阅读说明：本技术 一种蔓越橘提取物的制备方法 (Preparation method of cranberry extract ) 是由 易宇阳 曹慧璋 康军 陈宏钢 王文甲 于 2019-10-31 设计创作，主要内容包括：一种蔓越橘提取物的制备方法,其制备过程如下：破碎的蔓越橘鲜果,经酸性乙醇溶液回流提取,回收酒精,得到浓缩液；浓缩液离心,得到上清液和离心渣；上清液经离子交换树脂分离、大孔树脂分离,分别得到蔓越橘花色苷(含量≥30%)和蔓越橘原花青素(含量≥50%)。本发明提供的制备方法,原料利用率高、工艺简单、工业化生产易实现。通过本方法制备的产品具有活性成分含量高、色泽稳定、生物活性强等特点,在营养保健、食品饮料、日用化工领域有良好的市场前景。(A preparation method of cranberry extract comprises the following steps: refluxing crushed fresh cranberry fruit with acidic ethanol solution, and recovering ethanol to obtain concentrated solution; centrifuging the concentrated solution to obtain supernatant and centrifugal slag; separating the supernatant with ion exchange resin and macroporous resin to obtain cranberry anthocyanin (content greater than or equal to 30%) and cranberry procyanidin (content greater than or equal to 50%). The preparation method provided by the invention has the advantages of high utilization rate of raw materials, simple process and easy realization of industrial production. The product prepared by the method has the characteristics of high active ingredient content, stable color, strong biological activity and the like, and has good market prospect in the fields of nutrition and health care, food and beverage, daily chemical industry and the like.)

一种蔓越橘提取物的制备方法

技术领域

本发明涉及蔓越橘植物中活性成分的提取、分离工艺，具体涉及一种蔓越橘提取物的制备方法。

背景技术

蔓越橘又称蔓越莓，是杜鹃花科越橘属(Vacinium macrocarpon)的常绿小灌木矮蔓藤植物。蔓越橘红色浆果可作为水果食用，具有水分高、热量低、富含多种维生素、矿物质、膳食纤维等优点。现代研究表明，蔓越橘果实中包含多种活性物质，如原花青素、花青素(花色苷)、黄酮醇、酚酸、白藜芦醇、熊果酸等。相应的应用功效包括：抑菌、抗氧化、抗肿瘤活性等。因其保健功效和医疗价值，备受发达国家市场关注，在法国、美国、日本、德国、瑞士等国具有较大的市场销量。

花色苷(花色素类)是蔓越橘果实中最重要的活性成分之一，它对人体健康有积极的保护作用。研究表明，花色苷具有抗氧化、促进视红素再合成、抗炎症、提高免疫力、抗心血管疾病、抗衰老、抗癌等多种生理活性功能。但其性质很不稳定，在食品加工和贮存过程中容易受光、氧、温度、pH、金属离子等外界因素的影响而发生变化。因此，花色苷类色素的稳定性问题受到研究人员的广泛关注。目前，提高花色苷类稳定性的方法主要有：辅色作用、结构修饰、微胶囊技术等。其中酰基化的花色苷对pH的改变、热处理、光照等均表现出了很强的稳定性。

原花青素是蔓越橘果实中的主要活性成分，分为低聚原花青素(聚合度2-5)和高聚原花青素(聚合度大于5)。研究表明，原花青素具有极强的抗氧化性能，同时还具有抑菌、促进血液循环、保护视力等多种生理活性。而高聚原花青素的抗氧化性能远不及低聚体，且难以被人体吸收利用，一定程度上降低了资源利用价值。因此若能采用一定工艺，将高聚原花青素有效的降解为低聚原花青素，则能大大提高产品的生物活性和资源利用效率，从而创造社会和经济价值。

