阅读说明：本技术 欧乌碱和12-表-欧乌碱的分离方法 (Method for separating ouwu alkali and 12-epi-ouwu alkali ) 是由 张帆 韩佳 于 2019-07-03 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种欧乌碱和12-表-欧乌碱的分离方法,属于医药领域。其包括：将含有欧乌碱和12-表-欧乌碱的混合物C上样至氨基色谱柱,以正己烷－二氯甲烷－甲醇三元混合溶剂为洗脱剂,氨基色谱填料与混合物C的质量比为16-24：1,分离得到欧乌碱和12-表-欧乌碱。该方法无需使用高精度的分离设备(例如HPLC),仅通过柱分离就能够实现欧乌碱与12-表-欧乌碱这两个性质极为相似的同分异构体的有效分离,方法简单有效,可重现性强。(The invention provides a separation method of ouwu alkali and 12-epi-ouwu alkali, belonging to the field of medicine. It includes: loading a mixture C containing eudrine and 12-epi-eudrine to an amino chromatographic column, taking a ternary mixed solvent of n-hexane-dichloromethane-methanol as an eluent, wherein the mass ratio of an amino chromatographic filler to the mixture C is 16-24: 1, separating to obtain the ouwu alkali and 12-epi-ouwu alkali. The method can realize effective separation of two isomers of the eudragit and 12-epi-eudragit with extremely similar properties by only column separation without using high-precision separation equipment (such as HPLC), and is simple and effective and has strong reproducibility.)

欧乌碱和12-表-欧乌碱的分离方法

技术领域

本发明涉及医药领域，具体而言，涉及一种欧乌碱和12-表-欧 乌碱的分离方法。

背景技术

目前，对于植物药的开发利用首先是对其中的具有相关疗效的有 效化学成分进行提取和分离，并纯化得到有一定治疗效果的单一成 分。其中，生物碱是一类具有显著生理活性的含氮有机化合物，许多 药用植物中均富含生物碱，是中药的重要组部分。生物碱有效成分的 分离与纯化是中药开发的难点与关键。

多根乌头(Aconitum karakolicum Rap.)为毛茛科乌头属 (Aconitum L.)植物，分布于我国新疆伊犁地区海拔2000～3000m 的山坡草地，分布集中，主要用于治疗神经痛、心绞痛、肾炎等疾病。 其中，多根乌头中含有丰富的生物碱，且欧乌碱(napelline)和12-表-欧乌碱(12-epi-napelline)含量较高。

然而，欧乌碱和12-表-欧乌碱互为同分异构体，分子式均为 C₂₂H₃₃NO₃，均属于C-20型二萜生物碱。两者的不同之处仅在于欧乌 碱12位羟基的构型为α-型，而12-表-欧乌碱12位羟基的构型为β -型，两者的化学结构如下式所示。

由于欧乌碱和12-表-欧乌碱之间的结构差异非常小，使得这两 者的化学性质极为相似，难以采用常规的柱分离和纯化方法将其二者 分离。鉴于此，特提出本申请。

发明内容

本发明的目的在于提供一种欧乌碱和12-表-欧乌碱的分离方 法，该方法无需使用高精度的分离设备(例如HPLC)，仅通过柱分离 就能够实现欧乌碱与12-表-欧乌碱这两个性质极为相似的同分异构 体的有效分离，方法简单有效，可重现性强。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种欧乌碱和12-表-欧乌碱的分离方法，其包括：

将含有欧乌碱和12-表-欧乌碱的混合物C上样至氨基色谱柱， 以正己烷－二氯甲烷－甲醇三元混合溶剂为洗脱剂，氨基色谱填料与 混合物C的质量比为16-24：1，分离得到欧乌碱和12-表-欧乌碱。

进一步地，在本发明较佳的实施方式中，上述在采用氨基色谱柱 分离混合物C的过程中，正己烷、二氯甲烷和甲醇三者的体积比依次 为：90:5:5、80:10:10、70:15:15、60:25:15、50:25:25、40:30:30， 每个体积比的正己烷－二氯甲烷－甲醇三元混合溶剂分别洗脱 1.5-2.5个柱体积。

进一步地，在本发明较佳的实施方式中，收集体积比为80:10:10 的正己烷－二氯甲烷－甲醇三元混合溶剂洗脱的组分，得到欧乌碱； 收集体积比为50:25:25的正己烷－二氯甲烷－甲醇三元混合溶剂洗 脱的组分，得到12-表-欧乌碱。

