阅读说明：本技术 一种桑葚提取物、提取分离方法及其应用 (Mulberry extract, extraction and separation method and application thereof ) 是由 白乃生 彭赛男 高兵 郭森 张姗姗 郭雅欣 岳文平 于 2019-09-17 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种桑葚提取物、提前分离方法和应用,该提取物包含以下组分：花青素3-O-β-吡喃葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、β-谷甾醇亚油酸酯、(3S,4R,5R)-N-(3,5-二羟基哌啶-4-基)乙酰胺、二氢山萘酚7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、山奈酚3-O-β-D-芸香糖苷、山奈酚3-O-芸香苷、N-乙酰基-L-丝氨酸、叶黄素、5,7-二羟基原色酮、谷甾醇-3-O-β-D-4’-O-辛烷-吡喃葡萄糖苷、槲皮素、芦丁、邻苯二酚等。本发明所得的桑葚提取物在制备皮肤增白药物、治疗II型糖尿病药物和认知性障碍疾病药物中具有美好的应用前景。(The invention discloses a mulberry extract, a pre-separation method and application, wherein the extract comprises the following components: anthocyanidin 3-O-beta-glucopyranoside, quercetin-3-O-beta-D-glucopyranoside, beta-sitosterol linoleate, (3S,4R,5R) -N- (3, 5-dihydroxypiperidin-4-yl) acetamide, dihydrokaempferol 7-O-beta-D-glucopyranoside, kaempferol 3-O-beta-D-rutinoside, kaempferol 3-O-rutinoside, N-acetyl-L-serine, lutein, 5, 7-dihydroxychromone, sitosterol-3-O-beta-D-4 '-O-octane-glucopyranoside, quercetin, rutin, beta-D-4' -O-octane-glucopyranoside, Catechol, and the like. The mulberry extract obtained by the invention has good application prospect in preparing skin whitening drugs, drugs for treating type II diabetes and cognitive disorder diseases.)

一种桑葚提取物、提取分离方法及其应用

技术领域

本发明涉及植物提取分离技术领域，具体涉及一种桑葚提取物、提取分离 方法及其应用。

背景技术

桑树(Morus alba L.)桑科(Moraceae)桑属(Morus L)植物，在我国各 地均有分布，由于各地的生长环境的不同，在自然选择和人工选择的影响下， 形成了丰富的桑资源，其中包括4个栽培种，11个野生桑种，白桑的3个变 种和蒙桑的变种。桑树高度在3～10m或以上的小中型乔木或灌木，直径可达 50cm，树皮颜色为灰色，且较厚；枝芽为卵形，颜色为红褐色，小枝有细毛； 叶卵形或广卵形，表面鲜绿色，无毛，叶柄有柔毛；花期在4～5月，果期在 5～8月份，桑果呈厂圆形，长度一般为2～3cm。桑叶可疏散风热，清肺润燥， 清肝明目的功能；干燥嫩枝，具有祛风湿，利关节的功能；桑白皮具有泻肺平 喘，利水消肿的功能。

桑葚(Fructus Mori)是桑树的果穗，又名桑枣、桑果、桑实等桑科桑属 植物，桑葚始载于《唐·新修本草》,功能滋阴补血、生津润燥,主治肝肾阴 虚、目暗耳鸣、津液不足、老年便秘、消渴等。李时珍在《本草纲目》中提到， 桑葚是味甘、性微寒的药，具有滋阴、补血、生津、安神的功效。现代药学研 究表明，桑葚具有调节免疫力，补充缺乏的胃液，提高胃肠消化能力的药理作 用，另外它还拥有缓解眼疲劳、眼干涩，清除氧自由基和抗氧化、抗衰老，防 止动脉硬化，促进新陈代谢，降低血糖和血脂，抵抗诱变等作用。

桑属植物主要的化学成分包括黄酮类、茋类、生物碱、酚类等化合物，其 中多酚是该属植物中最重要的活性物质之一，是植物的次级代谢产物。多酚类 化合物是一类范围较大的化合物类型，因结构具有多样性，所以导致了生物活 性的多样性。其中从桑葚中目前已经发现47种酚类化合物，大部分是黄酮醇， 主要是芦丁、槲皮素、杨梅黄酮、山奈酚及其衍生物。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种桑葚提取物、提取分离方法及其应用， 本发明对桑葚的主要成分的提取率高，能够有效地提取出桑葚的主要化合物， 且一次性能分离出19种单体化合物，部分化合物具应用前景。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种桑葚提取物，该提取物包含以下组分：

