阅读说明：本技术 用于鼻咽癌检测的重组Rta蛋白、试剂盒及其应用 (Recombinant Rta protein for nasopharyngeal carcinoma detection, kit and application thereof ) 是由 肖智 李全 张建珍 焦守恕 吴凡 于 2019-12-13 设计创作，主要内容包括：本发明涉及体外血清学诊断技术,具体涉及一种用于鼻咽癌检测的重组Rta蛋白、试剂盒及其应用。本发明提供的用于鼻咽癌检测的重组Rta蛋白,其氨基酸序列由选自序列7、12、18、24、28、39、40、46、47、52和56中的至少两条序列串联组成,优选由序列12、序列18、序列39、序列40和序列56按照1：2：2：1：3的数量比串联组成。该重组Rta蛋白在鼻咽癌筛查中的敏感性达到92%,特异性达到98%。(The invention relates to an in vitro serological diagnosis technology, in particular to a recombinant Rta protein for detecting nasopharyngeal carcinoma, a kit and application thereof. The amino acid sequence of the recombinant Rta protein for detecting nasopharyngeal carcinoma provided by the present invention is composed of at least two sequences selected from the group consisting of sequence 7, sequence 12, sequence 18, 24, 28, 39, 40, 46, 47, 52 and 56 in tandem, preferably sequence 12, sequence 18, sequence 39, sequence 40 and sequence 56 according to 1: 2: 2: 1: 3 in series. The sensitivity of the recombinant Rta protein in nasopharyngeal carcinoma screening reaches 92%, and the specificity reaches 98%.)

用于鼻咽癌检测的重组Rta蛋白、试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术、医学免疫学与体外血清学诊断技术领域，具体涉及一种用于鼻咽癌检测的重组Rta蛋白、试剂盒及其应用。

背景技术

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是指发生在鼻腔与咽之间鼻咽部的恶性肿瘤，占头颈部恶性肿瘤的78.08%，占上呼吸道肿瘤（鼻咽癌、喉癌等）的92.99%。鼻咽癌好发年龄在35至50岁之壮年期，占发病人数60％，易对社会、经济、劳力及家庭造成重大冲击，危害性很大。男性比女性易患鼻咽癌，其比例约3比1。鼻咽癌在女性癌症中仅次于***和乳腺癌，居第三位。据世界卫生组织统计，全世界的鼻咽癌病例约80％发生在中国，尤其在广东、广西、海南、福建、湖南、江西、四川南部和香港、台湾等地区高发，与食道癌、肝癌并列为中国三大肿瘤。同时，在东南亚地区，如新加坡，马来西亚，菲律宾，印度尼西亚等国家，也有大量病患。尤其值得注意的是，侨居各地的中国人（其中大多来自广东、广西和福建等省），鼻咽癌发病率仍然维持在较高的水平，这说明了鼻咽癌的发生有明显的种族敏感性。国内鼻咽癌分布具有明显的地区性差异，以广东的肇庆、佛山、广州地区和广西梧州地区互相连成一片，为世界上鼻咽癌最高发的地区。广州中山医科大学曾对肇庆等西江流域地区436,786人进行了普查，结果鼻咽癌的患病率高达56.80/10万。近年来鼻咽癌患者以每年约8万病人的速度递增，而且在我国北方群体中也呈增高趋势。中晚期鼻咽癌造成的死亡率很高，即使经过治疗，五年生存率平均仅为20-30%，而鼻咽癌早期放射治疗的效果极佳，五年生存率可达90%。可见如果鼻咽癌能早期诊断，其治疗效果和预后均可明显改善。因此，快速、准确、简便的诊断和筛查鼻咽癌的方法具有较大的市场前景。

EB病毒（Epstein-Barr virus, EBV）是一种常见的γ疱疹病毒，全世界90%以上的人感染此病毒，主要侵犯B淋巴细胞，并易感染上皮细胞（包括腮腺管、鼻咽和子宫颈等部上皮细胞）和腺细胞。一般情况下，体内感染的EB病毒处于潜伏状态（隐性感染）；然而在某些因素的刺激下，潜伏状态的EB病毒基因组被激活，EB病毒进入裂解状态。根据国际癌症研究中心（IARC）1999年对致癌因子的分类标准，EB病毒已经被明确列为人类致癌的因子之一。

胡怀中等用RT–PCR的方法对主要的EBV裂解基因在鼻咽部活检组织（包括肿瘤组织和正常组织）当中的表达情况进行研究，发现在NPC样本和对照样品中BZLF1、BALF2和BCLF的表达均能检出，而BRLF1的表达仅能在NPC样本中检测出，而正常组织中未能检出。这一结果说明EB病毒的再激活，在鼻咽癌组织和正常组织中均可发生，但是BRLF1基因的表达仅在鼻咽癌活检组织中发生，这一结果暗示了BRLF1基因在鼻咽癌发生发展中的重要作用。

EB病毒潜伏期和裂解期各种基因表达的蛋白产物会引起人体免疫系统的反应产生出相应的抗体，分布于血液中，可以用酶联免疫法（ELISA）检测出来。EB病毒进入裂解期最先被激活的就是立即早期基因BRLF1，其表达产物是Rta蛋白。Rta是聚合状蛋白质，由605个氨基酸组成，其分子量大（66594.6Da）、化学成分复杂、抗原表位表露，具有很强的抗原性，在血液中存在相应的抗体。研究者利用免疫沉淀方法检测了53例未经治疗的鼻咽癌病人和53例正常对照人血清中Rta蛋白IgG抗体，结果在53例鼻咽癌病人中，有44例检出IgG-Rta（83%），仅有1例正常人检出IgG-Rta（1.9％），表明了EB病毒Rta蛋白抗体作为鼻咽癌肿瘤标记物的巨大潜力。国内外多项临床研究表明，检测血液中Rta-IgG抗体可用于鼻咽癌的辅助诊断。

专利CN101153059B中描述了EB病毒Rta蛋白用于鼻咽癌筛查、诊断和治疗效果预测，同时进一步通过软件抗原性分析获得Rta蛋白的抗原决定簇，然后通过单独表达或串联表达融合蛋白用于鼻咽癌筛查，具有较好的敏感性和特异性。专利CN104086657B中则描述了EB病毒Rta蛋白部分氨基酸序列与EA蛋白部分氨基酸序列进行串联表达，以提高对鼻咽癌筛查的敏感性和特异性。但是，这些重组蛋白由于氨基酸序列较长，均有多个抗原表位，由于不同抗原表位的特异性和敏感性也不相同，通过这些方法制备的重组蛋白，试剂的敏感性和特异性无法进一步提升。