进一步地，在本发明较佳的实施方式中，上述混合物C的分离方 法包括：

采用酸提碱沉法提取乌头粉末，得到乌头总碱A；

将乌头总碱A溶于pH值为3-5的醇溶液中，将所得溶液通过阳 离子交换树脂色谱柱，依次用水和氨水溶液进行洗脱后，将阳离子交 换树脂色谱柱中的树脂取出，并采用加热回流提取法进行提取，得到 乌头总生物碱B；

采用反相色谱C18柱分离乌头总生物碱B，得到混合物C。

进一步地，在本发明较佳的实施方式中，上述氨水溶液的浓度为 5-20％。

进一步地，在本发明较佳的实施方式中，上述阳离子交换树脂为 强酸型聚苯乙烯阳离子交换树脂。

进一步地，在本发明较佳的实施方式中，上述加热回流提取法的 提取溶剂为70-90％的乙醇；提取温度为70-90℃；提取时间为2-4h。

进一步地，在本发明较佳的实施方式中，上述在采用反相色谱 C18柱分离乌头总生物碱B的过程中，洗脱剂为甲醇－水混合溶剂， 收集体积浓度为65-75％的甲醇洗脱部分，得到混合物C。

进一步地，在本发明较佳的实施方式中，上述洗脱剂甲醇－水混 合溶剂的体积浓度依次为：5-15％、25-35％、45-55％、65-75％和 85-95％。

进一步地，在本发明较佳的实施方式中，上述用酸提碱沉法提取 乌头粉末包括：

将pH值为2-3的醇溶液与乌头粉末混合，加热回流提取，将所 得提取物的pH值调节至9-10后，再用乙酸乙酯萃取，得到乌头总碱 A。

与现有技术相比，本发明的有益效果例如包括：

本发明提供的这种分离方法，以氨基色谱柱分离含有欧乌碱和 12-表-欧乌碱的混合物C，优化洗脱剂的溶剂组成，实现了欧乌碱与 12-表-欧乌碱这两个性质极为相似的同分异构体的有效分离，得到欧 乌碱与12-表-欧乌碱纯品。该方法无需使用高精度的分离设备(例 如HPLC)，方法简单有效，可重现性强。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领 域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限 制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造 商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通 过市售购买获得的常规产品。

目前，在现有技术中，从多根乌头中分离得到化学成分主要有柱 色谱分离和薄层色谱分离两种方法。对于欧乌碱的分离和纯化，绝大 多数的文献均采用的是酸碱提取和反复使用硅胶柱和反相C18柱进 行层析分离，最后分离得到12-表-欧乌碱。而有一些文献报道，利 用薄层色谱，对多根乌头的化学成分进行了分析，但在薄层板上也没 有检测到欧乌碱或12-表-欧乌碱的存在。

从已报道的文献看，从多根乌头中提取分离得到欧乌碱的方法， 不具备针对性。事实上，在植物成分的分离纯化上，所有类别(黄酮、 皂苷、萜、蒽醌、苯丙素、香豆素、生物碱等)都可以采用硅胶柱和 反相C18柱进行分离纯化，不具备特异性。所以，如果仅仅采用硅胶 柱和反相C18柱分离，往往得到多种类别的化学成分，这样在分离中 就显得物质并不集中，产率较低，并且具有偶然性。

本实施方式提供一种欧乌碱和12-表-欧乌碱的分离方法，该方 法旨在采用可靠有效的方法同时分离得到欧乌碱和12-表-欧乌碱。

该分离方法包括：

将含有欧乌碱和12-表-欧乌碱的混合物C上样至氨基色谱柱， 以正己烷－二氯甲烷－甲醇三元混合溶剂为洗脱剂，氨基色谱填料与 混合物C的质量比为16-24：1，分离得到欧乌碱和12-表-欧乌碱。

在该方法中，含有欧乌碱和12-表-欧乌碱的混合物C可通过柱 色谱分离方法得到，可采用本实施方式中公开的后续方法得到，也可 采用其它本领域技术人员常用的方法制备得到。