式①所示的花青素3-O-β-吡喃葡萄糖苷、式②所示的槲皮素-3-O-β-D-吡喃 葡萄糖苷、式③所示的β-谷甾醇亚油酸酯、式④所示的(3S,4R,5R)-N-(3,5- 二羟基哌啶-4-基)乙酰胺、式⑤所示的二氢山萘酚7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、 式⑥所示的山奈酚3-O-β-D-芸香糖苷、式⑦所示的山奈酚3-O-芸香苷、式⑧ 所示的N-乙酰基-L-丝氨酸、式⑨所示的叶黄素、式⑩所示的5,7-二羟基原色 酮、式所示的谷甾醇-3-O-β-D-4’-O-辛烷-吡喃葡萄糖苷、式所示的槲皮素、 式所示的芦丁、式所示的邻苯二酚、式所示的n-hexacos-5,8,11-trienoic acid、式所示的morachalcone A、式所示的对羟基苯甲酸、式示的山 奈酚3-O-β-吡喃葡萄糖苷、式所示的isobavachalcone；

本发明还提供上述桑葚提取物的提取分离方法，包括以下步骤：

S1、将干燥桑葚用体积浓度为90％的乙醇溶液渗漏提取3次，每次浸泡 48h后再开始渗漏，合并三次提取液并减压浓缩，得乙醇浸膏；

S2，将S1得到的乙醇浸膏完全溶解于水中，得浸膏溶液，依次分别用与 浸膏溶液等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取进行萃取，且每种萃取液萃 取2-3次，然后减压浓缩得石油醚、乙酸乙酯、正丁醇浸膏；

S3，将S2得到的乙酸乙酯浸膏经聚酰胺，以水-乙醇溶液梯度洗脱，得7 个馏分，分别对每个馏分进行TLC和HPLC检测，根据检测结果选择层析分 离方式以及相应的洗脱液，分别得式①-式⑤、式⑦、式⑩和式所示的8 种化合物；

S4，将S2得到的正丁醇层浸膏经聚酰胺，以水-乙醇溶液梯度洗脱，得7 个馏分，分别对每个馏分进行TLC和HPLC检测，根据检测结果选择层析分 离方式以及相应的洗脱液，分别得式式⑥、式⑧、式⑨、式和式-式所示的11种化合物。

优选的，所述S3和S4中层析分离方式为：利用硅胶柱、聚酰胺柱、MCI CHP-20P反相柱、Sephadex LH-20反相柱中的一种或多种进行反复层析分离；

所述S3和S4中层析分离过程的洗脱液为：二氯甲烷-甲醇溶液，水-甲醇 溶液、水-乙醇溶液中的一种或多种。

优选的，S1和S2中减压浓缩的条件为温度30～40℃，真空度0.09～0.1MPa。

优选的，S3和S4中水-乙醇溶液包括水、乙醇以及水和乙醇按照 10:90-90:10的体积比的混合液。

本发明还保护上述桑葚提取物的应用，该提取物在制备皮肤增白，治疗II 型糖尿病和认知性障碍疾病的药物或保健品方面的应用。

优选的，所述桑葚提取物花青素3-O-β-吡喃葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D- 吡喃葡萄糖苷、β-谷甾醇亚油酸酯、山奈酚3-O-β-D-芸香糖苷、山奈酚3-O- 芸香苷、N-乙酰基-L-丝氨酸、叶黄素、5,7-二羟基原色酮、槲皮素、 n-hexacos-5,8,11-trienoic acid、morachalconeA、isobavachalcone在制备抑制α- 葡萄糖苷酶、抑制酪氨酸酶、乙酰胆碱酯酶活性药物中的应用。

本发明具有以下有益效果：

本发明对桑葚的主要成分的提取率高，能够有效地提取出桑葚的主要化合 物，且一次性能分离出19种单体化合物；部分化合物具有良好的酪氨酸酶抑 制活性、乙酰胆碱酯酶抑制活性、α-葡萄糖苷酶抑制活性，极具应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例1中乙酸乙酯的部分的HPLC图谱；