发明内容

基于上述问题，为了进一步提高鼻咽癌筛查的敏感性和特异性，本发明提供一种用于鼻咽癌诊断的重组蛋白，该蛋白在鼻咽癌筛查中的敏感性达到92%，特异性达到98%。

本发明提供的用于鼻咽癌检测的重组Rta蛋白，其氨基酸序列由选自序列7、12、18、24、28、39、40、46、47、52和56中的至少两条序列串联组成。

优选，所述重组Rta蛋白的氨基酸序列由序列12、序列18、序列39、序列40和序列56按照1：2：2：1：3的数量比串联组成。

优选，所述重组Rta蛋白的氨基酸序列为序列62或序列63。

本发明还提供任一所述重组Rta蛋白的制备方法，其包括如下步骤：合成所述重组Rta蛋白的编码基因，构建表达载体，转化大肠杆菌并进行蛋白表达和纯化。

本发明还提供用于鼻咽癌检测的多肽组合物，其特征在于，由氨基酸序列选自序列7、12、18、24、28、39、40、46、47、52和56中的至少两种多肽组成。

优选，所述多肽组合物由氨基酸序列分别为序列12、序列18、序列39、序列40和序列56的多肽按照1：2：2：1：3的摩尔比混合而成。

本发明还提供所述多肽组合物的制备方法，其特征在于，包括合成所述至少两种多肽并混匀。

本发明还提供包含任一所述重组Rta蛋白或所述多肽组合物的试剂盒。优选，所述试剂盒提供包被有所述重组Rta蛋白或所述多肽组合物的微孔板。更优选，所述试剂盒还提供清洗液、样本稀释液（例如1% BSA溶液）、阴性对照血清、阳性对照血清、二抗、显色底物和试剂盒操作说明书。

优选，所述重组Rta蛋白或所述多肽组合物的工作浓度为1.0 μg/ml。将重组Rta蛋白或多肽组合物用于酶联免疫法检测鼻咽癌时，优选包被浓度为1.0 μg/ml，优选二抗为0.04 μg/ml羊抗人IgG。

任一所述重组Rta蛋白或所述多肽组合物或所述试剂盒在鼻咽癌检测中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明将Rta蛋白分割成60条多肽序列，利用不同序列的多肽测定正常体检血清样本和鼻咽癌确诊患者血清样本，筛选出灵敏度高、特异性好的多肽（抗原表位），然后通过不同比例的多肽（抗原表位）串联表达，获得了重组Rta蛋白。所述灵敏度高、特异性好的多肽也可以直接混合成多肽组合物，用于鼻咽癌筛查。本发明提供的重组Rta蛋白和多肽组合物，在保证鼻咽癌高检出率的情况下进一步提高了检测结果的准确性，达到了92%的灵敏度和98%的特异性，突破了现有Rta蛋白检测技术无法进一步提高检测性能的瓶颈。

具体实施方式

下面结合实施例进一步阐述本发明，需要理解的是，下述实施例仅作为解释和说明，不以任何方式限制本发明的范围。

溶液和试剂

包被缓冲液：称取磷酸二氢钠（NaH₂PO₄）（国药，20040799）0.0624g、磷酸氢二钠（Na₂HPO₄）（国药，100203008）0.716g。加入60ml超纯水，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至100ml。

封闭液：20mM PBS，pH7.4：称取磷酸二氢钠（NaH₂PO₄）（国药，20040799）0.0624g、磷酸氢二钠（Na₂HPO₄）（国药，100203008）0.716g、氯化钠（NaCl）（国药，10019308）0.8g、牛血清白蛋白（amresco，S12003C01）3g。加入60ml超纯水，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至100ml。

清洗液：20mM PBS，pH7.4：称取磷酸二氢钠（NaH₂PO₄）（国药，20040799）0.0624g、磷酸氢二钠（Na₂HPO₄）（国药，100203008）0.716g、氯化钠（NaCl）（国药，10019308）0.8g、Tween-20（sigma，44112）50μL。加入60ml超纯水，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至100ml。

1% BSA溶液：20mM PBS，pH7.4：称取磷酸二氢钠（NaH₂PO₄）（国药，20040799）0.0624g、磷酸氢二钠（Na₂HPO₄）（国药，100203008）0.716g、牛血清白蛋白（amresco，S12003C01）1g。加入60ml超纯水，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至100ml。

链酶亲和素：购自盘古基因生物工程（南京）股份有限公司，货号：GSA-10002，5mg/ml。

羊抗人IgG-HRP（cat#109-035-008，抗体浓度0.8mg/ml）、羊抗人IgA-HRP（cat#109-035-011，抗体浓度0.8mg/ml）、羊抗人IgM-HRP（cat#109-035-129，抗体浓度0.8mg/ml）、羊抗人（IgG+IgM）-HRP（cat#109-035-044，抗体浓度0.8mg/ml）、羊抗人（IgG+IgM+IgA）-HRP（cat#109-035-064，抗体浓度0.8mg/ml），购自Jackson ImmunoResearchLaboratories, Inc.。

化学发光底物A和底物B：购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司，货号34080。

Rta试剂盒：同昕生物技术（北京）有限公司生产的EB病毒Rta蛋白抗体IgG检测试剂盒（酶联免疫法），产品编号A-0348，A-0396。

100例正常体检血清样本和100例鼻咽癌确诊患者血清样本由梧州肿瘤医院提供。

本发明未特别说明的实验试剂均为本领域常规试剂，可按照本领域常规方法配制而得或商购获得；未特别说明的实验方法，均为本领域常规方法，可参考相关实验手册，例如分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW，Molecular cloning:a laboratorymanual，2001），或制造厂商说明书。