国内外花色苷、原花青素提取制备的技术有很多报道。如中国专利201010503367.7公开了一种蔓越橘果实中花色苷及原花青素类成分的提取方法，采用生物酶酶解蔓越橘果实，酸水和醇溶液提取，合并提取液浓缩后，通过大孔吸附树脂吸附，得到含花色苷和原花青素类成分的混合物。该方法添加生物酶(纤维素酶、果胶酶、淀粉酶等)能够促进花色苷和原花青素的浸出，工艺过程采用酸性环境保护花色苷的稳定，但未能解决产品应用过程花色苷的稳定性问题；另外，原花青素和花色苷成分未能进行有效分离，对产品的选择性应用有较大限制。中国专利申请201610817839.3公开了一种从越橘中提取纯化花青素的方法，公开了接种微生物降解越橘果实，通过纤维素菌代谢的主产物乙酸对花色苷分子进行分子修饰--酰基化反应，提高花色苷产品的稳定性；同时，通过絮凝沉淀和大孔吸附树脂分离纯化，提高产品中花色苷含量。该方法虽然有意识的采用结构修饰的方法提高花色苷产品的稳定性，但未对酰化反应条件进行控制且参与酰化反应的为单一有机酸，可能导致酰化效果较差。中国专利申请201810984976.5公开了一种高品质低聚原花青素及其制备方法，公开了在碱性条件下(pH值8-9)，加入降聚促进剂(臭氧)对高聚原花青素进行降聚处理。臭氧是一种强氧化性物质，而原花青素本身是一种具有极强抗氧化性能的成分，在臭氧环境中可能导致其抗氧化生物活性遭到破坏。另外，国际环境空气质量标准提出，人在一个小时内可接受臭氧的极限浓度是260μg/m3。在320μg/m3臭氧环境中活动1h就会引起咳嗽、呼吸困难及肺功能下降，可见工艺中使用臭氧，具有一定的安全隐患。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一种原料利用率高，工艺简单，工业化生产易实现的蔓越橘提取物的制备方法，所得产品的稳定性和生物活性更高。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一种蔓越橘提取物的制备方法，包含如下步骤：

A、提取、浓缩：将破碎的蔓越橘鲜果投入提取罐中，加入相当于蔓越橘鲜果原料体积8-12倍的酸性乙醇溶液Ⅰ，回流提取2次以上(优选3次)(提取次数太少，有效成份不能充分提取；提取次数太多，提取率增加有限，溶剂和操作成本增加)，每次回流提取0.5-1小时，将所得提取液减压浓缩、回收酒精，得到浓缩液；

B、离心：将步骤A所得浓缩液离心，分离，得到离心上清液和离心渣；

C、离子交换树脂分离：将步骤B所得离心上清液通过弱酸性阳离子交换树脂，依次使用纯水、酸性乙醇溶液Ⅱ洗脱；合并上样流出液和纯水洗脱液，减压浓缩，得合并浓缩液。将酸性乙醇溶液Ⅱ洗脱液，减压浓缩，加入赋形剂，干燥，得蔓越橘花色苷产品；

离心上清液通过弱酸性阳离子交换树脂时，流出的一部分液体，叫上样流出液；

赋形剂优选为麦芽糊精。

D、大孔吸附树脂分离：将步骤C所得合并浓缩液通过大孔吸附树脂，依次使用纯水、乙醇溶液Ⅲ(洗脱除杂，基本没有花色苷)、乙醇溶液Ⅳ洗脱；将乙醇溶液Ⅳ洗脱液，减压浓缩，加入赋形剂，干燥，得到蔓越橘原花青素产品。

赋形剂优选为麦芽糊精。

进一步地，步骤A中，酸性乙醇溶液Ⅰ中乙醇的体积浓度为65％-85％。其中的酸为混合有机酸。混合有机酸为柠檬酸、苹果酸、奎宁酸、乙酸、苯甲酸、肉桂酸中的3-6种，更优选柠檬酸、苹果酸和奎宁酸的混合。酸性乙醇溶液Ⅰ中，混合有机酸的总摩尔浓度为0.01-0.02mol/L。提取温度为85℃-95℃。