图2为本发明实施例1中正丁醇层的部分的HPLC图谱；

图3为本发明实施例1中正丁醇层的部分分离过程图；

图4为本发明实施例1中乙酸乙酯层的部分分离过程图；

图5为本发明19个化合物在90％乙醇提取液的HPLC谱图中对应的位置。

具体实施方式

为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，下面通过具体实施方式例对本 发明进行详细描述。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明， 并不用于限定本发明。

实施例1

一种桑葚提取物的提取分离方法，包括以下步骤：

S1，将干燥桑葚用体积浓度为90％的乙醇溶液渗漏提取3次，每次浸泡 48h后再开始渗漏，合并三次提取液并减压浓缩，得乙醇浸膏，具体如下：

取干燥的桑葚20.094kg，于粉碎机中进行反复粉碎，过筛，最终得到桑 葚细粉。将桑葚粉放置于编织袋中，一同放入提取罐中，在提取罐中加入90％ 的乙醇-水溶液，溶剂充分没过样品，料液比为1g:1.5mL。常温浸泡48h，每 隔两小时进行搅拌一次，以防止样品沉降聚集，促使样品与溶剂充分混合，然 后开始渗透，分别收集一次滤液和一次滤渣，一次滤液作为得到提取液，一次 滤渣再按照上述步骤渗漏提取两次，分别收集二次滤液和二次提取液，合并三 次提取液并40℃、0.09Mpa条件下减压浓缩，并回收溶剂，得到浸膏10.053kg，取1.793kg留样保存。需要说明的是浸膏中不含有乙醇，且减压浓缩时可以将 溶剂回收使用。

S2，将乙醇浸膏用8L的水分散浸膏，搅拌使其充分溶解，将溶解之后的 样品放入萃取瓶中，分别用与浸膏溶液等体积的石油醚、乙酸乙酯(用水饱和 处理后)、正丁醇(用水饱和处理后)萃取，搅拌使其充分接触，放置至明显 分层，每种溶剂萃取3次，直至萃取液相对澄清，并将同种溶剂的萃取液合并； 然后分别于40℃、0.09Mpa条件下减压浓缩各溶液，分别对应得到石油醚层浸 膏(40.79g)，乙酸乙酯层浸膏(90.31g)，正丁醇层浸膏(397.8g)和水层 浸膏(8.478kg)，并对它们进行HPLC检测，得到图谱如图1和2所示。

需要说明的是减压浓缩时可以将溶剂回收使用。需要说明的是，取少量 S1中提取液经微膜过滤后做HPLC检测，发现只有石油醚、乙酸乙酯、正丁 醇作为萃取剂时效果最佳。

S3，乙酸乙酯层浸膏90.31g选择100-200目的聚酰胺作为柱层析填料， 选择湿法上样，用乙醇-水系统梯度洗脱，结合高效液相色谱(HPLC)和硅胶 薄层色谱(TLC)追踪检测，合并相同馏分，并减压蒸馏浓缩。按照上述操作， 乙酸乙酯层被粗分成七部分，分别命名为：Fr1(乙醇-水＝0:100)7.23g，Fr2 (乙醇-水＝10:90)5.33g，Fr3(乙醇-水＝20:80-30:70)13.01g，Fr4(乙醇-水 ＝40:60-50:50)18.0g，Fr5(乙醇-水＝60:40-70:30)20g，Fr6(乙醇-水＝80:20-90:10) 5.04g，Fr7(乙醇-水＝90:10)4.73g。

用TLC检测发现Fr1和Fr2部分极性较大，溶于水，颜色呈铁锈红色， 且粘性较大，有香甜味，是多糖类化合物；Fr3和Fr4部分TLC检测为极性中 等偏大部分，颜色为酒红色；Fr5部分出现了分层现象，上层为酒红色凝固油 脂状物质，下层为***透明液体。Fr6和Fr7部分呈现凝固的油脂状，颜色 为浅绿色，溶于二氯甲烷和石油醚，用TLC检测为极性较小部分；因此主要 对Fr3，Fr4和Fr5部分进一步的分离。