为了使氨基色谱柱对混合物C有较佳的分离效果，氨基色谱填料 与混合物C的质量比为16-24：1，优选地为18-22：1，更为优选地 为19-21：1。

其中，上述在采用氨基色谱柱分离混合物C的过程中，正己烷、 二氯甲烷和甲醇三者的体积比依次为：90:5:5、80:10:10、70:15:15、 60:25:15、50:25:25、40:30:30，每个体积比的正己烷－二氯甲烷－ 甲醇三元混合溶剂分别洗脱1.5-2.5个柱体积。

即，在氨基色谱柱的洗脱过程中，先用体积比为90:5:5的正己 烷－二氯甲烷－甲醇三元混合溶剂洗脱1.5-2.5个柱体积后，再用体 积比为80:10:10的正己烷－二氯甲烷－甲醇三元混合溶剂洗脱 1.5-2.5个柱体积，以此类推。

进一步地，收集体积比为80:10:10的正己烷－二氯甲烷－甲醇 三元混合溶剂洗脱的组分，得到欧乌碱；收集体积比为50:25:25的 正己烷－二氯甲烷－甲醇三元混合溶剂洗脱的组分，得到12-表-欧 乌碱。

其中，上述混合物C的分离方法包括：

步骤S1:采用酸提碱沉法提取乌头粉末，得到乌头总碱A；

其中，乌头粉末为将乌头干燥根粉碎后过20-40目筛所得。

进一步地，上述用酸提碱沉法提取乌头粉末包括：将pH值为2-3 的醇溶液与乌头粉末混合，加热回流提取，将所得提取物的pH值调 节至9-10后，再用乙酸乙酯萃取，得到乌头总碱A。

优选地，乌头粉末与醇溶液混合时的料液比为4-7：1，或者为 5-6：1。该醇溶液优选为70-95％的乙醇溶液，更为优选地为80-90％ 的乙醇溶液。

优选地，加热回流提取的温度为60-80℃，或者为65-75℃；时 间为5-10h，或者为6-9h，或者为7-9h。在加热回流提取期间，每 20-60min搅拌均匀一次。

优选地，将所得提取物用氨水调节pH值至9-10后，用0.7-1.3 倍体积的乙酸乙酯萃取；进一步优选地，用乙酸乙酯萃取2-4次。

步骤S2：将乌头总碱A溶于pH值为3-5的醇溶液中，将所得溶 液通过阳离子交换树脂色谱柱，依次用水和氨水溶液进行洗脱后，将 阳离子交换树脂色谱柱中的树脂取出，并采用加热回流提取法进行提 取，得到乌头总生物碱B。

在该步骤中，在采用酸溶碱沉的方法得到总碱性成分A之后，又 利用针对生物碱的阳离子交换树脂，进一步纯化获得了总生物碱成分 B(属于总碱性成分中的一部分)，去掉了其它碱性成分的杂质，进一 步得到纯化，更便于后期纯化。

优选地，将“乌头总碱A溶于pH值为3-5的醇溶液中”的过程 为：将乌头总碱A中，逐渐加入浓度为80-95％乙醇(pH值为2-3)， 直至整个溶液的pH值至4为止。

优选地，依次用水和氨水溶液进行洗脱阳离子交换树脂色谱柱的 过程包括：先用去离子水冲洗该色谱柱至中性，再用浓度为5-20％的 氨水溶液洗脱碱化该色谱柱。进一步优选地，所用氨水溶液的体积量 为树脂体积的0.5-2倍。

进一步地，上述氨水溶液的浓度为5-20％，或者为8-15％，或者 为10-13％。

进一步地，上述阳离子交换树脂为强酸型聚苯乙烯阳离子交换树 脂。优选地，上述阳离子交换树脂与乌头总碱A的质量比为8-12：1， 或者为9-11：1。

进一步地，上述加热回流提取法的提取溶剂为70-90％的乙醇； 提取温度为70-90℃；提取时间为2-4h。

步骤S3：采用反相色谱C18柱分离乌头总生物碱B，得到混合物 C。

在该步骤中，利用反相色谱C18柱进行柱层析分离，得到仅含 12-表-欧乌碱和欧乌碱的混合物C，去掉了其它杂质，使分离更加精 准，避免了随意性和偶然性。

进一步地，洗脱剂为甲醇-水混合溶剂，收集体积浓度为65-75％ 的甲醇洗脱部分，得到混合物C。

优选地，上述洗脱剂甲醇－水混合溶剂的体积浓度依次为：5-15％、25-35％、45-55％、65-75％和85-95％，每个浓度分别使 用两个柱体积的浓度进行洗脱。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述：

