具体实施方式

本发明提供了EB病毒BALF4蛋白的抗原表位，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明中所述“抗原表位”(epitope)又称抗原决定簇或抗原决定基，是指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团。本发明的抗原表位是一段包含191个氨基酸残基的多肽片段，因此，在本发明中，所述抗原表位、表位、多肽交替使用。

本发明中，所述“核酸分子”是指有多个核苷酸聚合形成的生物大分子化合物，所述核苷酸可为核糖核酸或脱氧核糖核酸以及它们的修饰物，包括双链或单链的DNA、cDNA、RNA、mRNA等，其可为环状也可为线性，也可为环状载体中的一部分或基因组中的一个片段。

本发明中，所述“核酸载体”是指重组DNA分子，其包含期望的编码序列和对可操作连接的编码基因在具体宿主生物内的表达所必不可少的合适的核酸序列。对原核细胞中的表达必需的核酸序列包括启动子，任选包括操纵基因序列，核糖体结合位点及可能的其它序列。已知原核细胞利用启动子，增强予以及终止和多腺苷酸化信号。一经转化进入合适的宿主，载体可以独立于宿主基因组进行复制和发挥作用，或者，在一些情况下，自己整合进入基因组。在本说明书中，“质粒”和“载体”有时可以交换通用，因为质粒是当前最普遍使用的载体形式。然而，本发明意图包括表达载体的这样的其它形式，其发挥等价作用，其在本领域是已知的或将变为已知的，包括但不限于：质粒，噬菌体颗粒，病毒载体和/或仅为潜在的基因组插入物。

本发明中，“宿主细胞”一般为含有核酸载体和/或感兴趣基因的原核或真核宿主。用使用重组DNA技术构建的载体转化或转染宿主细胞。这样的转化宿主细胞有能力复制编码蛋白质的载体或表达期望蛋白质。

本发明中，所述治疗性抗体是指能够通过中和作用、示踪或导向作用、竞争性抑制作用/拮抗作用、抗体依赖性细胞街道的细胞毒效应及补体依赖性细胞溶解作用、通过内影像作用模拟抗原等机制发挥治疗作用的抗体。

本发明中，所述免疫学检测是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色，来对定性、定量或定位研究细胞内抗原(多肽和蛋白质)，或抗体的技术，这样的技术包括但不限于酶联免疫分析法、免疫荧光、放射免疫分析法、免疫印迹、免疫组化、免疫共沉淀、染色质共沉淀等。

本发明中，所述固相支持物是指本文所述的抗原表位、特异性抗体和/或抗原蛋白能够附着至其上的任何支持物，包括但不限于硝酸纤维素膜、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、iPDMS芯片、微孔板、微粒、微载体、凝胶等。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例

一、本发明通过对31例EB病毒阳性的NK/T细胞淋巴瘤患者的WGS数据进行分析检测其中EB病毒序列，提取BALF4的序列信息，标识单个核苷酸变异位点及氨基酸变异位点，与B95-8参考序列进行比对，标识变化氨基酸，确定病毒保守序列(核酸序列如SEQ ID NO：4所示，蛋白序列如SEQ ID NO：3所示)，

2、比较不同EB病毒株之间BALF4基因碱基序列及氨基酸序列的保守性(图1)，结果表明，在Human gammaherpesvims 4中，分析基因的特异性不同病毒株BALF4序列与上述参考序列间相似性高达99％，考虑到病毒基因组具有较高的可变性，本申请基于相对保守的全外显子序列，筛选BALF3抗原区段。以该区段序列为基础设计制备的抗体具有较可靠的检测效力，可避免因感染病毒株亚型不同引起的假阴性结果。

3、比较临床样本中EB病毒株序列与上述参考序列间的保守性(图2)：NK/T细胞淋巴瘤发病与EB病毒感染密切相关。通过对31例EB病毒阳性的NK/T细胞淋巴瘤患者的WGS数据进行分析检测其中EB病毒序列，提取BALF4的序列信息，标识单个核苷酸变异位点及氨基酸变异位点，与B95-8参考序列进行比对，标识变化氨基酸。

二、蛋白可表达性分析

(1)跨膜结构分析：图3

(2)翻译后修饰：图4

(3)保守结构域：图5

(4)三级结构预测：图6

(4)二级结构预测：图7

三、蛋白抗原性分析

(1)抗原表位预测(图8)

