用所述分离的同种异体间充质干细胞群之前的TNF-α浓度相比，以至少二倍或三倍使该TNF-α浓度降低。在其他实施方式中，与施用所述分离的同种异体间充质干细胞群之前的TNF-α浓度相比，该TNF-α浓度降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或90％。

本发明的其他方面包括评估受试者中细胞免疫状态和体液免疫状态以确定受试者是否将受益于分离的同种异体间充质干细胞群的施用、以及基于生物标志物数据治疗受试者的预定亚群的方法。举例而言，可进行一个或多个测定以检测选自衰竭性B细胞(CD19⁺、CD27^-、IgD^-)、转换的记忆B细胞(CD19⁺、CD27^高、IgD^-)、表达细胞内TNF-α的B细胞、早期活化T细胞(CD3⁺、CD69⁺)、慢性活化T细胞(CD3⁺、CD25⁺)、Temra细胞(CD45RA⁺、CCR7^-)、及血清TNF-α的组的非缺血性扩张型心肌病的标志物。类似地，可进行一个或多个测定以检测选自衰竭性B细胞(CD19⁺、CD27^-、IgD^-)、转换的记忆B细胞(CD19⁺、CD27^高、IgD^-)、表达细胞内TNF-α的B细胞、早期活化T细胞(CD3⁺、CD69⁺)、慢性活化T细胞(CD3⁺、CD25⁺)、Temra细胞(CD45RA⁺、CCR7^-)、CD4⁺：CD8⁺T细胞比率、及血清TNF-α的组的老化衰弱标志物。

在一些实施方式中，当分离的同种异体间充质干细胞群足以增加受试者中CD4⁺：CD8⁺T细胞的比率时，证明治疗是有效的，诸如：与施用分离的同种异体间充质干细胞群之前的CD4⁺：CD8⁺T细胞的比率相比，使该比率增加为至少二倍、三倍、四倍、五倍、或六倍，即，CD4⁺：CD8⁺T细胞的比率增加至少100％、200％、300％、400％、或500％。

在一些实施方式中，当分离的同种异体间充质干细胞群足以增加受试者中转换的记忆B细胞(CD19⁺、CD27^高、IgD^-)的数目时，证明治疗是有效的，诸如：与施用所述分离的同种异体间充质干细胞群之前的转换的记忆B细胞的数目相比，使该数目增加为至少二倍、三倍、四倍、或五倍，即，转换的记忆B细胞(CD19⁺、CD27^高、IgD^-)的数目增加至少100％、200％、300％、或400％。在其他实施方式中，与施用所述分离的同种异体间充质干细胞群之前的转换的记忆B细胞的数目相比，此B细胞的数目增加至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％。

在一些实施方式中，当分离的同种异体间充质干细胞群足以减少受试者中表达细胞内TNF-α的B细胞的数目时，证明治疗是有效的，诸如：与施用所述分离的同种异体间充质干细胞群之前的此种B细胞的数目相比，以至少二倍、三倍、四倍、五倍或六倍使该数目减少。在其他实施方式中，与施用所述分离的同种异体间充质干细胞群之前的表达细胞内TNF-α的B细胞的数目相比，此B细胞的数目减少至少10％、20％、30％、40％、50％、或60％。

在一些实施方式中，当分离的同种异体间充质干细胞群足以减少受试者中衰竭性B细胞(CD19⁺、CD27^-、IgD^-)的数目时，证明治疗是有效的，诸如：与施用所述分离的同种异体间充质干细胞群之前的衰竭性B细胞的数目相比，以至少二倍或三倍使该数目减少。在其他实施方式中，与施用所述分离的同种异体间充质干细胞群之前的衰竭性B细胞的数目相比，此B细胞的数目减少至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、或50％。

在一些实施方式中，当分离的同种异体间充质干细胞群足以减少受试者中早期活化T细胞(CD3⁺、CD69⁺)的数目时，证明治疗是有效的，诸如：与施用所述分离的同种异体间充质干细胞群之前的早期活化T细胞的数目相比，以至少二倍或三倍使该数目减少。在其他实施方式中，与施用所述分离的同种异体间充质干细胞群之前的早期活化T细胞的数目相比，此T细胞的数目减少至少10％、20％、30％、40％、或50％。

在一些实施例中，当分离的同种异体间充质干细胞群足以减少受试者中慢性活化T细胞(CD3⁺、CD25⁺)的数目时，证明治疗是有效的，诸如：与施用所述分离的同种异体间充质干细胞群之前的慢性活化T细胞的数目相比，以至少二倍或三倍使该数目减少。在其他实施方式中，与施用所述分离的同种异体间充质干细胞群之前的慢性活化T细胞的数目相比，此T细胞的数目减少至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％。