实施例1. 高敏感性多肽的获得

我们将Rta蛋白序列（序列表中序列61）分割成60条多肽序列（序列表中序列1-60），如表1所示。

表1. Rta蛋白的60条多肽序列

序号	序列	序号	序列
				SEQ1	mrpkkdgledflrltpeikkqlgslvsdyc	SEQ31	ptmplkpgaqsadcgdssssssdsgnsdte
SEQ2	nvlnkeftagsveitlrsykickafineak	SEQ32	qsereearaeaprlrapksrrtsrpnrgqt
				SEQ3	ahgrewgglmatlnicnfwailrnnrvrrr	SEQ33	pcpsnaeepeqpwiaavhqesderpifphp
SEQ4	aenagndacsiacpivmryvldhlivvtdr	SEQ34	skptflppvkrkkglrdsregmflpkpeag
				SEQ5	ffiqapsnrvmipatigtamykllkhsrvr	SEQ35	saisdvfegrevcqpkrirpfhppgspwan
SEQ6	aytyskvlgvdraaimasgkqvvehlnrme	SEQ36	rplpaslaptptgpvhepvgsltpapvprp
				SEQ7	kegllsskfkafckwvftypvleemfqtmv	SEQ37	ldpapavtpeashlledpdeetsqavkalr
SEQ8	ssktghltddvkdvraliktlprasyssha	SEQ38	emadtvipqkeeaaicgqmdlnhppprghl
				SEQ9	gqrsyvsgvlpacllstkskavetpilvsg	SEQ39	deltttlesmtedlnldspltpelneildt
SEQ10	adrmdeelmgndggashtearysesgqfha	SEQ40	flndecllhamhistglsifdtslf
				SEQ11	ftdeleslpsptmplkpgaqsadcgdssss	SEQ41	qlgslvsdycnvlnkeftagsveitlrsyk
SEQ12	ssdsgnsdteqsereearaeaprlrapksr	SEQ42	ickafineakahgrewgglmatlnicnfwa
				SEQ13	rtsrpnrgqtpcpsnaeepeqpwiaavhqe	SEQ43	ilrnnrvrrraenagndacsiacpivmryv
SEQ14	sderpifphpskptflppvkrkkglrdsre	SEQ44	ldhlivvtdrffiqapsnrvmipatigtam
				SEQ15	gmflpkpeagsaisdvfegrevcqpkrirp	SEQ45	ykllkhsrvraytyskvlgvdraaimasgk
SEQ16	fhppgspwanrplpaslaptptgpvhepvg	SEQ46	qvvehlnrmekegllsskfkafckwvftyp
				SEQ17	sltpapvprpldpapavtpeashlledpde	SEQ47	vleemfqtmvssktghltddvkdvralikt
SEQ18	etsqavkalremadtvipqkeeaaicgqmd	SEQ48	lprasysshagqrsyvsgvlpacllstksk
				SEQ19	lnhppprghldeltttlesmtedlnldspl	SEQ49	avetpilvsgadrmdeelmgndggashtea
SEQ20	tpelneildtflndecllhamhistglsifdtslf	SEQ50	rysesgqfhaftdeleslpsptmplkpgaq
				SEQ21	flrltpeikkqlgslvsdycnvlnkeftag	SEQ51	sadcgdssssssdsgnsdteqsereearae
SEQ22	sveitlrsykickafineakahgrewgglm	SEQ52	aprlrapksrrtsrpnrgqtpcpsnaeepe
				SEQ23	atlnicnfwailrnnrvrrraenagndacs	SEQ53	qpwiaavhqesderpifphpskptflppvk
SEQ24	iacpivmryvldhlivvtdrffiqapsnrv	SEQ54	rkkglrdsregmflpkpeagsaisdvfegr
				SEQ25	mipatigtamykllkhsrvraytyskvlgv	SEQ55	evcqpkrirpfhppgspwanrplpaslapt
SEQ26	draaimasgkqvvehlnrmekegllsskfk	SEQ56	ptgpvhepvgsltpapvprpldpapavtpe
				SEQ27	afckwvftypvleemfqtmvssktghltdd	SEQ57	ashlledpdeetsqavkalremadtvipqk
SEQ28	vkdvraliktlprasysshagqrsyvsgvl	SEQ58	eeaaicgqmdlnhppprghldeltttlesm
				SEQ29	pacllstkskavetpilvsgadrmdeelmg	SEQ59	tedlnldspltpelneildtflndecllha
SEQ30	ndggashtearysesgqfhaftdeleslps	SEQ60	mhistglsifdtslf

委托生工生物工程（上海）有限公司对表1所示的60条多肽序列进行人工合成，然后用这60种不同的多肽分别测定100例正常体检血清样本和100例鼻咽癌确诊患者血清样本，计算99%正常体检血清样本判定为阴性时的Cutoff，及鼻咽癌样本的检出率（即敏感性）。筛选敏感性较高的多肽序列。

测定方法如下：

（1）包被：含1.0 μg/ml SA（链酶亲和素，盘古生物）的包被缓冲液，100 μl/孔，加入微孔板中（NUNC，货号4361），2-8℃过夜；

（2）封闭：甩去包被缓冲液，加入200 μl/孔封闭液，2-8℃过夜；

（3）干燥：甩去封闭液，30℃，4小时干燥；

（4）加样：加入1.0 μg/ml 生物素标记的多肽溶液（SEQ1-SEQ60，生工生物）（1% BSA溶液稀释），100 μL/孔；

（5）加样：加入待测样本，10 μL/孔；

（6）孵育：37℃，30min；

（7）洗涤：甩去微孔板中的液体，加入清洗液，300 μL/孔，清洗5次；

（8）加样：加入羊抗人IgG-HRP（购于Jackson）（用1% BSA溶液稀释，稀释比例为1/20000），100 μL/孔；

（9）孵育：37℃，15min；

（10）洗涤：甩去微孔板中液体，加入清洗液，300 μL/孔，清洗5次；

（11）底物：加入化学发光底物A和底物B（Thermo，货号34080），各50μL/孔，避光反应5min，测定发光值（厦门天众达ECLIA-IIS型化学发光免疫分析仪），发光强度以相对光单位（RLU）表示。

结果判定：至少有99%正常体检血清样本判定为阴性时的RLU定义为Cutoff值，然后计算鼻咽癌样本的检出率，即敏感性。结果表明，SEQ12（77%）、SEQ18（72%）、SEQ39（82%）、SEQ40（73%）、SEQ56（76%）的敏感性较高（表2）。

表2. 60条多肽检测鼻咽癌的特异性和敏感性

抗原序列	特异性	敏感性	Cutoff	抗原序列	特异性	敏感性	Cutoff
								Rta试剂盒	99%	84%	21000	SEQ31	99%	51%	71600
SEQ1	99%	54%	59960	SEQ32	99%	64%	40350
								SEQ2	99%	45%	40670	SEQ33	99%	53%	60550
SEQ3	99%	67%	65140	SEQ34	99%	40%	63850
								SEQ4	99%	55%	45420	SEQ35	99%	57%	16220
SEQ5	99%	65%	41880	SEQ36	99%	37%	39080
								SEQ6	99%	46%	26680	SEQ37	99%	39%	72800
SEQ7	99%	70%	52280	SEQ38	99%	44%	34240
								SEQ8	99%	57%	52820	SEQ39	99%	82%	35060
SEQ9	99%	45%	20960	SEQ40	99%	73%	30960
								SEQ10	99%	55%	62200	SEQ41	99%	60%	34400
SEQ11	99%	53%	44590	SEQ42	99%	40%	56680
								SEQ12	99%	77%	23370	SEQ43	99%	43%	40140
SEQ13	99%	48%	39890	SEQ44	99%	60%	30500
								SEQ14	99%	37%	35870	SEQ45	99%	57%	58030
SEQ15	99%	48%	61920	SEQ46	99%	71%	74810
								SEQ16	99%	67%	34770	SEQ47	99%	70%	33390
SEQ17	99%	50%	23520	SEQ48	99%	55%	31140
								SEQ18	99%	72%	37430	SEQ49	99%	67%	19980
SEQ19	99%	57%	33300	SEQ50	99%	42%	73920
								SEQ20	99%	64%	32460	SEQ51	99%	55%	38450
SEQ21	99%	62%	70490	SEQ52	99%	72%	32980
								SEQ22	99%	36%	69220	SEQ53	99%	67%	43610
SEQ23	99%	60%	48590	SEQ54	99%	45%	61550
								SEQ24	99%	70%	60440	SEQ55	99%	40%	71250
SEQ25	99%	50%	64130	SEQ56	99%	76%	58480
								SEQ26	99%	59%	33630	SEQ57	99%	38%	73170
SEQ27	99%	56%	34640	SEQ58	99%	50%	47200
								SEQ28	99%	71%	49060	SEQ59	99%	59%	61590
SEQ29	99%	62%	65550	SEQ60	99%	42%	21390
								SEQ30	99%	54%	18800