(2)抗原区域选择

-245-400aa(SEQ ID NO：1)：该区段不含突变氨基酸位点，免疫原性较好二级结构稳定易于表达，建议构到pGEX4T-AB1载体，采用大肠杆菌原核系统表达蛋白制备抗原。

四、抗体合成和功效验证

(1)抗原表达质粒制备

BALF4(245-400aa)PCR产物电泳鉴定大小正确，成功克隆到pGEX-4T-AB1载体上，并测序鉴定正确(图9)。

(2)抗原蛋白表达

重组质粒转化入表达菌株E.coli Rosetta，表达诱导条件：培养到OD600nm 0.5-0.6加入0.8mM IPTG 37℃诱导4小时

结果分析(图10)：

1.pGEX-4T-AB1-BALF4(245-400aa)表达在包涵体中。

2.包涵体蛋白浓度为8mg/mL，纯度达到免疫要求，转交免疫。

(3)兔免疫

流程如下：

(4)抗血清ELISA检查，设置不添加抗体或血清的空白对照组，以及添加抗体但不添加血清的阴性对照，以及添加血清以及不同浓度抗体的实验组。实验采用上述构建获得的两株抗体，分别记为BALF3-E11787、BALF3-E11788，检测结果如图7。结果表明，两株抗体皆表现出良好效价。

(5)抗血清纯化

-亲和纯化用pGEX-4T-AB1-BALF4蛋白经检测，浓度为6mg/ml，与破菌纯化后浓度和纯度差异不大，可进行抗原亲和纯化。

-抗血清用pGEX-4T-AB1-BALF4蛋白作抗原亲和纯化后，得到浓缩后的抗体：E11443的浓度为2.93mg/ml；E11444的浓度为1.96mg/ml。

(6)抗原western blot检测

利用纯化后的抗体对抗原进行检测，结果如图11，结果表明：

结果分析：

1、E11443、E11444抗体检测抗原条带大小在45KDa左右；

2、E11443、E11444抗体1：1000稀释可检测到500pg抗原；

3、E11443、E11444抗体浓度正常。

如上结果表明，本发明设计获得的抗原表位能够特异性的检测BALF3蛋白，且抗体具有良好的效价。

(7)特异性验证

以上述抗体对于不含病毒蛋白样本进行检测，检测结果为阴性(图12)，如图所示：BALF4理论大小为95,639Da，红色方框中所示应为目的蛋白的印记。说明：B95-8为可分泌EBV的细胞株，可检测到内源性表达BALF4(阳性对照)，SNK6无EBV成分细胞株，未检测到BALF4(阴性对照)。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 上海交通大学医学院附属瑞金医院

<120> EB病毒BALF4蛋白的抗原表位

<130> MP1914456

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 156

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

His Glu Arg Ala Asp Ser Phe His Val Arg Thr Asn Tyr Lys Ile Val

1 5 10 15

Asp Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Asn Pro Gln Gly Glu Arg Arg Ala Phe