实施例1

本实施例提供一种欧乌碱和12-表-欧乌碱的分离方法，其包括：

a.称取准噶尔乌头干燥根5.0kg，粉碎机粉碎后过20-40目筛， 筛过后待用。

b.对准噶尔乌头药材粉末，加入5倍体积量、浓度为90％的乙醇 (用稀盐酸调pH值至2-3)，在70℃温度下回流提取8h，期间每隔 30min搅拌均匀一次，冷却后过滤得到提取物，再将该提取物用氨 水调pH值至9-10，出现沉淀物质或悬浮物质。

再对以上提取物用等体积的乙酸乙酯溶剂反复萃取3次，合并3 次的乙酸乙酯萃取液，回收溶剂干，得到黏稠状物质350g，即为总 碱性组分A，待用。

c.在总碱性组分A中，逐渐加入浓度为95％的乙醇(用稀盐酸调 pH值至2～3)，至整个溶液pH值至4为止。将该溶液通过强酸型聚 苯乙烯阳离子交换树脂色谱柱，所用树脂质量为总碱性组分A质量的 10倍。

首先用去离子水冲洗该色谱柱至中性；然后用浓度为10％的氨 水溶液洗脱碱化该色谱柱，所用氨水体积量为树脂体积的1倍；再将 树脂从色谱柱中取出，置于连续回流提取器中，用浓度为80％的乙 醇进行提取，所用乙醇体积量为树脂体积的3倍，在温度80℃下回 流提取3h，收集此部分乙醇提取液，回首溶剂，得到固体状物质80 g，即为总生物碱组分B。

d.采用反相色谱C18柱分离，C18色谱填料用量为总生物碱组分 B质量的10倍，洗脱剂采用甲醇-水混合溶剂，甲醇的体积浓度依次 为10％、30％、50％、70％和90％，每个浓度分别使用两个柱体积 的洗脱剂进行洗脱，收集其中用70％甲醇洗脱部分，即得仅含欧乌碱与表-欧乌碱的混合物C(2.6g)。

e.采用氨基色谱柱分离，氨基色谱填料用量为混合物C质量的 20倍，洗脱剂采用正己烷－二氯甲烷－甲醇三元混合溶剂，体积比 依次为90:5:5、80:10:10、70:15:15、60:25:15、50:25:25、40:30:30， 每个比例分别使用两个柱体积的洗脱剂进行洗脱，其中，在80:10:10 比例下收集洗脱物，回收溶剂后得到欧乌碱(质量：0.7g；纯度94％)； 在50:25:25比例下收集洗脱物，回收溶剂后得到12-表-欧乌碱(质 量：1.4g；纯度95％)。

实施例2

本实施例提供一种欧乌碱和12-表-欧乌碱的分离方法，其包括：

a.称取准噶尔乌头干燥根5.0kg，粉碎机粉碎后过20-40目筛， 筛过后待用。

b.对准噶尔乌头药材粉末，加入7倍体积量、浓度为70％的乙醇(用稀盐酸调pH值至2-3)，在60℃温度下回流提取10h，期间每 隔30min搅拌均匀一次，冷却后过滤得到提取物，再将该提取物用 氨水调pH值至9-10，出现沉淀物质或悬浮物质。

再对以上提取物用等体积的乙酸乙酯溶剂反复萃取3次，合并3 次的乙酸乙酯萃取液，回收溶剂干，得到黏稠状物质330g，即为总 碱性组分A，待用。

c.在总碱性组分A中，逐渐加入浓度为80％的乙醇(用稀盐酸调 pH值至2-3)，至整个溶液pH值至4为止。将该溶液通过强酸型聚苯 乙烯阳离子交换树脂色谱柱，所用树脂质量为总碱性组分A质量的8 倍。