注：Rta试剂盒为同昕生物技术（北京）有限公司生产的EB病毒Rta蛋白抗体IgG检测试剂盒（酶联免疫法），产品编号A-0348／A-0396，国械注准20173400657。特异性的计算公式：特异性%=判定为阴性的正常体检血清样本数量/正常体检血清样本数量。

实施例2. 多肽序列的组合

通过对比实施例1中的测定结果，选择敏感性较高的多肽序列，将选定的序列按照Cutoff值RLU比例进行混合，制备混合多肽序列，然后通过测定100例正常体检血清样本和100例鼻咽癌确诊患者血清样本进一步评估试剂的敏感性和特异性，测定方法同实施例1。

结果表明，选定的多肽序列SEQ12、SEQ18、SEQ39、SEQ40、SEQ56按照SEQ12：SEQ18：SEQ39：SEQ40：SEQ56＝1：2：2：1：3的摩尔比混合后，具有很好的临床诊断性能，特异性和敏感性分别为98%和92%（表3）。

表3. 混合多肽的特异性和敏感性测定

编号	SEQ12：SEQ18：SEQ39：SEQ40：SEQ56	特异性	敏感性
				比例1	1：1：1：1：1	97%	79%
比例2	1：1：1：1：2	97%	81%
				比例3	1：2：2：1：2	97%	89%
比例4	1：2：2：1：3	98%	92%

实施例3. 多肽序列的串联表达

委托北京义翘神州生物技术有限公司用大肠杆菌（E.coli）表达系统对下列蛋白Pro1（序列62）、Pro2（序列63）、Pro3（序列64）进行基因合成、表达载体构建、蛋白表达和纯化。其中，通过对待表达蛋白Pro1、Pro2、Pro3的DNA序列进行基因合成，获得目的基因片段；采用连接酶连接目的基因片段与质粒，获得表达载体；采用热激法转化大肠杆菌，获得重组菌；培养重组菌，进行蛋白表达；表达的蛋白采用镍柱和谷胱甘肽柱进行亲和纯化，获得目的蛋白Pro1、Pro2、Pro3。

Pro1：SEQ12-SEQ18-SEQ18-SEQ39-SEQ39-SEQ40-SEQ56-SEQ56-SEQ56-His-GST；

Pro2：SEQ12-SEQ18-SEQ39-SEQ40-SEQ56-SEQ18-SEQ39-SEQ56-SEQ56-His-GST；

Pro3：SEQ12-SEQ18-SEQ39-SEQ40-SEQ56-His-GST。

分别使用Pro1、Pro2、Pro3蛋白包被微孔板，测定正常体检血清样本和鼻咽癌患者血清样本各100例，方法如下：

（1）包被：含1.0 μg/ml目的蛋白（Pro1／Pro2／Pro3）的包被缓冲液，100 μl/孔，加入微孔板中（NUNC，货号4361），2-8℃过夜；

（2）封闭：甩去包被缓冲液，加入封闭液，200 μl/孔，2-8℃过夜；

（3）干燥：甩去封闭液，30℃，4小时干燥；

（4）加样本稀释液：加入1% BSA溶液，100 μL/孔；

（5）加样：加入待测样本，10 μL/孔；

（6）孵育：37℃，30min；

（7）洗涤：甩去微孔板中液体，加入清洗液，300 μL/孔，清洗5次；

（8）加样：加入羊抗人IgG-HRP（购于Jackson，cat#109-035-008）（用1% BSA溶液稀释，稀释比例为1/20000），100 μL/孔；

（9）孵育：37℃，15min；

（10）洗涤：甩去微孔板中液体，加入清洗液，300 μL/孔，清洗5次；

（11）底物：加入化学发光底物A和底物B（Thermo，货号34080），各50 μL/孔，避光反应5min，测定发光值（厦门天众达ECLIA-IIS型化学发光免疫分析仪），发光强度以相对光单位（RLU）表示。

结果判定：至少有99%正常体检血清样本判定为阴性时，鼻咽癌样本的检出率，即敏感性。结果表明，蛋白Pro1与Pro2的敏感性和特异性相当，蛋白Pro3的敏感性较差（表4）。

表4. 三种重组蛋白的特异性和敏感性检测结果

重组蛋白	特异性	敏感性
			Pro1	98%	92%
Pro2	98%	91%
			Pro3	97%	78%

实施例4. 用于鼻咽癌检测的试剂盒制备

1、包被蛋白和二抗的选择

分别使用实施例3制备的蛋白Pro1、Pro2、Pro3包被微孔板，对100例正常体检血清样本和100例鼻咽癌患者血清样本进行检测，分别测定特异性IgG、IgA、IgM、IgG+IgM、IgG+IgM+IgA，筛选敏感性高的包被蛋白和二抗。

测定方法如下：

（1）包被：含1.0 μg/ml目的蛋白（Pro1／Pro2／Pro3）的包被缓冲液，100 μl/孔，加入微孔板中（NUNC，货号4361），2-8℃过夜；

（2）封闭：甩去包被缓冲液，加入封闭液，200 μl/孔，2-8℃过夜；

（3）干燥：甩去封闭液，30℃，4小时干燥；

（4）加样本稀释液：加入1% BSA溶液，100 μL/孔；

（5）加样：加入待测样本，10 μL/孔；

（6）孵育：37℃，30min；

（7）洗涤：甩去微孔板中的液体，加入清洗液，300 μL/孔，清洗5次；

（8）加样：加入羊抗人IgG-HRP/羊抗人IgA-HRP/羊抗人IgM-HRP/羊抗人（IgG+IgM）-HRP/羊抗人（IgG+IgM+IgA）-HRP（用1% BSA溶液稀释，稀释比例为1/20000），100 μL/孔；