20 25 30

Leu Asp Lys Gly Thr Tyr Thr Leu Ser Trp Lys Leu Glu Asn Arg Thr

35 40 45

Ala Tyr Cys Pro Leu Gln His Trp Gln Thr Phe Asp Ser Thr Ile Ala

50 55 60

Thr Glu Thr Gly Lys Ser Ile His Phe Val Thr Asp Glu Gly Thr Ser

65 70 75 80

Ser Phe Val Thr Asn Thr Thr Val Gly Ile Glu Leu Pro Asp Ala Phe

85 90 95

Lys Cys Ile Glu Glu Gln Val Asn Lys Thr Met His Glu Lys Tyr Glu

100 105 110

Ala Val Gln Asp Arg Tyr Thr Lys Gly Gln Glu Ala Ile Thr Tyr Phe

115 120 125

Ile Thr Ser Gly Gly Leu Leu Leu Ala Trp Leu Pro Leu Thr Pro Arg

130 135 140

Ser Leu Ala Thr Val Lys Asn Leu Thr Glu Leu Thr

145 150 155

<210> 2

<211> 468

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

catgagcggg cagactcctt ccacgtgaga actaactaca agatagtgga ctacgacaac 60

cgagggacga acccgcaagg cgaacgccga gccttcctgg acaagggcac ttacacgcta 120

tcttggaagc tcgagaacag gacagcctac tgcccgcttc aacactggca aacctttgac 180

tcgaccatcg ccacagaaac agggaagtca atacattttg tgactgacga gggcacctct 240

agcttcgtga ccaacacaac cgtgggcata gagctcccgg acgccttcaa gtgcatcgaa 300

gagcaggtga acaagaccat gcatgagaag tacgaggccg tccaggatcg ttacacgaag 360

ggccaggaag ccattacata ttttataacg agcggaggat tgttattagc ttggctacct 420

ctgaccccgc gctcgttggc caccgtcaag aacctgacgg agcttacc 468

<210> 3

<211> 857

<212> PRT

<213> EB病毒(Epstein-Barr virus)

<400> 3

Met Thr Arg Arg Arg Val Leu Ser Val Val Val Leu Leu Ala Ala Leu

1 5 10 15

Ala Cys Arg Leu Gly Ala Gln Thr Pro Glu Gln Pro Ala Pro Pro Ala

20 25 30

Thr Thr Val Gln Pro Thr Ala Thr Arg Gln Gln Thr Ser Phe Pro Phe

35 40 45

Arg Val Cys Glu Leu Ser Ser His Gly Asp Leu Phe Arg Phe Ser Ser

50 55 60

Asp Ile Gln Cys Pro Ser Phe Gly Thr Arg Glu Asn His Thr Glu Gly

65 70 75 80

Leu Leu Met Val Phe Lys Asp Asn Ile Ile Pro Tyr Ser Phe Lys Val

85 90 95

Arg Ser Tyr Thr Lys Ile Val Thr Asn Ile Leu Ile Tyr Asn Gly Trp

100 105 110

Tyr Ala Asp Ser Val Thr Asn Arg His Glu Glu Lys Phe Ser Val Asp

115 120 125

Ser Tyr Glu Thr Asp Gln Met Asp Thr Ile Tyr Gln Cys Tyr Asn Ala

130 135 140

Val Lys Met Thr Lys Asp Gly Leu Thr Arg Val Tyr Val Asp Arg Asp

145 150 155 160

Gly Val Asn Ile Thr Val Asn Leu Lys Pro Thr Gly Gly Leu Ala Asn

165 170 175

Gly Val Arg Arg Tyr Ala Ser Gln Thr Glu Leu Tyr Asp Ala Pro Gly

180 185 190

Trp Leu Ile Trp Thr Tyr Arg Thr Arg Thr Thr Val Asn Cys Leu Ile

195 200 205

Thr Asp Met Met Ala Lys Ser Asn Ser Pro Phe Asp Phe Phe Val Thr

210 215 220

Thr Thr Gly Gln Thr Val Glu Met Ser Pro Phe Tyr Asp Gly Lys Asn

225 230 235 240

Lys Glu Thr Phe His Glu Arg Ala Asp Ser Phe His Val Arg Thr Asn

245 250 255

Tyr Lys Ile Val Asp Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Asn Pro Gln Gly Glu

