阅读说明：本技术 一种凝结芽孢杆菌jy69及其制备活菌型混合莓果浆的方法 (Bacillus coagulans JY69 and method for preparing viable bacteria type mixed berry pulp by using same ) 是由 赵景阳 于 2019-11-01 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种凝结芽孢杆菌JY69,其保藏号为CGMCC No.18454；已于2019年09月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。并公开了一种采用凝结芽孢杆菌JY69制备活性益生菌混合莓果浆的方法,所得果浆可在0～10℃下可以保存90天,而且益生菌可以存活状态到达肠道,这样可以分泌乳酸,改善肠道菌群,促进通便和提高免疫力的功效,活菌型混合莓果浆中还含有黑莓,蓝莓,树莓,桑葚果浆及保加利亚乳酸杆菌、嗜热链球菌、和双歧杆菌,还含有低聚异麦芽糖和低聚木糖两种益生元；营养丰富,无异味,口感细腻,酸甜适中,极大地满足对健康生活有较高追求的人的需要。(The invention discloses bacillus coagulans JY69 with the preservation number of CGMCC No. 18454; has been preserved in China general microbiological culture Collection center on the 09.02 th month in 2019. The obtained fruit pulp can be stored for 90 days at 0-10 ℃, and the probiotics can reach the intestinal tract in a survival state, so that lactic acid can be secreted, the intestinal flora can be improved, the effects of relaxing the bowels and improving the immunity can be promoted, the live bacteria type mixed berry fruit pulp also contains blackberry, blueberry, raspberry, mulberry fruit pulp, lactobacillus bulgaricus, streptococcus thermophilus and bifidobacterium, and also contains two prebiotics of isomaltooligosaccharide and xylooligosaccharide; rich nutrition, no peculiar smell, fine taste and moderate sweet and sour taste, and greatly meets the requirements of people who have higher pursuit for healthy life.)

一种凝结芽孢杆菌JY69及其制备活菌型混合莓果浆的方法

技术领域

本发明涉及一种凝结芽孢杆菌JY69及其制备活菌型混合莓果浆的方法。

背景技术

活菌型益生菌发酵产品的保质期较短(通常在30日以内)，发酵用活性益生菌的的耐酸性低，且在产品中的存活率较低。通常需要采用冷藏保存的方式来延长产品保质期；但由于所使用的菌株不耐热，不能对发酵液进行杀菌，产品保质期很难超过30日。当前还未见以混合莓为基料添加耐热性菌株的活性果浆产品。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术中活菌型益生菌发酵产品由于菌株不耐热导致的保质期较短的缺陷，提供一种凝结芽孢杆菌JY69及其制备活菌型混合莓果浆的方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

一种凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans JY69,其保藏号为CGMCC No.18454；已于2019年09月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3 号。该凝结芽孢杆菌Bacillus coagulansJY69呈杆状，革兰氏染色阳性，接触酶阴性。

凝结芽孢杆菌Bacillus coagulansJY69不但可以存活状态到达肠道，在肠道内分泌乳酸，改善肠道菌群，促进通便和提高免疫力的功效，还拥有较强的耐热性(90度15分钟)，在冷藏(0～10度)环境下产品保质期可达到90天；因此可将凝结芽孢杆菌Bacilluscoagulans JY69应用于发酵饮品的制备中。特别是利用凝结芽孢杆菌JY69发酵生产活性益生菌混合果浆。

一种活性益生菌混合莓果浆的制备方法，包括以下步骤：

S1、制备基料果浆，将基料果浆进行杀菌冷却；

S2、制备发酵原液：采用脱脂奶粉、全脂奶粉和果葡糖浆调制发酵原液，然后杀菌冷却；比如发酵原液由6～10％脱脂奶粉、3～5％全脂奶粉和2～4％果葡糖浆组成。优先的，调配含8％脱脂奶粉，4％全脂奶粉和3％果葡糖浆的发酵原液。

S3、将凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans JY69、保加利亚乳酸杆菌Lactobacillus bulgaricus、嗜热链球菌Storeptococcus thermophillus和双歧杆菌Bifidobacterium longum的发酵液接种到发酵原液中，搅拌均匀，放入发酵罐中发酵凝固为止，降温后将所得发酵基料保存待用；优选的，保存的温度为5～10℃。

S4、将S1中的基料果浆与S3中的发酵基料按比例混合，然后均质。优选的，将基料果浆与发酵基料按照6～10：2的比例混合，更优选的，基料果浆与发酵基料按照6～10：2的比例为8:2。

进一步的，S3中凝结芽孢杆菌JY69、保加利亚乳酸杆菌、嗜热链球菌和双歧杆菌的比例为2～5：2:2：1。优选的凝结芽孢杆菌JY69、保加利亚乳酸杆菌、嗜热链球菌和双歧杆菌的比例为3：2：2：1。