（9）孵育：37℃，15min；

（10）洗涤：甩去微孔板中液体，加入清洗液，300 μL/孔，清洗5次；

（11）底物：加入化学发光底物A和底物B（Thermo，货号34080），各50 μL/孔，避光反应5min，测定发光值（厦门天众达ECLIA-IIS型化学发光免疫分析仪），发光强度以相对光单位（RLU）表示。

结果判定：至少有98%正常体检血清样本判定为阴性时，鼻咽癌样本的检出率，即敏感性，敏感性越高，代表试剂盒性能越好。结果表明：采用Pro1或Pro2作为包被蛋白，测定特异性IgG，试剂盒具有较好的敏感性（表5）。

表5. 试剂盒的特异性和敏感性结果

重组蛋白	二抗	特异性	敏感性
				Pro1	羊抗人IgG-HRP	98%	92%
Pro1	羊抗人IgM-HRP	98%	20%
				Pro1	羊抗人IgA-HRP	98%	45%
Pro1	羊抗人（IgG+IgM）-HRP	98%	76%
				Pro1	羊抗人（IgG+IgM+IgA）-HRP	98%	85%
Pro2	羊抗人IgG-HRP	98%	91%
				Pro2	羊抗人IgM-HRP	98%	23%
Pro2	羊抗人IgA-HRP	98%	42%
				Pro2	羊抗人（IgG+IgM）-HRP	98%	78%
Pro2	羊抗人（IgG+IgM+IgA）-HRP	98%	84%
				Pro3	羊抗人IgG-HRP	98%	75%
Pro3	羊抗人IgM-HRP	98%	19%
				Pro3	羊抗人IgA-HRP	98%	35%
Pro3	羊抗人（IgG+IgM）-HRP	98%	53%
				Pro3	羊抗人（IgG+IgM+IgA）-HRP	98%	68%

2、蛋白包被浓度和二抗浓度的选择

分别使用蛋白Pro1、Pro2、Pro3包被微孔板，对100例正常体检血清样本和100例鼻咽癌患者血清样本进行测定，设置不同的包被蛋白浓度和羊抗人IgG-HRP浓度。

测定方法如下：

（1）包被：含0.01 μg/ml-10 μg/ml目的蛋白（Pro1／Pro2／Pro3）的包被缓冲液，100 μl/孔，加入微孔板中（NUNC，货号4361），2-8℃过夜；

（2）封闭：甩去包被缓冲液，加入封闭液，200 μl/孔，2-8℃过夜；

（3）干燥：甩去封闭液，30℃，4小时干燥；

（4）加样本稀释液：加入1% BSA溶液，100 μL/孔；

（5）加样：加入待测样本，10 μL/孔；

（6）孵育：37℃，30min；

（7）洗涤：甩去微孔板中的液体，加入清洗液，300 μL/孔，清洗5次；

（8）加样：加入羊抗人IgG-HRP（Jackson产品，cat#109-035-008，抗体浓度0.8mg/ml）（用1% BSA溶液稀释，稀释比例为1/1000，1/5000，1/20000，1/50000），100 μL/孔；

（9）孵育：37℃，15min；

（10）洗涤：甩去微孔板中的液体，加入清洗液，300 μL/孔，清洗5次；

（11）底物：加入化学发光底物A和底物B（Thermo，货号34080），各50 μL/孔，避光反应5min，测定发光值（厦门天众达ECLIA-IIS型化学发光免疫分析仪），发光强度以相对光单位（RLU）表示。

结果判定：至少有98%正常体检血清样本判定为阴性时，鼻咽癌样本的检出率，即敏感性，敏感性越高，代表试剂盒性能越好。结果表明，蛋白包被浓度为1.0 μg/ml，羊抗人IgG-HRP的工作浓度为0.04 μg/ml时，试剂盒性能最优（表6）。

表6. 不同包被蛋白浓度的特异性和敏感性检测结果

重组蛋白	包被蛋白浓度	羊抗人IgG-HRP稀释比例	特异性	敏感性
					Pro1	0.01 μg/ml	1/1k	98%	75%
Pro1	0.1 μg/ml	1/5k	98%	85%
					Pro1	1.0 μg/ml	1/2w	98%	92%
Pro1	10 μg/ml	1/5w	98%	91%
					Pro2	0.01 μg/ml	1/1k	98%	76%
Pro2	0.1 μg/ml	1/5k	98%	86%
					Pro2	1.0 μg/ml	1/2w	98%	91%
Pro2	10 μg/ml	1/5w	98%	89%
					Pro3	0.01 μg/ml	1/1k	98%	61%
Pro3	0.1 μg/ml	1/5k	98%	70%
					Pro3	1.0 μg/ml	1/2w	98%	75%
Pro3	10 μg/ml	1/5w	98%	74%

注：1/1k，1/5k，1/2w，1/5w分别表示按照1:1000，1:5000，1:20000，1:50000的比例对羊抗人IgG-HRP抗体（Jackson产品，cat#109-035-008，抗体浓度0.8mg/ml）进行稀释。

3、试剂盒的组装

试剂盒1：将包被有Pro1蛋白微孔板（制备方法同“蛋白包被浓度和二抗浓度的选择”中测定方法的步骤（1）～（3））、装有清洗液的试剂瓶、装有1% BSA的试剂瓶、装有阴性对照的血清管、装有阳性对照的血清管、装有羊抗人IgG-HRP的试剂瓶、装有化学发光底物A的试剂瓶、装有化学发光底物B的试剂瓶以及试剂盒使用说明书，全部装入试剂盒中。

试剂盒2：将包被有Pro2蛋白微孔板（制备方法同“蛋白包被浓度和二抗浓度的选择”中测定方法的步骤（1）～（3））、装有清洗液的试剂瓶、装有1% BSA的试剂瓶、装有阴性对照的血清管、装有阳性对照的血清管、装有羊抗人IgG-HRP的试剂瓶、装有化学发光底物A的试剂瓶、装有化学发光底物B的试剂瓶以及试剂盒使用说明书，全部装入试剂盒中。

试剂盒3：将包被有Pro3蛋白微孔板（制备方法同“蛋白包被浓度和二抗浓度的选择”中测定方法的步骤（1）～（3））、装有清洗液的试剂瓶、装有1% BSA的试剂瓶、装有阴性对照的血清管、装有阳性对照的血清管、装有羊抗人IgG-HRP的试剂瓶、装有化学发光底物A的试剂瓶、装有化学发光底物B的试剂瓶以及试剂盒使用说明书，全部装入试剂盒中。