Fr3用硅胶(100-200目)作为柱层析填料，干法上样，用二氯甲烷-甲醇 (50:1→0:1)系统梯度洗脱，结合HPLC和TLC进行检测，合并相同部分， 得到5个馏分。对第三馏分柱层析，选择反向柱MCI-CHP20P进行柱层析， 甲醇-水(0:100→100:0)系统进行梯度洗脱，并使用HPLC和TLC追踪检测， 合并相同馏分，浓缩，在甲醇-水＝0:100时，得到单体化合物①SS-1，质量为 1.131g。第四馏分使用反向柱柱层析，MCI-CHP20P为柱层析填料，甲醇-水(0:100→100:0)系统梯度洗脱，得到化合物②SS-2(甲醇:水＝70:30)23mg。

Fr4用硅胶(100-200目)作为柱层析填料，干法上样，使用二氯甲烷-甲 醇(70:1→0:1)系统梯度洗脱，结合HPLC和TLC进行检测，收集相同馏分， 合并，浓缩，将Fr4分成6个馏分。取第三馏分继续分离操作，使用MCI-CHP20P 反复柱层析，甲醇-水(0:100→100:0)系统进行洗脱，结合HPLC和TLC检 测，得到6个馏分，得到化合物⑤SS-5(甲醇:水＝40:60)53.7mg。将上述第 三个馏分中分离到得第四馏分再次的分离，使用MCI-CHP20P柱层析，得到 化合物⑦SS-7(甲醇:水＝20:80)31mg。

Fr5有分层现象，是该样品中化合物极性不同导致，为了后续分离操作， 所以，依次用石油醚，二氯甲烷和甲醇进行提取，将样品粗分为三部分，将甲 醇提取部分浓缩，TLC和HPLC检测结果显示为极性较大部分，用 MCI-CHP20P反复柱层析，得到化合物④SS-4(甲醇:水＝30:70)26mg和化 合物⑩SS-10(甲醇:水＝40:60)44mg。将二氯甲烷提取得到的样品用硅胶 (300-400目)进行分离，用石油醚-乙酸乙酯(80:1→0:1)系统梯度洗脱，收 集石油醚-乙酸乙酯＝20:1馏分，放置一天，发现有羽毛状结晶，HPLC检测为 单峰，得到化合物③SS-3，质量为0.93g，在石油醚-乙酸乙酯＝5：1馏分时， 得到单体化合物SS-12，质量为59mg，乙酸乙酯层的分离过程如图3所示。

S4，正丁醇层浸膏397.8g选择聚酰胺作为柱层析填料，乙醇-水 (0:100→100:0)系统梯度洗脱，选择的展开剂为正丁醇-水-冰乙酸体系，HPLC 和TLC检测追踪，将相同的馏分合并，得到7个馏分。分别为Frs1(乙醇-水 ＝0:100-10:90)152.17g，Frs2(乙醇-水＝20:80-30:70)34.93g，Frs3(乙醇-水 ＝40:60)38.14g，Frs4(乙醇-水＝50:50)43.79g，Frs5(乙醇-水＝60:40-70:30) 41.14g，Frs6(乙醇-水＝80:20-90:10)60.20g，Frs7(乙醇-水＝100:0)11.65g。

Frs1大部分是多糖，用HPLC检测，化合物极性偏大且比较集中，用二氯 甲烷和甲醇展开体系无法展开，用正丁醇-水-冰乙酸或者丙酮-正丁醇-冰乙酸 体系可以展开，为亮黄色圆点，在紫外灯下为蓝色点，不对该部分分离。经HPLC检测发现，Frs3、4、5、7化合物较集中，不易分离，Frs2和6化合物 极性分布相对较分散，易于分离，因此选择2和6作为分离重点。

Frs2的极性较大，选择用聚酰胺柱层析，甲醇-水(0:100→100:0)体系梯 度洗脱，TLC和HPLC跟踪检测，分成8个馏分。反向柱MCI-CHP20P对馏 分1反复柱层析，展开剂为丙酮-甲醇-乙酸体系，得到化合物SS-11(甲醇: 水＝40:60)77.85mg和化合物SS-14(甲醇:水＝20:80)43.26mg。