进一步的，基料果浆为黑莓、蓝莓、树莓和桑葚果浆按照2～4： 1～3：1～3：1的比例混合。优选的黑莓、蓝莓、树莓和桑葚果浆按照3：2：2：1的比例混合。其中黑莓被誉为“生命之果”，含有18 中氨基酸(包括人体8种必需氨基酸)以及对人体至关重要的6种矿物质元素(钾，钙，钠，镁，锌，铁)，在机体能量供给以及新陈代谢方面都发挥着重要作用。蓝莓被称为“浆果之王”，富含花青素，黄酮，酚酸以及人体所需的微量元素，在抗衰老和保护视力，改善记忆力，保护心血管方面的功效深得人们的认可。树莓有“黄金水果”的美誉，含有相当丰富的维生素A，C，钙，钾，镁等营养元素和大量纤维，拥有补肝益肾，名目乌发，调经养颜及收敛止血的功效。桑葚味甘性寒，有滋阴补血，生津润肠的功效。

进一步的，S3中发酵的温度为36～45℃。优选的发酵温度为 40℃，进行恒温发酵。

优选的，在均质前，加入0.5～1％的低聚异麦芽糖和低聚木糖两种益生元，刺激益生菌生长与活性，从而改善人体肠道健康。

本发明所达到的有益效果是：本发明的凝结芽孢杆菌Bacillus coagulansJY69不但可以存活状态到达肠道，在肠道内分泌乳酸，改善肠道菌群，促进通便和提高免疫力的功效，还拥有较强的耐热性(90 度15分钟)，在冷藏(0～10度)环境下产品保质期可达到90天；在本发明制备的活性益生菌混合莓果浆中富集了黑莓、蓝莓、树莓和桑葚富含的中氨基酸、矿物质元素、花青素、黄酮，酚酸、维生素等多种营养成分，同时添加了低聚异麦芽糖和低聚木糖两种益生元，作为益生菌的食物，起到刺激益生菌生长与活性，从而改善人体肠道健康；凝结芽孢杆菌Bacillus coagulansJY69可以延长保质期至90天；保加利亚乳酸杆菌和嗜热链球菌拥有较高的耐酸性，可以存活状态到达小肠；双歧杆菌能以存活状态到达大肠，起到增加有益菌，减少有害菌和有害物质，增强免疫力，预防疾病的作用。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是Bacillus coagulans JY69的系统发育树。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例

凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans JY69的分离方法

取我国北方传统发酵豆酱1克，放入灭菌试管中，接种于10毫升牛乳中，置于100℃恒温水域中杀菌5分钟。再用灭菌接种环挑取划线接种于含有10ppm放线菌酮和10ppm硫酸粘菌素的BL琼脂培养基中，将其放入厌氧培养罐中，置于42℃条件下培养48小时，形成菌落后，用接种环挑取菌落，接种于MRS培养液中，置于42℃条件下培养24小时，待菌株生长好后，再次划线接种于BL琼脂培养基中，42°下培养48小时，记录观察菌落形态和革兰氏染色细胞形态特征，并进行过氧化酶实验，分离出在所述试验中呈阴性的杆菌，所述杆菌为凝结芽孢杆菌。将所述凝结芽孢杆菌进一步纯化培养，并进行低温保存。

凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans JY69的凝乳性试验结果

与对照相比，在42℃培养24小时后培养液的pH值达到3.5，该菌株分泌乳酸，具备凝乳作用。

凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans JY69的耐热性试验结果

与对照相比，该菌株在100℃ 10分钟杀菌后仍有活菌检出。

凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans JY69的鉴定方法

一、生理生化鉴定：参照伯爵氏细菌鉴定系统，对被试菌体的形态以及生理生化特性进行鉴定，采用梅里埃API 50CHL鉴定试剂盒对其生理生化特性进行鉴定。

二.16S rRNA序列测定：

1、采用的试剂：Tag酶，dNTP，DNAmarker，溶菌酶，蛋白酶K， CTAB，SDS，GoldView。

2、PCR引物：16S rRNA序列扩增引物，引物序列如下： L1:5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；L2:5’-CGGCTACCTTGTTACGACTT-3’

3、菌体培养：将送检样品在平板上划线分离，培养24-30h后挑取单菌落接种到20ml液体培养基中，42度200rpm培养24-30小时。

4、基因组DNA提取：基因组DNA提取参照文献。

用SDS-蛋白酶K裂解，十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)沉淀细胞碎片和多糖，再用异丙醇沉淀来提取总DAN。