260 265 270

Arg Arg Ala Phe Leu Asp Lys Gly Thr Tyr Thr Leu Ser Trp Lys Leu

275 280 285

Glu Asn Arg Thr Ala Tyr Cys Pro Leu Gln His Trp Gln Thr Phe Asp

290 295 300

Ser Thr Ile Ala Thr Glu Thr Gly Lys Ser Ile His Phe Val Thr Asp

305 310 315 320

Glu Gly Thr Ser Ser Phe Val Thr Asn Thr Thr Val Gly Ile Glu Leu

325 330 335

Pro Asp Ala Phe Lys Cys Ile Glu Glu Gln Val Asn Lys Thr Met His

340 345 350

Glu Lys Tyr Glu Ala Val Gln Asp Arg Tyr Thr Lys Gly Gln Glu Ala

355 360 365

Ile Thr Tyr Phe Ile Thr Ser Gly Gly Leu Leu Leu Ala Trp Leu Pro

370 375 380

Leu Thr Pro Arg Ser Leu Ala Thr Val Lys Asn Leu Thr Glu Leu Thr

385 390 395 400

Thr Pro Thr Ser Ser Pro Pro Ser Ser Pro Ser Pro Pro Ala Pro Ser

405 410 415

Ala Ala Arg Gly Ser Thr Pro Ala Ala Val Leu Arg Arg Arg Arg Arg

420 425 430

Asp Ala Gly Asn Ala Thr Thr Pro Val Pro Pro Thr Ala Pro Gly Lys

435 440 445

Ser Leu Gly Thr Leu Asn Asn Pro Ala Thr Val Gln Ile Gln Phe Ala

450 455 460

Tyr Asp Ser Leu Arg Arg Gln Ile Asn Arg Met Leu Gly Asp Leu Ala

465 470 475 480

Arg Ala Trp Cys Leu Glu Gln Lys Arg Gln Asn Met Val Leu Arg Glu

485 490 495

Leu Thr Lys Ile Asn Pro Thr Thr Val Met Ser Ser Ile Tyr Gly Lys

500 505 510

Ala Val Ala Ala Lys Arg Leu Gly Asp Val Ile Ser Val Ser Gln Cys

515 520 525

Val Pro Val Asn Gln Ala Thr Val Thr Leu Arg Lys Ser Met Arg Val

530 535 540

Pro Gly Ser Glu Thr Met Cys Tyr Ser Arg Pro Leu Val Ser Phe Ser

545 550 555 560

Phe Ile Asn Asp Thr Lys Thr Tyr Glu Gly Gln Leu Gly Thr Asp Asn

565 570 575

Glu Ile Phe Leu Thr Lys Lys Met Thr Glu Val Cys Gln Ala Thr Ser

580 585 590

Gln Tyr Tyr Phe Gln Ser Gly Asn Glu Ile His Val Tyr Asn Asp Tyr

595 600 605

His His Phe Lys Thr Ile Glu Leu Asp Gly Ile Ala Thr Leu Gln Thr

610 615 620

Phe Ile Ser Leu Asn Thr Ser Leu Ile Glu Asn Ile Asp Phe Ala Ser

625 630 635 640

Leu Glu Leu Tyr Ser Arg Asp Glu Gln Arg Ala Ser Asn Val Phe Asp

645 650 655

Leu Glu Gly Ile Phe Arg Glu Tyr Asn Phe Gln Ala Gln Asn Ile Ala

660 665 670

Gly Leu Arg Lys Asp Leu Asp Asn Ala Val Ser Asn Gly Arg Asn Gln

675 680 685

Phe Val Asp Gly Leu Gly Glu Leu Met Asp Ser Leu Gly Ser Val Gly

690 695 700

Gln Ser Ile Thr Asn Leu Val Ser Thr Val Gly Gly Leu Phe Ser Ser

705 710 715 720

Leu Val Ser Gly Phe Ile Ser Phe Phe Lys Asn Pro Phe Gly Gly Met

725 730 735

Leu Ile Leu Val Leu Val Ala Gly Val Val Ile Leu Val Ile Ser Leu

740 745 750

Thr Arg Arg Thr Arg Gln Met Ser Gln Gln Pro Val Gln Met Leu Tyr

755 760 765

Pro Gly Ile Asp Glu Leu Ala Gln Gln His Ala Ser Gly Glu Gly Pro

770 775 780

Gly Ile Asn Pro Ile Ser Lys Thr Glu Leu Gln Ala Ile Met Leu Ala

785 790 795 800

Leu His Glu Gln Asn Gln Glu Gln Lys Arg Ala Ala Gln Arg Ala Ala

805 810 815

Gly Pro Ser Val Ala Ser Arg Ala Leu Gln Ala Ala Arg Asp Arg Phe

820 825 830

Pro Gly Leu Arg Arg Arg Arg Tyr His Asp Pro Glu Thr Ala Ala Ala

835 840 845

Leu Leu Gly Glu Ala Glu Thr Glu Phe

850 855

<210> 4

<211> 3054

<212> DNA

<213> EB病毒(Epstein-Barr virus)