在一些实施方式中，当分离的同种异体间充质干细胞群足以减少受试者中Temra细胞(CD45RA⁺、CCR7^-)的数目时，证明治疗是有效的，诸如：与施用所述分离的同种异体间充质干细胞群之前的Temra细胞的数目相比，以至少二倍或三倍使该数目减少。在其他实施方式中，与施用所述分离的同种异体间充质干细胞群之前的Temra细胞的数目相比，此Temra细胞的数目减少至少10％、20％、30％、40％、或50％。

在一些实施方式中，当分离的同种异体间充质干细胞群足以降低受试者血清样本中的TNF-α浓度时，证明治疗是有效的，诸如：与施用所述分离的同种异体间充质干细胞群之前的TNF-α浓度相比，以至少二倍或三倍使该TNF-α浓度降低。在其他实施方式中，与施用所述分离的同种异体间充质干细胞群之前的TNF-α浓度相比，该TNF-α浓度降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或90％。

“施用”组合物可通过口服给药、注射、输注、非肠道、静脉内、黏膜、舌下、肌内、皮内、鼻内、腹腔内、动脉内、皮下吸收、或通过与其他已知技术结合的任何方法实现。在本发明的一个实施方式中，分离的同种异体间充质干细胞群为全身性地施用的。在本发明的另一实施方式中，分离的同种异体间充质干细胞群通过输注或直接注射施用的。在本发明的一实施方式中，分离的同种异体间充质干细胞群是肌内、静脉内、动脉内、腹腔内、皮下、皮内、口服、心内膜、或鼻内施用的。在进一步的实施方式中，分离的同种异体间充质干细胞群是肌肉施用的。在进一步的实施方式中，分离的同种异体间充质干细胞群是静脉内施用的。

如本文使用的术语“受试者”包括但不限于人类和非人类脊椎动物，诸如野生动物、家养动物、及农场动物。在一些实施方式中，该术语指人类，诸如≥65岁的老年人、或60-95岁的老年人。在一些实施方式中，人类受试者表现老化衰弱综合征。在一些实施方式中，人类受试者表现炎性衰老。

术语“同种异体”意指与成为“受体宿主”的动物具有相同的动物物种但在一个或多个基因座上基因不同的细胞。这通常应用于从一动物移植至相同物种的另一不同动物的细胞。

如本文所使用，术语“需要其”表示受试者已被确认需要特定的方法或治疗。在一些实施方式中，可通过任何诊断手段加以确认。在本文描述的任一种方法和治疗中，受试者可以是需要其的。在一些实施方式中，受试者处在流行特定疾病、病症或症状的环境中或将前往流行特定疾病、病症或症状的环境。

细胞在本文中被称为对于某些标志为阳性的或阴性的。举例而言，细胞对于CD45可为阴性的，其也可被称为CD45^-。上标符号“-”意指细胞对于与该上标关联的标志物是阴性的。相反地，具有“+”的标志物意指细胞对于该标志物是阳性的。举例而言，被称为“CD8⁺”的细胞对于CD8是阳性的。“+”还可用于引用标志物为阳性。“-”还可用于引用标志物为阴性。

如本文所使用，术语“干细胞”意指在某些条件下具有长时间自我繁殖能力、或在成人干细胞的情况下在有机体的整个生命期间具有自我繁殖能力的、来自胚胎、胎儿、或成人的细胞。其还可产生组成人体组织及器官的特化细胞。

间充质干细胞是尤其在骨髓、血液、真皮、及骨膜中发现的、能够取决于来自诸如细胞因子的生物活性因子的多种影响而分化成特定类型的间充质或***(即，支撑特定部分的身体的组织；特别是脂肪组织、骨组织、软骨组织、弹性组织、及纤维***)的成形性多能性胚细胞。

分离及/或纯化间充质干细胞的某些方法已在本文描述且在此技术领域是已知的。在一些实施方式中，间充质干细胞分离自成人的骨髓。在一些实施方式中，细胞通过密度梯度以消除不期望的细胞类型。细胞可在适当的基质中平板接种(plate)及培养。在一些实施例中，将细胞培养至少一天或约三至约七天，并移除非贴壁细胞。贴壁细胞可然后被平板接种及扩增。