Frs6分为两部分上样，小试结果显示，用硅胶作为柱层析填料则大极性部 分无法分离，用聚酰胺作为填料，则中等和小极性部分无法分离，所以，选择 用二氯甲烷和正丁醇分别提取，分成两个部分。二氯甲烷部分用硅胶(200-300 目)梯度洗脱，选择二氯甲烷-甲烷(30:1-0:1)系统洗脱，用TLC结合HPLC 进行检测，二氯甲烷-甲烷＝30:1和20:1时，得到单体化合物SS-15(1.33g)， 在二氯甲烷-甲烷＝5:1时得到化合物⑨SS-9(76mg)。正丁醇提取部分用聚 酰胺柱层析，洗脱体系为甲醇-水(0:100→100:0)，分为9个馏分，HPLC检测发现第6馏分为单峰，得到化合物SS-13(甲醇:水＝50:50)34.67mg。将 上一步骤中的第4和8馏分分别反复MCI-CHP20和Sephadex LH-20柱层析， 乙醇-水(0:100→100:0)作为洗脱体系，得到单体化合物⑥SS-6(74.83mg)、 ⑧SS-8(83.34mg)、SS-16(78.32mg)、SS-17(47.42mg)、SS-18 (38.43mg)、SS-19(75.48mg)，正定醇层的分离过程如图4所示。

为鉴定19种化合物结构，对提取的19种化合物分别通过核磁共振技术 (1HNMR、l3CNMR、1H-1H COSY、DEPT、HMBC、HMQC)，紫外光谱 技术(UV)，质谱技术(MS)等现代波谱技术确定了具体结构，这19种化 合物为：花青素3-O-β-吡喃葡萄糖苷①、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷②、 β-谷甾醇亚油酸酯③、(3S,4R,5R)-N-(3,5-二羟基哌啶-4-基)乙酰胺④、二氢山萘酚7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷⑤、山奈酚3-O-β-D-芸香糖苷⑥、山奈酚 3-O-芸香苷⑦、N-乙酰基-L-丝氨酸⑧、叶黄素⑨、5,7-二羟基原色酮⑩、谷 甾醇-3-O-β-D-4’-O-辛烷-吡喃葡萄糖苷、槲皮素、芦丁、邻苯二酚、 n-hexacos-5,8,11-trienoic acid、morachalcone A、对羟基苯甲酸、山奈 酚3-O-β-吡喃葡萄糖苷、isobavachalcone。

表1 19中化合物对应的名称及代号及结构

然后我们取桑葚90％乙醇提取液和S3、S4步骤得到的19个化合物，将 它们均配成相同浓度的溶液，经过0.22μm滤膜过滤于液相瓶中，并在已经验 证的色谱条件下进行分析，得到桑葚90％乙醇提取液和各个化合物的HPLC 谱图，该色谱测试条件与化合物含量浓度测试过程中色谱测试的条件相同，也 就是表3的高效液相色谱条件相同。以保留时间和紫外为对比依据，初步判断 19个化合物在90％乙醇提取物的HPLC谱图中的位置，并得到图5。

本发明还提供上述桑葚提取物的分析方法，包括如下步骤：

1、称取表1中式19个化合物各1.0mg(精确到0.0001g)，并将称取好 的样品用甲醇充分溶解，定容至1.0ml。准确的取对照品0.5ml，逐级稀释成 浓度为0.2mg/ml、0.1mg/ml、0.050mg/mL、0.025mg/mL、0.0125mg/mL和 0.00625mg/mL、0.005mg/ml的标准液，其余的对照品按照上述操作进行逐级 稀释。放入冰箱中，4℃低温保存，供后续分析使用。

HPLC分析上述配制好对照品不同浓度的系列标准溶液，HPLC分析上述 配制好对照品不同浓度的系列标准溶液，以特定色谱条件进行分析记录分析结 果中得到峰面积，然后考察浓度和峰面积的线性关系，横坐标X为样品浓度 (mg/ml)，纵坐标Y为峰面积，得到线性回归方程。

表2各化合物标准曲线

编号	标准曲线	R<sup>2</sup>
			1	Y＝18.78X-100.92	0.9956
4	Y＝17.76X-94.30	0.9966
			5	Y＝54.34X-276.87	0.9946
9	Y＝18.63X-103.63	0.9988
			10	Y＝97.36X-329.21	0.9957
12	Y＝61.21X-332.32	0.9980
			13	Y＝38.78X-298.43	0.9932
19	Y＝57.08X-308.37	0.9987