首先用去离子水冲洗该色谱柱至中性；然后用浓度为20％的氨 水溶液洗脱碱化该色谱柱，所用氨水体积量为树脂体积的0.5倍；再 将树脂从色谱柱中取出，置于连续回流提取器中，用浓度为70％的 乙醇进行提取，所用乙醇体积量为树脂体积的3倍，在温度90℃下 回流提取2h，收集此部分乙醇提取液，回首溶剂，得到固体状物质 73g，即为总生物碱组分B。

d.采用反相色谱C18柱分离，C18色谱填料用量为总生物碱组分 B质量的8倍，洗脱剂采用甲醇-水混合溶剂，甲醇的体积浓度依次 为15％、35％、55％、75％和95％，每个浓度分别使用两个柱体积 的洗脱剂进行洗脱，收集其中用70％甲醇洗脱部分，即得仅含欧乌碱与表-欧乌碱的混合物C(2.2g)。

e.采用氨基色谱柱分离，氨基色谱填料用量为混合物C质量的16：1倍，洗脱剂采用正己烷－二氯甲烷－甲醇三元混合溶剂，体积 比依次为90:5:5、80:10:10、70:15:15、60:25:15、50:25:25、 40:30:30，每个比例分别使用两个柱体积的洗脱剂进行洗脱，其中， 在80:10:10比例下收集洗脱物，回收溶剂后得到欧乌碱(质量：0.5g； 纯度93％)；在50:25:25比例下收集洗脱物，回收溶剂后得到12-表- 欧乌碱(质量：1.2g；纯度95％)。

实施例3

本实施例提供一种欧乌碱和12-表-欧乌碱的分离方法，其包括：

a.称取准噶尔乌头干燥根5.0kg，粉碎机粉碎后过20-40目筛， 筛过后待用。

b.对准噶尔乌头药材粉末，加入4倍体积量、浓度为90％的乙醇 (用稀盐酸调pH值至2-3)，在80℃温度下回流提取5h，期间每隔 40min搅拌均匀一次，冷却后过滤得到提取物，再将该提取物用氨 水调pH值至9-10，出现沉淀物质或悬浮物质。

再对以上提取物用等体积的乙酸乙酯溶剂反复萃取3次，合并3 次的乙酸乙酯萃取液，回收溶剂干，得到黏稠状物质310g，即为总 碱性组分A，待用。

c.在总碱性组分A中，逐渐加入浓度为90％的乙醇(用稀盐酸调 pH值至2-3)，至整个溶液pH值至4为止。将该溶液通过强酸型聚苯 乙烯阳离子交换树脂色谱柱，所用树脂质量为总碱性组分A质量的12倍。

首先用去离子水冲洗该色谱柱至中性；然后用浓度为5％的氨水 溶液洗脱碱化该色谱柱，所用氨水体积量为树脂体积的2倍；再将树 脂从色谱柱中取出，置于连续回流提取器中，用浓度为90％的乙醇 进行提取，所用乙醇体积量为树脂体积的4倍，在温度70℃下回流 提取4h，收集此部分乙醇提取液，回首溶剂，得到固体状物质68g， 即为总生物碱组分B。

d.采用反相色谱C18柱分离，C18色谱填料用量为总生物碱组分 B质量的12倍，洗脱剂采用甲醇-水混合溶剂，甲醇的体积浓度依次 为5％、25％、45％、65％和85％，每个浓度分别使用两个柱体积的 洗脱剂进行洗脱，收集其中用65％甲醇洗脱部分，即得仅含欧乌碱 与表-欧乌碱的混合物C(1.9g)。

e.采用氨基色谱柱分离，氨基色谱填料用量为混合物C质量的 24：1倍，洗脱剂采用正己烷－二氯甲烷－甲醇三元混合溶剂，体积 比依次为90:5:5、80:10:10、70:15:15、60:25:15、50:25:25、 40:30:30，每个比例分别使用两个柱体积的洗脱剂进行洗脱，其中，在80:10:10比例下收集洗脱物，回收溶剂后得到欧乌碱(质量：0.4g； 纯度93％)；在50:25:25比例下收集洗脱物，回收溶剂后得到12-表- 欧乌碱(质量：0.9g；纯度94％)。

综上可知，本实施方式采取上述分离方法，根据乌头药材的特性， 生物碱的结构特征以及酸碱性，特殊分离材料，依次采用酸溶碱沉、 阳离子交换树脂、反相色谱柱(RP-18柱)、氨基(NH₂)柱等方法， 按照总碱性成分、总生物碱、12-表-欧乌碱和欧乌碱的混合物、12- 表-欧乌碱和欧乌碱的单体化合物的思路，一步一步除掉杂质，使需 要分离的产物逐渐得到纯化，并最终得到分离，精确和可靠，具有可 重复操作性，避免了现有技术方法的偶然性。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在 不背离本发明的精神和范围的情况下可以做出许多其它的更改和修 改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有 这些变化和修改。