用于分离及培养干细胞的其他方法也是已知的。胎盘是间充质干细胞的极佳可容易获得的来源。此外，间充质干细胞可源自脂肪组织，且推测骨髓基质细胞存在于其他组织中。虽然在成人干细胞可源自的器官中有显著的定性及定量差异，但细胞间的初始差异可相对浅显且可由它们所表现的相似的可塑性范围被平衡。

提供均质的人类间充质干细胞组合物作为所有间充质细胞谱系的祖细胞。间充质干细胞由特定的细胞表面标志物被识别，所述特定的细胞表面标志物被独特的单克隆抗体识别。均质间充质干细胞组合物由贴壁骨髓细胞或骨膜细胞的阳性选择获得，所述贴壁骨髓细胞或骨膜细胞没有与造血或分化的间充质细胞相关的标志物。这些分离的间充质细胞群显示仅与间充质干细胞相关的表位(epitopic)特征，具有在培养中再生的能力而无分化，且当在体外诱导或在体内放置于发炎部位时具有分化为特定间充质谱系的能力。

为了获得用于本文所公开的组合物、方法、及试剂盒的人类间充质干细胞，将多能性间充质干细胞与骨髓或其他间充质干细胞来源中的其他细胞分离。骨髓细胞可获自髂嵴、股骨、胫骨、脊柱、肋骨、或其他髓腔。人类间充质干细胞的其他空间包括胚胎卵黄囊、胎盘、脐带、胎儿和青少年皮肤、及血液。

在一些实施方式中，人类间充质干细胞由不存在标志物而鉴别。举例而言，可用于本发明的人类间充质干细胞包括对STRO-1呈阴性及/或对CD45呈阴性的那些。类似地，可用于本发明的人类间充质干细胞包括不表达纤维母细胞表面标志物或不具有纤维母细胞形态的人类间充质干细胞。

增强免疫反应的方法

如上所述，本发明关于增强受试者的细胞免疫反应或体液免疫反应的方法，包括对受试者施用治疗有效量的分离的人类间充质干细胞群。在本发明的一些实施方式中，间充质干细胞不是基因操作的。在本发明的一些实施方式中，间充质干细胞从人类供体获得，且其中在分离的人类间充质干细胞群施用之前，不采用人类供体对受试者的MHC匹配步骤。

用于本发明的组合物可使用任何合适的方法配制。使用制药领域的常规方法，用标准药学上可接受的载体和/或赋形剂可进行细胞的配制。制剂的准确性质将取决于数个因素，包括待施用的细胞及期望的施用途径。制剂的合适类型在Remington'sPharmaceutical Sciences,19^th Edition,Mack Publishing Company,EasternPennsylvania,USA中充分地描述。

组合物可与生理上可接受的载体或稀释剂一起制备。通常，这样的组合物被制备成细胞的液体悬浮液。细胞可与药学上可接受且与所述活性成分相容的赋形剂混合。合适的赋形剂是例如水、盐水、葡萄糖、甘油等及其组合。

此外，若需要，本发明的药物组成物可含有少量辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、和/或增加效果的佐剂。在本发明的一实施方式中，佐剂包括人血清白蛋白(HSA)。

一种合适的载体或稀释剂是PlasmaLyte A^TM。这是用于静脉施用的无菌、无热原等张溶液。每100mL含有526mg氯化钠USP(NaCl)、502mg葡萄糖酸钠(C₆H₁₁NaO₇)、368mg三水醋酸钠USP(C₂H₃NaO₂₃H₂O)、37mg氯化钾USP(KCl)、及30mg氯化镁USP(MgCl₂6H₂O)。其不含抗菌剂。用氢氧化钠调整pH。pH为7.4(6.5至8.0)。

在本发明的一实施方式中，间充质干细胞不是基因操作的。在本发明的另一实施方式中，间充质干细胞是冻存的(cryopreserved)。举例而言，间充质干细胞可悬浮在由添加2％HSA和5％DMSO的

(6％羟乙基淀粉于0.9％氯化钠中)所组成的冷冻保护剂(cryoprotectant)中，且接着等分入冻存容器中，用于放在汽相氮冷冻机中。在另一实施方式中，间充质干细胞可以提供在添加1％HSA的PlasmaLyte A^TM中。

实施例

实施例1

慢性非缺血性扩张型心肌病的治疗

简言之，将37名患者随机化以于1：1的比率接受同种异体或自体人类间充质干细胞。患者于2011年12月及2015年7月之间在迈阿密大学医院招募。患者(年龄：55.8±11.2；32％为女性)藉由NOGA导管在十个左心室部位通过心内膜干细胞注射(TESI)接受人类间充质干细胞(1亿个)。受治疗的患者在基线、30天、3个月、6个月、及12个月针对免疫生物标志物被评估。