表2为各化合物标准曲线，从表3中的结果可以看出，8个化合物的浓度 在5-200μg/mL范围内时，峰面积和浓度的线性关系良好，R²>0.99。

2、称取已经粉碎的桑葚样品10g放入锥形瓶中，加入90％甲醇-水溶液 30ml进行超声提取60min，提取两次，两次的提取液进行合并、过滤、浓缩、 定容(10ml)，将上述制备好的供试品溶液放入冰箱中，4℃下低温保存，用 已经验证的HPLC-DAD分析方法来分析供试液，进样20μL，其他方法条件不 变。表3为高效液相色谱条件。

表3高效液相色谱条件

时间/min	A	B
			0	100％	0％
5	95％	5％
			15	90％	10％
30	80％	20％
			45	75％	25％
55	65％	35％
			60	50％	50％
65	30％	70％
			68	5％	95％
73	5％	95％
			75	100％	0％
80	100％	0％

色谱柱：Luna 5μC18(2)100A(250×4.60mm 5micron)

柱温：30℃

流动相：A：乙腈B：水

流速：1.0ml/min

进样量标准品进样量:5μL样品进样量：20μL

检测波长：210nm

3、计算19种化合物的含量浓度，表4为计算得到的化合物含量浓度，计 算公式为：

表4各化合物含量

本发明中的桑葚提取物可用于开发美白，治疗II型糖尿病和认知性障碍 疾病的药物和保健品。为验证其功效，进行如下实验：

1、酪氨酸酶活性抑制实验

酪氨酸酶抑制活性测定的材料：酪氨酸酶(100U/mL PH＝6.8)、酪氨酸 (1mg/mL)、曲酸、磷酸缓冲液(0.1mol/L，pH＝6.8)和从桑葚中分离得到 的19个化合物。

a，取上19个化合物各1.0mg(精确至0.0001g)，用DMSO将化合物 进行溶解，均定容至1ml，配置成1.0mg/ml的待测液。

b，在96孔板中进行溶液的配置，3列分为一组，分为四组:A空白组(80 μLPBS、50μLDMSO、50μL酪氨酸酶酶、20μL酪氨酸)、B空白背景组(130 μL磷酸缓冲液、50μL DMSO、20μL酪氨酸)、C实验组(80μLPBS、50μL 酪氨酸酶、50μL样品、20μL酪氨酸)和D背景实验组(130μLPBS、50μL 样品、20μL酪氨酸)。

c，将配置好的溶液在37℃下反应半小时，然后在475nm下使用酶标仪 进行吸光度测定，计算抑制率和IC50，使用曲酸作为阳性对照。

抑制率％＝[1-(C-D)/(A-B)]×100％

2、α-葡萄糖苷酶活性抑制实验

α-葡萄糖苷酶抑制活性测定的材料：α-葡萄糖苷酶(2U/mL,PH＝7.4)4- 硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷(PNG)(2.5mmol/L)、Na2CO3(0.2mol/L)、 磷酸缓冲液(PBS)(0.1mol/L，pH＝6.8)和从桑葚中分离得到的19个化合 物。

a,使用96孔板分为三组：样品组(PBS 20μL、待测样20μL、α-葡萄糖苷 酶20μL)、控制组(PBS 40μL和20μL待测样)和空白组(PBS 40μL和α- 葡萄糖苷酶20μL)。

b，将配置好的溶液在37℃下反应15min后加入底物PNPG 20μL，继续反 应15min后加入80μL碳酸钠溶液终止反应。将配置好的溶液在酶标仪下使 用405nm波长测定吸光值。

c，计算抑制率和IC50，使用阿卡波糖作为阳性对照。

抑制率％＝[1-(OD样品-OD控制)/OD空白]×100％

3、乙酰胆碱酯酶活性抑制实验

乙酰胆碱酯酶抑制活性测定的材料：乙酰胆碱酯酶(5U/mL PH＝7.4)、 碘化乙酰硫代胆碱(ACTI)(15mM)、二硫二硝基苯甲酸(DTNB)(2mM)、 磷酸缓冲液(0.1mol/L，pH＝6.8)和从桑葚中分离得到的19个化合物。

a，使用96孔板对乙酰胆碱脂酶活性进行测定，分为三组：样品组(140μL PBS、20μL待测样品、20μL乙酰胆碱酯酶)、控制组(160μL PBS、20μL 待测样品)和空白组(160μL PBS、20μL乙酰胆碱酯酶)。

b，将配置好溶液37℃下分别反应20min，加入ACTI和DTNB各10μL， 继续反应15min，将配置好的溶液在酶标仪下使用412nm波长下测定吸光值。 c，计算抑制率和IC50，使用石杉碱甲作为阳性对照。