以上试剂盒中，可以使用羊抗人IgG-ALP（碱性磷酸酶）替代羊抗人IgG-HRP，相应地，使用BCIP/NBT替代化学发光底物A和底物B。

试剂盒操作说明书

1)向微孔板中加入1% BSA溶液，100 μL/孔。

2)加入待测样本/阴性对照/阳性对照，10 μL/孔；37℃孵育30min。

3)甩去微孔板中的液体，加入清洗液，300 μL/孔，清洗5次。

4)加入羊抗人IgG-HRP（用1% BSA溶液稀释，稀释比例为1/20000），100 μL/孔；37℃孵育15min。

5)甩去微孔板中的液体，加入清洗液，300 μL/孔，清洗5次。

6)加入化学发光底物A和底物B，各50 μL/孔，避光反应5min。

7)测定发光值，发光强度以相对光单位（RLU）表示。

8)结果判定：待测样本测値≥阳性对照测値/3，则判定为阳性，否则为阴性。

序列表

<110> 同昕生物技术（北京）有限公司

<120> 用于鼻咽癌检测的重组Rta蛋白、试剂盒及其应用

<130> P190857-TXS

<160> 64

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Arg Pro Lys Lys Asp Gly Leu Glu Asp Phe Leu Arg Leu Thr Pro

1 5 10 15

Glu Ile Lys Lys Gln Leu Gly Ser Leu Val Ser Asp Tyr Cys

20 25 30

<210> 2

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Asn Val Leu Asn Lys Glu Phe Thr Ala Gly Ser Val Glu Ile Thr Leu

1 5 10 15

Arg Ser Tyr Lys Ile Cys Lys Ala Phe Ile Asn Glu Ala Lys

20 25 30

<210> 3

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ala His Gly Arg Glu Trp Gly Gly Leu Met Ala Thr Leu Asn Ile Cys

1 5 10 15

Asn Phe Trp Ala Ile Leu Arg Asn Asn Arg Val Arg Arg Arg

20 25 30

<210> 4

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Ala Glu Asn Ala Gly Asn Asp Ala Cys Ser Ile Ala Cys Pro Ile Val

1 5 10 15

Met Arg Tyr Val Leu Asp His Leu Ile Val Val Thr Asp Arg

20 25 30

<210> 5

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Phe Phe Ile Gln Ala Pro Ser Asn Arg Val Met Ile Pro Ala Thr Ile

1 5 10 15

Gly Thr Ala Met Tyr Lys Leu Leu Lys His Ser Arg Val Arg

20 25 30

<210> 6

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Ala Tyr Thr Tyr Ser Lys Val Leu Gly Val Asp Arg Ala Ala Ile Met

1 5 10 15

Ala Ser Gly Lys Gln Val Val Glu His Leu Asn Arg Met Glu

20 25 30

<210> 7

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Lys Glu Gly Leu Leu Ser Ser Lys Phe Lys Ala Phe Cys Lys Trp Val

1 5 10 15

Phe Thr Tyr Pro Val Leu Glu Glu Met Phe Gln Thr Met Val

20 25 30

<210> 8

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Ser Ser Lys Thr Gly His Leu Thr Asp Asp Val Lys Asp Val Arg Ala

1 5 10 15

Leu Ile Lys Thr Leu Pro Arg Ala Ser Tyr Ser Ser His Ala

20 25 30

<210> 9

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Gly Gln Arg Ser Tyr Val Ser Gly Val Leu Pro Ala Cys Leu Leu Ser

1 5 10 15

Thr Lys Ser Lys Ala Val Glu Thr Pro Ile Leu Val Ser Gly

20 25 30

<210> 10

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Ala Asp Arg Met Asp Glu Glu Leu Met Gly Asn Asp Gly Gly Ala Ser

1 5 10 15

His Thr Glu Ala Arg Tyr Ser Glu Ser Gly Gln Phe His Ala

20 25 30

<210> 11

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Phe Thr Asp Glu Leu Glu Ser Leu Pro Ser Pro Thr Met Pro Leu Lys

1 5 10 15

Pro Gly Ala Gln Ser Ala Asp Cys Gly Asp Ser Ser Ser Ser

20 25 30

<210> 12

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Ser Ser Asp Ser Gly Asn Ser Asp Thr Glu Gln Ser Glu Arg Glu Glu

1 5 10 15

Ala Arg Ala Glu Ala Pro Arg Leu Arg Ala Pro Lys Ser Arg

20 25 30

<210> 13

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Arg Thr Ser Arg Pro Asn Arg Gly Gln Thr Pro Cys Pro Ser Asn Ala

1 5 10 15

Glu Glu Pro Glu Gln Pro Trp Ile Ala Ala Val His Gln Glu

20 25 30

<210> 14

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Ser Asp Glu Arg Pro Ile Phe Pro His Pro Ser Lys Pro Thr Phe Leu

1 5 10 15

Pro Pro Val Lys Arg Lys Lys Gly Leu Arg Asp Ser Arg Glu

20 25 30

<210> 15

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Gly Met Phe Leu Pro Lys Pro Glu Ala Gly Ser Ala Ile Ser Asp Val

1 5 10 15

Phe Glu Gly Arg Glu Val Cys Gln Pro Lys Arg Ile Arg Pro

20 25 30

<210> 16

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Phe His Pro Pro Gly Ser Pro Trp Ala Asn Arg Pro Leu Pro Ala Ser