不同的有机酸与花色苷反应的机理有差异，酰化反应的强度不相同，可以起到互补的作用。相比单一的有机酸，多种有机酸与花色苷反应的酰基化效果更好。柠檬酸、苹果酸和奎宁酸的反应效果最佳，且不会引入影响产品纯度的杂质。

进一步地，步骤B中，离心方式为管式离心、碟式离心或卧螺离心。

进一步地，步骤C中，所用弱酸性阳离子交换树脂为D113、D131、D152等常见型号中的一种。酸性乙醇溶液Ⅱ中的乙醇体积浓度为50％-70％。酸性乙醇溶液Ⅱ中的酸为有机酸，优选为柠檬酸、苹果酸、奎宁酸的一种或多种。酸性乙醇溶液Ⅱ中的有机酸总质量浓度为0.2％-0.5％。干燥方式为冷冻干燥或喷雾干燥等。

进一步地，步骤D中，所用大孔吸附树脂为AB-8、D101、NKA-9等常见型号中的一种。所用乙醇溶液Ⅲ中乙醇的体积浓度为25％-35％。所用乙醇溶液Ⅳ中乙醇的体积浓度为50％-60％。干燥方式为真空干燥或喷雾干燥等。

本发明能使蔓越橘活性成分充分提取和纯化，提高产品的稳定性和生物活性，更加符合市场应用需求。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1、蔓越橘原料利用充分：可同时获得花色苷产品与原花青素产品；

2、花色苷产品稳定性好：加入混合有机酸，85℃-95℃回流提取，既能创造酸性环境、保护花色苷不受破坏，又能使花色苷在较高温度下与有机酸发生酰化反应，从结构上调整分子稳定性；离子交换树脂采用酸性乙醇溶液洗脱，可使有机酸作为辅色剂存留在花色苷产品中，提高产品的稳定性，同时该过程引入的有机酸均为蔓越橘原料本身含有的有机酸，不引入外来成分。

3、原花青素产品生物活性高：加入混合有机酸，85℃-95℃回流提取，还能使高聚原花青素在控制条件下(pH值范围、温度、时间)催化分解为低聚原花青素，降低原花青素的平均聚合度，提高生物活性和物料利用度；

4、活性成分含量高：蔓越橘花色苷产品中花色苷含量≥30wt％，蔓越橘原花青素产品中原花青素含量≥50wt％。

本发明提供的制备方法，原料利用率高、工艺简单、工业化生产易实现。通过本方法制备的产品具有活性成分含量高、色泽稳定、生物活性强等特点，在营养保健、食品饮料、日用化工领域有良好的市场前景。

具体实施方式

下面以具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明不受下述实施例的限定。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本说明书中，除另有说明的外，所述百分比为质量百分比。

实施例1

本实施例之蔓越橘提取物的制备方法，包含如下步骤：

A、提取、浓缩：将破碎的蔓越橘鲜果50.5kg(含水率76.34wt％)，置于提取罐中，加入相当于蔓越橘鲜果原料体积10倍的酸性乙醇溶液Ⅰ[酸性乙醇溶液Ⅰ中乙醇的体积浓度为85％。其中的酸为混合有机酸。混合有机酸为柠檬酸、苹果酸、奎宁酸的混合酸(摩尔比1：1：2)。酸性乙醇溶液Ⅰ中，混合有机酸的总摩尔浓度为0.01mol/L]，85℃回流提取3次，每次回流提取0.5小时，将所得提取液于70℃下减压浓缩、回收酒精，得到浓缩液；