抑制率％＝[1-(OD样品-OD控制)/OD空白]×100％

表5活性测定结果

酪氨酸酶是一种含酮金属氧化酶，普遍存在于真菌、植物和动物中，是黑 色素合成过程中起到关键作用的酶，因此抑制酪氨酸酶的活性可以抑制黑色素 的产生，从而起到美白的作用。α-葡萄糖苷酶是一种碳水化合物消化酶，位 于小肠绒毛粘膜细胞刷状缘中，可以调节机体的餐后血糖，因此抑制α-葡萄糖 苷酶的活性可以降低葡萄糖在体内的量，降低血糖。乙酰胆碱酯酶是一种水解 乙酰胆碱，乙酰胆碱作为神经递质起到终止神经传递的作用，因此降低乙酰胆 碱酯酶的水解活性，提高了大脑组织中乙酰胆碱的浓度，从而可以维持大脑中 的信号传导的稳定性。

对所分离出的化合物进行酶活性检测，并计算出每种样品分别对三种酶活 性抑制的半抑制率，表5为活性检测结果，通过实验结果发现：

1.花青素3-O-β-吡喃葡萄糖苷①、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷②、β- 谷甾醇亚油酸酯③、山奈酚3-O-β-D-芸香糖苷⑥、山奈酚3-O-芸香苷⑦、 5,7-二羟基原色酮⑩、槲皮素、morachalconeA、isobavachalcone具有 抑制酪氨酸酶的活性，在样品浓度为0.25mg/ml时，花青素3-O-β-吡喃葡萄糖 苷①、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷②的抑制活性大于阳性对照曲酸的抑制 活性，半抑制率IC50分别为0.105和1.39mM<1.4874mM；

2.花青素3-O-β-吡喃葡萄糖苷①、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷②、β- 谷甾醇亚油酸酯③、山奈酚3-O-β-D-芸香糖苷⑥、山奈酚3-O-芸香苷⑦、N- 乙酰基-L-丝氨酸⑧、叶黄素⑨、5,7-二羟基原色酮⑩、槲皮素、 n-hexacos-5,8,11-trienoic acid、morachalconeA、isobavachalcone具有抑 制α-葡萄糖苷酶的活性，在样品浓度为0.33mg/ml时，化合物花青素3-O-β- 吡喃葡萄糖苷①和槲皮素具有较好的α-葡萄糖苷酶抑制活性，半抑制率均 小于阳性对照阿卡波糖，半抑制率IC50分别为0.9790和0.852mM<5.5814 mM，因此这两种化合物对治疗II型糖尿病具有较好的作用；

3.花青素3-O-β-吡喃葡萄糖苷①、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷②、β- 谷甾醇亚油酸酯③、山奈酚3-O-β-D-芸香糖苷⑥、山奈酚3-O-芸香苷⑦、N- 乙酰基-L-丝氨酸⑧、叶黄素⑨、5,7-二羟基原色酮⑩、槲皮素、 n-hexacos-5,8,11-trienoic acid、morachalconeA、isobavachalcone具有抑 制乙酰胆碱酯酶的活性，在样品浓度为0.11mg/ml时，山奈酚3-O-β-D-芸香 糖苷⑥和山奈酚3-O-芸香苷⑦具有较好的乙酰胆碱酯酶抑制活性，半抑制率 均小于阳性对照石杉碱甲，半抑制率IC50分别为0.8575，0.9580mM<2.1093 mM，这两种化合物可用于开发治疗老年痴呆或阿尔兹海默症的药物。

4.黄酮类化合物的抑制活性比其他类型的化合物抑制活性好

由以上分析可得，化合物花青素3-O-β-吡喃葡萄糖苷①、山奈酚3-O-β-D- 芸香糖苷⑥、山奈酚3-O-芸香苷⑦、槲皮素、morachalconeA、 isobavachalcone对这三种酶的抑制活性相对较好，尤其是对α-葡萄糖苷酶和 乙酰胆碱酯酶的抑制活性。因此推断桑葚中的黄酮类化合物是桑葚中一类具有 较高应用价值的物质，其中花色素在桑葚中的含量较高，是一种较好的天然色 素，可用于开发食品着色剂和营养强化剂，和药品等。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通 技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰， 这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。