患者群

患者适格性确认NIDCM的诊断之后确定，其具有小于40％的EF，以及左心室舒张末期直径在男性受试者中大于5.9cm和在女性受试者中大于5.6cm或者左心室舒张末期体积指数>125mL/m²。37名患者以1：1的比率随机分配自体人类间充质干细胞(hMSC)或同种异体hMSC。34名患者接受研究注射；16及18名患者分别接受自体hMSC及同种异体hMSC。三名患者未接受研究注射。一位患者在治疗前撤回同意。另一名患者被招募，但由于自动植入式心律整流去颤器置放而未接受治疗(n＝1)，而1名患者在治疗前死亡(n＝1)。注射参与者的平均年龄为55.8±11.2岁，29％为女性，且35％为西班牙裔。TESI前的NIDCM诊断的平均年数对于接受同种异体的患者为6.1±6.2年，而对于接受自体的患者为6.9±7.3年(组间的p＝0.5)。50％的患者有NYHA II级症状，平均基线总体EF为26.5±9.64％，平均6MWT为422±86.8 M，且中位基线MLHFQ分数为36(IQR18.0、64.0)。

研究程序及时间表

基线评估包括化学和血液学实验室、超声心动图、及胸部、腹部、和骨盆计算机断层扫描。

用于细胞治疗的人类间充质干细胞(hMSC)

所有同种异体及自体人类间充质干细胞系都在迈阿密大学ISCI制造。参见例如Golpanian,S.et al.,Physiol.Rev.96：1127-68(2016)及Mushtaq,M.et al.,J.Cardio.Trans.Res.7：769-80(2014)。同种异体人类间充质干细胞系源自平均年龄为25.4±3.3岁的高加索男性供体，且在TESI时存活率为80至90％。自体hMSC系来自平均年龄为58.0±9.9岁的11名男性、及平均年龄55.0±12.4岁的6名女性。

心内膜干细胞注射

注射部位选择为优先考虑TESI程序的安全性及在整个可达心肌区域分布部位。部位选择的考虑包括避免心室尖端、及在针延伸之前导管稳定性的优化。

免疫监控

计算的群体反应性抗体(cPRA，calculated panel reactive antibodies)在基线及在六个月时使用Luminex 200被测量。血清TNF-α是使用人类TNF-αELISA高灵敏度试剂盒(eBiosciences)测量。针对以下染色淋巴细胞：T细胞活化标志物。晚期/衰竭性T细胞、B细胞子集(转换的记忆B细胞及晚期/衰竭性B细胞)、和藉由B细胞的TNF-α。所有样本均使用LSR-Fortessa-HTS分析仪(BD Pharmigen)获得及使用FlowJo V10软件分析，即，所有淋巴细胞群均由流式细胞术评估且表示为门内细胞百分比(在CD19⁺上设门的B细胞参数及在CD3⁺上设门的T细胞参数)。

cPRA结果显示67％的同种异体接受者及92％的自体接受者无反应至低cPRA(0-20％cPRA)。27％的同种异体接受者及8％的自体接受者具有中等程度的cPRA(21-79％cPRA)，且接受同种异体MSC的一受试者(7％)具有高cPRA反应(+80％cPRA)。

在两组中，升高的TNF-α基线水平从基线至6个月降低(同种异体：-10.6±1.6pg/ml，p<0.0001；自体：-6.8±1.4pg/ml，p<0.0001，表1；组间的p＝0.05)。在两组中，Temra T细胞(衰竭性T细胞表型)均减少，其中在同种异体中有较大的下降(同种异体：-15.9±5.4％，p<0.0001；自体：-9.3±3.3％，p<0.0001，表1；组间的p＝0.0111；表1)。在基线的被抑制的转换的记忆B细胞％(针对抗体反应的预测性生物标志物)在两组中在6个月时均显著增加，其中在同种异体中有更大的改善(同种异体：+10.2±4.9％，p<0.0001相对于自体：+4.3±3.9％，p＝0.0014，组间的p<0.0001；表1)。最后，B23细胞中的细胞内TNF-α表现在两组中在6个月时相对于基线也都减少(同种异体：-11.2±3.3％，p<0.0001；自体：-8.5±3.0％，p<0.0001；组间的p＝0.174；表1)。相比之下，晚期/衰竭性B细胞在两组中显著降低(同种异体：-5.4±1.03％，p<0.0001；自体：-5.9±2.5％，p＝0.003；组间差异，p＝0.57；表1)。早期T细胞活化(同种异体：-5.57±1.03％，p<0.0001；自体：-2.92±1.5％，p＝0.02；组间的p＝0.08；表1)在两组中均降至类似的程度。但在任一组中，晚期/慢性T细胞活化都没有显著降低(同种异体：-2.3±1.3％，p＝0.4，及自体：-3.4±2.7％，p＝0.7)。