B、离心：将步骤A所得浓缩液通过管式离心，分离，得到离心上清液和离心渣；

C、离子交换树脂分离：将步骤B所得离心上清液通过D113弱酸性阳离子交换树脂，然后依次以3BV纯水、2BV酸性乙醇溶液Ⅱ(酸性乙醇溶液Ⅱ中的乙醇体积浓度为50％，酸为柠檬酸，其在酸性乙醇溶液Ⅱ中的质量浓度为0.2％)洗脱。合并D113树脂的上样流出液和纯水洗脱液，70℃下减压浓缩至Brix为12.3，得合并浓缩液。将酸性乙醇溶液Ⅱ洗脱液，于70℃下减压浓缩，回收酒精，浓缩液测定含量后，加入0.10kg麦芽糊精作为赋形剂，喷雾干燥(进风温度170℃，出风90℃)，得到0.43kg花色苷产品(其中花色苷含量为30.89wt％)。浓缩液中溶质的量加上麦芽糊精的质量等于花色苷产品的质量。

D、大孔吸附树脂分离：将步骤C所得合并浓缩液通过AB-8大孔吸附树脂，然后依次以2BV纯水、2BV 30％(体积浓度)乙醇溶液、3BV 60％(体积浓度)乙醇溶液洗脱，收集60％乙醇溶液洗脱液，于70℃下减压浓缩，回收酒精。浓缩液测定含量后，加入0.35kg麦芽糊精作为赋形剂，喷雾干燥(进风温度180℃，出风90℃)，得到1.33kg原花青素产品(其中原花青素含量为51.23wt％)。

实施例2

本实施例之蔓越橘提取物的制备方法，包含如下步骤：

A、提取、浓缩：将破碎的蔓越橘鲜果51.4kg(水分：77.52％)投入提取罐中，分别加入相当于蔓越橘鲜果原料体积12、10、8倍的酸性乙醇溶液I[酸性乙醇溶液I中乙醇的体积浓度75％，其中的酸为混合有机酸。混合有机酸为柠檬酸、苹果酸、乙酸、苯甲酸，其摩尔比为1：1：2：2，混合有机酸在酸性乙醇溶液中的总摩尔浓度为0.015mol/L]，90℃回流提取3次，提取时间分别为1.0小时、0.5小时、0.5小时。将所得提取液于70℃下减压浓缩，回收酒精，得到浓缩液；

B、离心：将步骤A所得浓缩液通过卧螺离心，分离，得到离心上清液和离心渣；

C、离子交换树脂分离：将步骤B所得离心上清液通过D131弱酸性阳离子交换树脂，然后分别以3BV纯水、2BV酸性乙醇溶液Ⅱ(酸性乙醇溶液Ⅱ中乙醇体积浓度为60％，酸为柠檬酸和奎宁酸(摩尔比1:1)。柠檬酸、奎宁酸在酸性乙醇溶液中的总质量浓度为0.3％)洗脱；合并上样流出液和纯水洗脱液，70℃下减压浓缩至Brix13.5，得合并浓缩液。将酸性乙醇溶液洗脱液，于70℃下减压浓缩，回收酒精，浓缩液测定含量后，加入0.12kg麦芽糊精作为赋形剂，喷雾干燥(进风温度170℃，出风90℃)，得到0.42kg花色苷产品(花色苷含量为30.55wt％)。

D、大孔吸附树脂分离：将步骤C所得合并浓缩液通过D101大孔吸附树脂，然后分别以2BV纯水、2BV 30％体积浓度的乙醇溶液(洗脱除杂，基本没有花色苷)、3BV 50％体积浓度的乙醇溶液洗脱；收集50％体积浓度的乙醇溶液洗脱液，于70℃下减压浓缩，回收酒精。浓缩液测定含量后，加入0.28kg麦芽糊精作为赋形剂，喷雾干燥(进风温度180℃，出风90℃)，得到1.24kg原花青素产品(原花青素含量为50.69％)。