<400> 4

ggacgacgcg gagtacttat tgggccgctt ctccgtcctg gcggacagcg tcctagaaac 60

cctggcgacc attgcctcca gcgggataga gtggacggcg gaggccgctc gggactttct 120

ggagggagtg tggggtgggc ccggggcagc ccaggacaac tttatcagcg tggccgagcc 180

ggtcagcacc gcgtcgcagg cctcggccgg gctgctgctg ggtggaggag ggcagggctc 240

cgggggcaga cgcaagcgcc gtctggccac cgttctcccc ggactcgagg tctagagacc 300

cctggggcgg cgatgtcggg gctgctggcg gcggcgtaca gccaggtgta cgccctggcg 360

gttgagctga gcgtgtgcac ccggctggac ccccggagtc tggacgtggc tgcggtggtg 420

cgcaacgccg gcctgctggc cgagctggag gccatcctcc ttccccgttt gagacggcag 480

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ggtgcgcaga ccccagagca gcccgcaccc cccgccacca cggtgcagcc taccgccacg 600

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aagatagtga ccaacattct catctacaat ggctggtacg cggactccgt gaccaaccgg 840

cacgaggaga agttctccgt tgacagctac gaaactgacc agatggatac catctaccag 900

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tacgccagcc agacggagct ctatgacgcc cccgggtggt tgatatggac ttacagaaca 1080

agaactaccg tcaactgcct gataactgac atgatggcca agtccaacag ccccttcgac 1140

ttctttgtga ccaccaccgg gcagactgtg gaaatgtccc ctttctatga cgggaaaaat 1200

aaggaaacct tccatgagcg ggcagactcc ttccacgtga gaactaacta caagatagtg 1260

gactacgaca accgagggac gaacccgcaa ggcgaacgcc gagccttcct ggacaagggc 1320

acttacacgc tatcttggaa gctcgagaac aggacagcct actgcccgct tcaacactgg 1380

caaacctttg actcgaccat cgccacagaa acagggaagt caatacattt tgtgactgac 1440

gagggcacct ctagcttcgt gaccaacaca accgtgggca tagagctccc ggacgccttc 1500

aagtgcatcg aagagcaggt gaacaagacc atgcatgaga agtacgaggc cgtccaggat 1560

cgttacacga agggccagga agccattaca tattttataa cgagcggagg attgttatta 1620

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actccgactt cctcaccccc cagcagtcca tcgcccccag ccccatccgc ggcccgcggg 1740

agcacccccg ccgccgttct gaggcgtcgg aggcgggatg cggggaacgc caccacaccg 1800

gtgcccccca cggcccccgg gaagtccctg ggcaccctca acaatcccgc caccgtccag 1860

atccaatttg cctacgactc cctgcgccgc cagatcaacc gcatgctggg agaccttgcg 1920

cgggcctggt gcctggagca gaagaggcag aacatggtgc tgagagaact aaccaagatt 1980

aatccaacca ccgtcatgtc cagcatctac ggtaaggcgg tggcggccaa gcgcctgggg 2040

gatgtcatct cagtctccca gtgcgtgccc gttaaccagg ccaccgtcac cctgcgcaag 2100

agcatgaggg tccctggctc cgagaccatg tgctactcgc gccccctggt gtccttcagc 2160

tttatcaacg acaccaagac ctacgaggga cagctgggca ccgacaacga gatcttcctc 2220

acaaaaaaga tgacggaggt gtgccaggcg accagccagt actacttcca gtccggcaac 2280

gagatccacg tctacaacga ctaccaccac tttaaaacca tcgagctgga cggcattgcc 2340

accctgcaga ccttcatctc actaaacacc tccctcatcg agaacattga ctttgcctcc 2400

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ttccgggagt acaacttcca ggcgcaaaac atcgccggcc tgcggaagga tttggacaat 2520

gcagtgtcaa acggaagaaa tcaattcgtg gacggcctgg gggaacttat ggacagtctg 2580

ggtagcgtgg gtcagtccat caccaaccta gtcagcacgg tggggggttt gtttagcagc 2640

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ctggtggcgg gggtggtgat cctggttatt tccctcacga ggcgcacgcg ccagatgtcg 2760

cagcagccgg tgcagatgct ctaccccggg atcgacgagc tcgctcagca acatgcctct 2820

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ctgcatgagc aaaaccagga gcaaaagaga gcagctcaga gggcggccgg accctcagtg 2940

gccagcagag cattgcaggc agccagggac cgttttccag gcctacgcag aagacgctat 3000

cacgatccag agaccgccgc cgcactgctt ggggaggcag agactgagtt ttaa 3054