表1人类间充质干细胞对细胞免疫及体液免疫在6个月时的效果

^*表示组内的p≤0.05；^**表示组内的p≤0.001；

表示组间的p≤0.5；

表示组间的p≤0.001。

实施例2

老化衰弱综合征的治疗-研究1

将达到加拿大健康与老化研究(CSHA)针对衰弱的纳入/排除标准的30名60岁或以上的受试者随机化。10位受试者接受1亿个MSC，10位受试者接受2亿个MSC，及10位受试者接受安慰剂。针对安全性和疗效追踪受试者一年。评估至少包括以下：炎性生物标志物研究以及免疫效应审查。图1是符合关系图。图2提供基线患者特征。图3-7说明同种异体人类MSC对免疫生物标志物的影响。

图3显示接受人类MSC给药的受试者中降低TNF-α。早期及晚期/慢性T细胞活化两者在同种异体MSC处理之后降低。图4显示接受人类MSC施用的受试者中表达CD69的早期活化T细胞减少。图5显示施用人类MSC的受试者中表达CD25的慢性/晚期活化T细胞数目的减少。图7显示施用人类MSC的受试者中CD4⁺/CD8⁺T细胞比率的增加。

实施例3

老化衰弱综合征的治疗-研究2

十五名年老受试者包括在开放式研究中，且在两次分开的输注中施用人类间充质干细胞。针对多种免疫生物标志物的变化评估受试者，以判定对注射人类间充质干细胞的响应。这些免疫生物标志物包括血清中的衰竭性B细胞(CD19⁺、CD27^-、IgD^-)的水平、转换的记忆B细胞(CD19⁺、CD27^高、IgD^-)的水平、表达细胞内TNF-α的B细胞的水平、早期活化T细胞(CD3⁺、CD69⁺)的水平、慢性活化T细胞(CD3⁺、CD25⁺)的水平、Temra细胞(CD45RA⁺、CCR7^-)的水平、CD4⁺：CD8⁺T细胞比率、及TNF-α浓度。受试者在第一次注射之后的6个月后、及在第二次注射之后的1、3、和6个月后被评估。表2-9中提供针对上述讨论的各免疫生物标志物的测量值。表2-9中还提供分配给在不同时间点在每位患者中所评估的各免疫生物标志物的分数，其指示在所测量的免疫生物标志物中是否观察到增加或减少。最后，表10中是包括不同时间点的各患者的总分数及患者间的平均值。如在表10的最后一行及图8中可观察的那样，免疫衰老分数在老化衰弱的受试者中在第一次注射人类间充质干细胞之后改善，且在第二次注射人类间充质干细胞之后继续维持在改善状态。

表2人类间充质干细胞对转换的记忆B细胞的影响

改善量表：没有改变＝0；改善>0≤1，倍数＝1；改善>1≤2，倍数＝2；改善>2≤3，倍数＝3；改善>3，倍数＝4；恶化>0≤1，倍数＝-1；恶化>1≤2，倍数＝-2；恶化>2≤3，倍数＝-3；以及恶化>3，倍数＝-4。

表3人类间充质干细胞对表达细胞内TNF-α的B细胞％的影响

表4人类间充质干细胞对衰竭性B细胞的影响

表5人类间充质干细胞对Temra细胞的影响

表6人类间充质干细胞对T细胞(CD69)早期活化的影响

表7人类间充质干细胞对T细胞(CD25)的晚期/慢性活化的影响

表8人类间充质干细胞对CD4⁺：CD8⁺T细胞的比率的影响

表9人类间充质干细胞对血清TNF-α浓度的影响

患者#	BL	6个月	6个月分数
				1	3.5	2.4	2
2	3.6	2.2	2
				3	2.8	2.3	2
4	2.8	0.9	2
				5	8	6.8	0
6	3.2	1.1	2
				7	3.5	0.14	2
8	7.3	0	2
				9	6.8	4.1	2
10	5.7	2.8	2
				11	6.3	2.7	2
12	4.1	2.2	2
				13	3.5	0.6	2
14	9.2	3.8	2
				15	6.3	1.2	2

表10患者的总免疫衰老分数