实施例3

本实施例之蔓越橘提取物的制备方法，包含如下步骤：

A、提取、浓缩：将破碎的蔓越橘鲜果49.8kg(水分：80.06％)，置于提取罐中，分别加入相当于蔓越橘鲜果原料体积10、10、8倍的酸性乙醇溶液I[酸性乙醇溶液Ⅰ中乙醇的体积浓度为65％。其中的酸为混合有机酸。混合有机酸为柠檬酸、苹果酸、奎宁酸、乙酸和苯甲酸，其摩尔比为1：2：2：1：1，酸性乙醇溶液中，混合有机酸的总摩尔浓度为0.02mol/L]，95℃回流提取3次，每次提取时间为1.0小时/次。将所得提取液于70℃下减压浓缩，回收酒精，得到浓缩液；

B、离心：将步骤A所得浓缩液通过管式离心，分离，得到离心上清液和离心渣；

C、离子交换树脂分离：将步骤B所得离心上清液通过D152弱酸性阳离子交换树脂，然后分别以3BV纯水、2BV酸性乙醇溶液Ⅱ(酸性乙醇溶液Ⅱ中的乙醇体积浓度为70％。酸为柠檬酸、苹果酸、奎宁酸(摩尔比1:1:1)，酸性乙醇溶液中的有机酸总质量浓度为0.4％)洗脱；合并上样流出液和纯水洗脱液，70℃下减压浓缩至Brix11.9，得合并浓缩液。将酸性乙醇溶液洗脱液，于70℃下减压浓缩，回收酒精，浓缩液测定含量后，加入0.08kg麦芽糊精作为赋形剂，喷雾干燥(进风温度170℃，出风90℃)，得到0.34kg花色苷产品(花色苷含量为31.92wt％)。

D、大孔吸附树脂分离：将步骤C所得合并浓缩液通过NKA-9大孔吸附树脂，然后依次以2BV纯水、2BV 30％体积浓度的乙醇溶液(洗脱除杂，基本没有花色苷)、3BV 50％体积浓度的乙醇溶液洗脱；收集50％体积浓度的乙醇溶液洗脱液，于70℃下减压浓缩，回收酒精。浓缩液测定含量后，加入0.15kg麦芽糊精作为赋形剂，喷雾干燥(进风温度180℃，出风90℃)，得到1.04kg原花青素产品(原花青素含量为50.85wt％)。

实施例4

本实施例之蔓越橘提取物的制备方法，包含如下步骤：

A、提取、浓缩：将破碎的蔓越橘鲜果50.6kg(水分：76.98％)，置于提取罐中，分别加入相当于蔓越橘鲜果原料体积12、8、8倍的酸性乙醇溶液I[酸性乙醇溶液Ⅰ中乙醇的体积浓度为70％，其中的酸为混合有机酸。混合有机酸为柠檬酸、苹果酸、奎宁酸、乙酸、苯甲酸和肉桂酸，其摩尔比为1：1：1：1：1：1；酸性乙醇溶液中，混合有机酸的总摩尔浓度为0.01mol/L]，95℃回流提取3次，提取时间分别为1.0小时、1.0小时、0.5小时；将所得提取液于70℃下减压浓缩，回收酒精，得到浓缩液；

B、离心：将步骤A所得浓缩液通过蝶式离心，分离，得到离心上清液和离心渣；

C、离子交换树脂分离：将步骤B所得离心上清液通过D131弱酸性阳离子交换树脂，然后依次以3BV纯水、2BV酸性乙醇溶液Ⅱ(酸性乙醇溶液Ⅱ中的乙醇体积浓度为60％，酸为苹果酸和奎宁酸(摩尔比1:1)，酸性乙醇溶液中的有机酸总质量浓度为0.5％)洗脱；合并上样流出液和纯水洗脱液，70℃下减压浓缩至Brix14.2，得合并浓缩液。将酸性乙醇溶液洗脱液，于70℃下减压浓缩，回收酒精，浓缩液测定含量后，加入0.10kg麦芽糊精作为赋形剂，喷雾干燥(进风温度170℃，出风90℃)，得到0.41kg花色苷产品(花色苷含量为30.27wt％)。