1 5 10 15

Leu Ala Pro Thr Pro Thr Gly Pro Val His Glu Pro Val Gly

20 25 30

<210> 17

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

Ser Leu Thr Pro Ala Pro Val Pro Arg Pro Leu Asp Pro Ala Pro Ala

1 5 10 15

Val Thr Pro Glu Ala Ser His Leu Leu Glu Asp Pro Asp Glu

20 25 30

<210> 18

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

Glu Thr Ser Gln Ala Val Lys Ala Leu Arg Glu Met Ala Asp Thr Val

1 5 10 15

Ile Pro Gln Lys Glu Ala Ala Ile Cys Gly Gln Met Asp

20 25

<210> 19

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

Leu Asn His Pro Pro Pro Arg Gly His Leu Asp Glu Leu Thr Thr Thr

1 5 10 15

Leu Glu Ser Met Thr Glu Asp Leu Asn Leu Asp Ser Pro Leu

20 25 30

<210> 20

<211> 35

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

Thr Pro Glu Leu Asn Glu Ile Leu Asp Thr Phe Leu Asn Asp Glu Cys

1 5 10 15

Leu Leu His Ala Met His Ile Ser Thr Gly Leu Ser Ile Phe Asp Thr

20 25 30

Ser Leu Phe

35

<210> 21

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

Phe Leu Arg Leu Thr Pro Glu Ile Lys Lys Gln Leu Gly Ser Leu Val

1 5 10 15

Ser Asp Tyr Cys Asn Val Leu Asn Lys Glu Phe Thr Ala Gly

20 25 30

<210> 22

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

Ser Val Glu Ile Thr Leu Arg Ser Tyr Lys Ile Cys Lys Ala Phe Ile

1 5 10 15

Asn Glu Ala Lys Ala His Gly Arg Glu Trp Gly Gly Leu Met

20 25 30

<210> 23

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

Ala Thr Leu Asn Ile Cys Asn Phe Trp Ala Ile Leu Arg Asn Asn Arg

1 5 10 15

Val Arg Arg Arg Ala Glu Asn Ala Gly Asn Asp Ala Cys Ser

20 25 30

<210> 24

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

Ile Ala Cys Pro Ile Val Met Arg Tyr Val Leu Asp His Leu Ile Val

1 5 10 15

Val Thr Asp Arg Phe Phe Ile Gln Ala Pro Ser Asn Arg Val

20 25 30

<210> 25

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

Met Ile Pro Ala Thr Ile Gly Thr Ala Met Tyr Lys Leu Leu Lys His

1 5 10 15

Ser Arg Val Arg Ala Tyr Thr Tyr Ser Lys Val Leu Gly Val

20 25 30

<210> 26

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

Asp Arg Ala Ala Ile Met Ala Ser Gly Lys Gln Val Val Glu His Leu

1 5 10 15

Asn Arg Met Glu Lys Glu Gly Leu Leu Ser Ser Lys Phe Lys

20 25 30

<210> 27

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

Val Lys Asp Val Arg Ala Leu Ile Lys Thr Leu Pro Arg Ala Ser Tyr

1 5 10 15

Ser Ser His Ala Gly Gln Arg Ser Tyr Val Ser Gly Val Leu

20 25 30

<210> 28

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

Val Lys Asp Val Arg Ala Leu Ile Lys Thr Leu Pro Arg Ala Ser Tyr

1 5 10 15

Ser Ser His Ala Gly Gln Arg Ser Tyr Val Ser Gly Val Leu

20 25 30

<210> 29

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

Pro Ala Cys Leu Leu Ser Thr Lys Ser Lys Ala Val Glu Thr Pro Ile

1 5 10 15

Leu Val Ser Gly Ala Asp Arg Met Asp Glu Glu Leu Met Gly

20 25 30

<210> 30

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

Asn Asp Gly Gly Ala Ser His Thr Glu Ala Arg Tyr Ser Glu Ser Gly

1 5 10 15

Gln Phe His Ala Phe Thr Asp Glu Leu Glu Ser Leu Pro Ser

20 25 30

<210> 31

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

Pro Thr Met Pro Leu Lys Pro Gly Ala Gln Ser Ala Asp Cys Gly Asp

1 5 10 15

Ser Ser Ser Ser Ser Ser Asp Ser Gly Asn Ser Asp Thr Glu

20 25 30

<210> 32

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

Gln Ser Glu Arg Glu Glu Ala Arg Ala Glu Ala Pro Arg Leu Arg Ala

1 5 10 15

Pro Lys Ser Arg Arg Thr Ser Arg Pro Asn Arg Gly Gln Thr

20 25 30

<210> 33

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

Pro Cys Pro Ser Asn Ala Glu Glu Pro Glu Gln Pro Trp Ile Ala Ala

1 5 10 15

Val His Gln Glu Ser Asp Glu Arg Pro Ile Phe Pro His Pro

20 25 30

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<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