1)、取单菌落接种于5ml相应的培养基中，在37℃下培养24h：

2)、取1.0ml菌液于1.5ml离心管中，13，000rpm离心2min，弃上清；

3)、沉淀重悬于1.0ml0.85％NaCl中。

4)、室温13，000rpm离心2min，弃上清；

5)、沉淀重悬于0.55ml 1*TE中；

6)、加0.017ml溶菌酶(35mg/ml)，37℃温育30min；

7)、0.1ml蛋白酶K(20mg/ml)37℃温育30min；

8)、加0.03ml 10％SDS，37℃温育30min；

9)、加0.1ml NaCl充分混匀；

10)、加0.08ml CTAB/NaCl溶液，混均，65℃水浴10min；

11)、加等体积(0.7-0.8ml)氯仿/异戊醇(24：1)，轻轻振荡混均；

12)、室温，13，000rpm离心10min；

13)、将上清液转移到一新1.5ml离心管中，加入等体积酚/氯仿 /异戊醇(25：24：1)轻轻振荡混均；

14)、重复第12)步；

15)、将上清液转移到一新1.5ml离心管中，加入等体积氯仿/ 异戊醇(24：1)轻轻振荡混均；

16)、重复第12步；

17)、将上清液转移到一新1.5ml离心管中，加入0.6体积，异戊醇，混均后4℃静置30min；

18)、20℃ 13，000rpm离心7min；

19)、弃上清，加0.5ml70％乙醇，轻轻颠倒数次(洗盐)；

20)、4℃ 15，000rpm离心7min；

21)、重复洗盐两次；

22)、倒置离心管，干燥DNA沉淀7min。DAN沉淀溶于0.1ml 1*TE 缓冲液，-20℃保存备用。

5、PCR扩增

反应体系为0.1ml；

Taq(5U/μl)0.8μl；10×PCR Buffer(Mg²⁺Plus)10μl；dNTP Mixture(2.5mM/each)8μl；模板DNA 2.5ng；引物27F(10μmol/L) 2μl,引物1541(10μmol/L)2μl；ddH₂O补足到100μl.

PCR反应条件；

94℃ for 4min；94℃ for 1mi，；58℃ for 4min，72℃ for 1min30sec，30cycles；

72℃ for 5min；4℃ save，end。

6、电泳检测

用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA，用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

显色剂为GoldView。

7、序列测定

纯化后的PCR产物采用ABI3730基因测序仪测序。测序工作由上海生工技术有限公司完成。

8、序列分析与系统树的构建

采用序列图谱软件Chromas，参照正，反向序列图谱，对序列人工校对。从GenBank核酸序列数据库中下载戈登氏菌属相关模式菌株的16S rRNA基因序列，与所测的RR和RY菌株序列一起，用Clustal X软件进行比对(alignment)；然后利用MEGA3.1生物学软件构建系统发育树，采用Neighbor-Joining法进行系统发育分析，并进行1000 次重复的Bootstraps统计学检验。

三结果与分析

1.生理生化鉴定结果

经生理生化初步鉴定，NY68菌株呈杆状，革兰氏染色阳性，接触酶阴性，能在45℃和85℃条件下生长，能利用葡萄糖和果糖，初步鉴定为凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)其生理生化特征见表1.

表1其生理生化特征

注：+表示阳性；-表示阴性；w表示轻微利用

2.基于16S rRNA基因的分子生物学鉴定

2.1 16S rRNA基因测序结果

将JY69菌株的PCR反应产物送至上海生工技术公司测序；

2.2 BLAST同源性比较结果

将所得16S rRNA测得序列，在NCBI网站中进行同源性搜索，JY69 菌株与

Bacillus coagulans 16S rRNA相似度高达100％。

从Genbank中选择了菌株的16S rRNA基因序列，用Clustal X 软件进行序列比对(alignment)，然后利用MEGA3.1生物学软件构建系统发育树，所构建的系统发育树见图1。JY69与Bacillus coagulans BC01亲缘关系最近，因此，进一步证明，JY69菌株为Bacilluscoagulans。将其命名为Bacillus coagulans JY69。

3、电泳检测

一种活性益生菌混合莓果浆的制造方法，它包括以下步骤：

S1、制备基料果浆：将黑莓，蓝莓，树莓和桑葚果浆按照3：2： 2：1的比例混合，然后杀菌冷却；

S2、制备发酵原液：调配含8％脱脂奶粉，4％全脂奶粉和3％果葡糖浆的发酵原液，然后杀菌冷却；

S3、将凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans JY69，保加利亚乳酸杆菌Lactobacillus bulgaricus，嗜热链球菌Storeptococcus thermophillus和双歧杆菌Bifidobacterium longum接种到发酵原液中，Bacillus coagulans JY69，保加利亚乳酸杆菌Lactobacillus bulgaricus，嗜热链球菌Storeptococcus thermophillus和双歧杆菌Bifidobacterium longum的比例关系为3：2：2：1，搅拌均匀；放入发酵罐中40℃发酵凝固为止，降温后保存待用；

S4、将S1中的基料果浆与S3中的发酵基料按照8：2的比例混合，然后均质。

本发明制备的活性益生菌混合莓果浆的在0～10℃下可以保存 90天，而且益生菌可以存活状态到达肠道，这样可以分泌乳酸，改善肠道菌群，促进通便和提高免疫力的功效，活菌型混合莓果浆中还含有黑莓，蓝莓，树莓，桑葚果浆，4种益生菌凝结芽孢杆菌JY69、保加利亚乳酸杆菌、嗜热链球菌、和双歧杆菌，还含有低聚异麦芽糖和低聚木糖两种益生元；营养丰富，无异味，口感细腻，酸甜适中，极大地满足对健康生活有较高追求的人的需要。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。