D、大孔吸附树脂分离：将步骤C所得合并浓缩液通过AB-8大孔吸附树脂，然后依次以2BV纯水、2BV 30％体积浓度的乙醇溶液(洗脱除杂，基本没有花色苷)、3BV 50％体积浓度的乙醇溶液洗脱；收集50％体积浓度的乙醇溶液洗脱液，于70℃下减压浓缩，回收酒精。浓缩液测定含量后，加入0.20kg麦芽糊精作为赋形剂，喷雾干燥(进风温度180℃，出风90℃)，得到1.25kg原花青素产品(原花青素含量为50.15wt％)。

对照组

蔓越橘提取物的制备工艺如下：

破碎的蔓越橘鲜果50.1kg(水分：78.14％)，置于提取罐中，分别加入12、10、8倍体积75％乙醇，90℃回流提取三次，提取时间分别为1.0小时、0.5小时、0.5小时。提取液于70℃下减压浓缩，回收酒精，得到浓缩液；浓缩液测定含量后，加入0.44kg麦芽糊精作为赋形剂，喷雾干燥(进风温度180℃，出风90℃)，得到3.54kg产品(花色苷含量为2.17％，原花青素含量为9.39％)。

根据原花青素提取转移率和平均聚合度两个指标，评判高聚原花青素水解为低聚原花青素的效果，具体如下表1、2：

表1原花青素提取转移率数据

品名	重量(kg)	原花青素含量	转移率
				原料	/	0.48％
对照组原花青素产品	3.54	9.39％	138.23％
				实施例1原花青素产品	1.33	51.23％	281.09％
实施例2原花青素产品	1.24	50.69％	254.76％
				实施例3原花青素产品	1.04	50.85％	221.23％
实施例4原花青素产品	1.25	50.15％	258.10％

注：①原料中原花青素含量，以湿品计。

②转移率％＝原花青素产品重量*原花青素含量/原料重量/原料含量％。

③蔓越橘原料中含有一定含量的有机酸(柠檬酸、苹果酸、奎宁酸)，在较高温度的提取条件，蔓越橘原料中的高聚原花青素部分水解为低聚原花青素，从而导致对照组中，原花青素转移率大于100％(138.23％)。

表2原花青素平均聚合度测定结果

品名	重量(kg)	原花青素平均聚合度
			对照组原花青素产品	3.54	6.35
实施例1原花青素产品	1.33	2.43
			实施例2原花青素产品	1.24	2.52
实施例3原花青素产品	1.04	2.78
			实施例4原花青素产品	1.25	2.53

注：①原花青素平均聚合度的测定方法，参考文献(魏冠红.高聚原花青素的水解工艺[D].浙江：浙江大学，2006.)

②原花青素的平均聚合度越高，说明高聚原花青素(聚合度大于5)的比例越大。实施例原花青素平均聚合度在2.43-2.78之间，远低于对照组6.35，说明实施例中高聚原花青素比例极低甚至接近于0。

③因为高聚原花青素的抗氧化性能远不及低聚体，且难以被人体吸收利用，因此高聚原花青素的比例越低，原花青素的生物活性越强。由此可知，本发明技术实施例原花青素产品的生物活性强于对照组。

参考文献“徐渊金，杜琪珍.花色苷分离鉴定方法及其生物活性[J].食品与发酵工艺，2006,32(3):67-72”.根据花色苷在300～330nm间的吸收峰，评判花色苷酰基化效果，具体如下表3：

表3花色苷在300～330nm间吸收峰值测定结果(花色苷浓度10mg/mL)

品名	最大吸收波长λ	吸光度值A
			对照组原花青素产品	330	0.15
实施例1原花青素产品	325	0.45
			实施例2原花青素产品	323	0.48
实施例3原花青素产品	323	0.54
			实施例4原花青素产品	320	0.50

注：花色苷浓度相同的条件下，在300-330nm间吸收峰值的吸光度值越高，说明花色苷酰基化效果越好。由此可知，本发明技术实施例花色苷酰基化效果较好，明显优于对照组。