Ser Lys Pro Thr Phe Leu Pro Pro Val Lys Arg Lys Lys Gly Leu Arg

1 5 10 15

Asp Ser Arg Glu Gly Met Phe Leu Pro Lys Pro Glu Ala Gly

20 25 30

<210> 35

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

Ser Ala Ile Ser Asp Val Phe Glu Gly Arg Glu Val Cys Gln Pro Lys

1 5 10 15

Arg Ile Arg Pro Phe His Pro Pro Gly Ser Pro Trp Ala Asn

20 25 30

<210> 36

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

Arg Pro Leu Pro Ala Ser Leu Ala Pro Thr Pro Thr Gly Pro Val His

1 5 10 15

Glu Pro Val Gly Ser Leu Thr Pro Ala Pro Val Pro Arg Pro

20 25 30

<210> 37

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

Leu Asp Pro Ala Pro Ala Val Thr Pro Glu Ala Ser His Leu Leu Glu

1 5 10 15

Asp Pro Asp Glu Glu Thr Ser Gln Ala Val Lys Ala Leu Arg

20 25 30

<210> 38

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

Glu Met Ala Asp Thr Val Ile Pro Gln Lys Glu Glu Ala Ala Ile Cys

1 5 10 15

Gly Gln Met Asp Leu Asn His Pro Pro Pro Arg Gly His Leu

20 25 30

<210> 39

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

Asp Glu Leu Thr Thr Thr Leu Glu Ser Met Thr Glu Asp Leu Asn Leu

1 5 10 15

Asp Ser Pro Leu Thr Pro Glu Leu Asn Glu Ile Leu Asp Thr

20 25 30

<210> 40

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

Phe Leu Asn Asp Glu Cys Leu Leu His Ala Met His Ile Ser Thr Gly

1 5 10 15

Leu Ser Ile Phe Asp Thr Ser Leu Phe

20 25

<210> 41

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

Gln Leu Gly Ser Leu Val Ser Asp Tyr Cys Asn Val Leu Asn Lys Glu

1 5 10 15

Phe Thr Ala Gly Ser Val Glu Ile Thr Leu Arg Ser Tyr Lys

20 25 30

<210> 42

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

Ile Cys Lys Ala Phe Ile Asn Glu Ala Lys Ala His Gly Arg Glu Trp

1 5 10 15

Gly Gly Leu Met Ala Thr Leu Asn Ile Cys Asn Phe Trp Ala

20 25 30

<210> 43

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

Ile Leu Arg Asn Asn Arg Val Arg Arg Arg Ala Glu Asn Ala Gly Asn

1 5 10 15

Asp Ala Cys Ser Ile Ala Cys Pro Ile Val Met Arg Tyr Val

20 25 30

<210> 44

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

Leu Asp His Leu Ile Val Val Thr Asp Arg Phe Phe Ile Gln Ala Pro

1 5 10 15

Ser Asn Arg Val Met Ile Pro Ala Thr Ile Gly Thr Ala Met

20 25 30

<210> 45

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

Tyr Lys Leu Leu Lys His Ser Arg Val Arg Ala Tyr Thr Tyr Ser Lys

1 5 10 15

Val Leu Gly Val Asp Arg Ala Ala Ile Met Ala Ser Gly Lys

20 25 30

<210> 46

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

Gln Val Val Glu His Leu Asn Arg Met Glu Lys Glu Gly Leu Leu Ser

1 5 10 15

Ser Lys Phe Lys Ala Phe Cys Lys Trp Val Phe Thr Tyr Pro

20 25 30

<210> 47

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

Val Leu Glu Glu Met Phe Gln Thr Met Val Ser Ser Lys Thr Gly His

1 5 10 15

Leu Thr Asp Asp Val Lys Asp Val Arg Ala Leu Ile Lys Thr

20 25 30

<210> 48

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

Leu Pro Arg Ala Ser Tyr Ser Ser His Ala Gly Gln Arg Ser Tyr Val

1 5 10 15

Ser Gly Val Leu Pro Ala Cys Leu Leu Ser Thr Lys Ser Lys

20 25 30

<210> 49

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

Ala Val Glu Thr Pro Ile Leu Val Ser Gly Ala Asp Arg Met Asp Glu

1 5 10 15

Glu Leu Met Gly Asn Asp Gly Gly Ala Ser His Thr Glu Ala

20 25 30

<210> 50

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

Arg Tyr Ser Glu Ser Gly Gln Phe His Ala Phe Thr Asp Glu Leu Glu

1 5 10 15

Ser Leu Pro Ser Pro Thr Met Pro Leu Lys Pro Gly Ala Gln

20 25 30

<210> 51

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 51

Ser Ala Asp Cys Gly Asp Ser Ser Ser Ser Ser Ser Asp Ser Gly Asn

1 5 10 15

Ser Asp Thr Glu Gln Ser Glu Arg Glu Glu Ala Arg Ala Glu

20 25 30

<210> 52

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 52

Ala Pro Arg Leu Arg Ala Pro Lys Ser Arg Arg Thr Ser Arg Pro Asn

1 5 10 15

Arg Gly Gln Thr Pro Cys Pro Ser Asn Ala Glu Glu Pro Glu

20 25 30

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 53

Gln Pro Trp Ile Ala Ala Val His Gln Glu Ser Asp Glu Arg Pro Ile

1 5 10 15

Phe Pro His Pro Ser Lys Pro Thr Phe Leu Pro Pro Val Lys

20 25 30

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 54

Arg Lys Lys Gly Leu Arg Asp Ser Arg Glu Gly Met Phe Leu Pro Lys

1 5 10 15

Pro Glu Ala Gly Ser Ala Ile Ser Asp Val Phe Glu Gly Arg

20 25 30

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<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 55

Glu Val Cys Gln Pro Lys Arg Ile Arg Pro Phe His Pro Pro Gly Ser

1 5 10 15

Pro Trp Ala Asn Arg Pro Leu Pro Ala Ser Leu Ala Pro Thr

20 25 30

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<212> PRT

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<400> 56

Pro Thr Gly Pro Val His Glu Pro Val Gly Ser Leu Thr Pro Ala Pro

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Val Pro Arg Pro Leu Asp Pro Ala Pro Ala Val Thr Pro Glu

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<212> PRT

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<400> 57

Ala Ser His Leu Leu Glu Asp Pro Asp Glu Glu Thr Ser Gln Ala Val

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Lys Ala Leu Arg Glu Met Ala Asp Thr Val Ile Pro Gln Lys

20 25 30

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<212> PRT

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<400> 58

Glu Glu Ala Ala Ile Cys Gly Gln Met Asp Leu Asn His Pro Pro Pro

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Arg Gly His Leu Asp Glu Leu Thr Thr Thr Leu Glu Ser Met

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<212> PRT

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<400> 59

Thr Glu Asp Leu Asn Leu Asp Ser Pro Leu Thr Pro Glu Leu Asn Glu

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Ile Leu Asp Thr Phe Leu Asn Asp Glu Cys Leu Leu His Ala

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<211> 15

<212> PRT

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Met His Ile Ser Thr Gly Leu Ser Ile Phe Asp Thr Ser Leu Phe

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 61

Met Arg Pro Lys Lys Asp Gly Leu Glu Asp Phe Leu Arg Leu Thr Pro

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Glu Ile Lys Lys Gln Leu Gly Ser Leu Val Ser Asp Tyr Cys Asn Val

20 25 30

Leu Asn Lys Glu Phe Thr Ala Gly Ser Val Glu Ile Thr Leu Arg Ser

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His Leu Ile Val Val Thr Asp Arg Phe Phe Ile Gln Ala Pro Ser Asn

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Arg Val Met Ile Pro Ala Thr Ile Gly Thr Ala Met Tyr Lys Leu Leu

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Lys His Ser Arg Val Arg Ala Tyr Thr Tyr Ser Lys Val Leu Gly Val

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Asp Arg Ala Ala Ile Met Ala Ser Gly Lys Gln Val Val Glu His Leu

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Met Val Ser Ser Lys Thr Gly His Leu Thr Asp Asp Val Lys Asp Val

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Gly Gln Arg Ser Tyr Val Ser Gly Val Leu Pro Ala Cys Leu Leu Ser

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Arg Met Asp Glu Glu Leu Met Gly Asn Asp Gly Gly Ala Ser His Thr

275 280 285

Glu Ala Arg Tyr Ser Glu Ser Gly Gln Phe His Ala Phe Thr Asp Glu

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Ser Ala Asp Cys Gly Asp Ser Ser Ser Ser Ser Ser Asp Ser Gly Asn

325 330 335

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<211> 511

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 62

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Ile Ser Thr Gly Leu Ser Ile Phe Asp Thr Ser Leu Phe Pro Thr Gly

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Pro Val His Glu Pro Val Gly Ser Leu Thr Pro Ala Pro Val Pro Arg

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Asp Pro Ala Pro Ala Val Thr Pro Glu Pro Thr Gly Pro Val His Glu

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Pro Val Gly Ser Leu Thr Pro Ala Pro Val Pro Arg Pro Leu Asp Pro

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Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro Thr Arg Leu

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Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys Leu Thr Gln

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Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn Met Leu Gly

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Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu Gly Ala Val

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Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser Lys Asp Phe

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Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu Met Leu Lys

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Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn Gly Asp His

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Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu Val Cys Phe

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Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly

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<400> 63

Ser Ser Asp Ser Gly Asn Ser Asp Thr Glu Gln Ser Glu Arg Glu Glu

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Ala Pro Val Pro Arg Pro Leu Asp Pro Ala Pro Ala Val Thr Pro Glu

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Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu Val Cys Phe

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Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala Thr Phe Gly

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Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 64

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115 120 125

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130 135 140

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Lys Gly Leu Val Gln Pro Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu

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180 185 190

Asn Lys Lys Phe Glu Leu Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr

195 200 205

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210 215 220

Ile Ala Asp Lys His Asn Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala

225 230 235 240

Glu Ile Ser Met Leu Glu Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val

245 250 255

Ser Arg Ile Ala Tyr Ser Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe

260 265 270

Leu Ser Lys Leu Pro Glu Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys

275 280 285

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290 295 300

Leu Tyr Asp Ala Leu Asp Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu

305 310 315 320

Asp Ala Phe Pro Lys Leu Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile

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Leu Gln Gly Trp Gln Ala Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys

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Ser Asp Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Leu Gly Ser Pro Glu Phe

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385 390