具体实施方式

定义

虽然在本文中显示和描述了本发明的各种实施例和方面，但对于本领域的技术人员显而易见的是，仅借助于实例提供此类实施例和方面。在不脱离本发明的前提下，本领域技术人员能够进行无数次变更、更改和替换。应当理解，在实施本发明时可以采用本文所述的本发明实施例的各种替代方案。

本文中使用的章节标题仅用作组织的目的，不应以任何方式解释为限制所描述的主题。本申请中所引用的所有文献或文献的部分，包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍、手册以及论文，在此出于任何目的明确地以全文引用的方式并入本文中。

本文所使用的缩写具有它们在化学领域和生物学领域内的常规含义。本文所述的化学结构和化学式是根据化学领域中已知的化学价的标准规则构建的。

除非另外定义，否则本文使用的技术和科学术语具有与本领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。参见，例如Singleton et al.,Dictionary Of MicrobiologyAnd Molecular Biology 2nd ed.,J.Wiley&Sons(New York,NY 1994)；Sambrook et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Springs Harbor Press(Cold SpringsHarbor,NY 1989).类似于或等同于本文描述的那些的任何方法、装置和材料都可以用于实施本发明。提供以下定义以便于理解本文中频繁使用的某些术语，且不意味着限制本公开的范围。

如本文所用，术语"约"意指包括指定值的值的范围，本领域普通技术人员将认为其合理地类似于指定值。在实施例中，术语“约”意指使用本领域通常可接受的测量值在标准偏差内。在实施例中，约意指范围扩展到指定值的+/-10％。在实施例中，约是指指定值。

“核酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物，及以上的补体。术语“多核苷酸”是指核苷酸的线性序列。术语“核苷酸”通常是指多核苷酸的单个单元，即单体。核苷酸可以是核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或其修饰形式。本文考虑的多核苷酸的实例包括单链和双链DNA、单链和双链RNA(包括siRNA)，以及具有单链和双链DNA和RNA的混合物的杂合分子。如本文所用的核酸还指具有与天然存在的核酸相同的基本化学结构的核酸。这样的类似物具有修饰的糖和/或修饰的环取代基，但是保留了与天然存在的核酸相同的基本化学结构。核酸模拟物是指具有与核酸的一般化学结构不同的结构，但以与天然存在的核酸相似的方式起作用的化合物。此类类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸和肽核酸(PNAs)。

术语“基因”意指参与产生蛋白质的DNA片段；其包含编码区之前和之后的区域(前导和拖尾)以及单独的编码片段(外显子)之间的间插序列(内含子)。前导、拖尾和内含子包含基因转录和翻译过程中必需的调节元件。进一步地，“蛋白质基因产物”是由特定基因表达的蛋白质。

如本文所使用的，关于基因的术语“表达”或“表达的”意指该基因的转录和/或翻译产物。细胞中DNA分子的表达水平可以根据细胞内存在的相应mRNA的量或细胞产生的DNA编码的蛋白的量来确定。非编码核酸分子的表达水平可以通过本领域众所周知的标准PCR或Northern印迹方法来检测。参见Sambrook et al.,1989Molecular Cloning:ALaboratory Manual,18.1-18.88。

转染的基因的表达可以在细胞中瞬时发生或稳定发生。在“瞬时表达”期间，转染的基因在细胞分裂过程中不转移至子细胞。由于其表达局限于转染的细胞，因此基因的表达随时间推移丧失。相反，当基因与另一个赋予转染的细胞选择优势的基因共转染时，可能发生转染基因的稳定表达。此类选择优势可能是对呈递给细胞的某种毒素的抗性。

术语“转染(transfection)”、“转导(transduction)”、“转染(transfecting)”或“转导(transducing)”可以互换使用，并且被定义为将核酸分子或蛋白质引入细胞的过程。使用非病毒或基于病毒的方法将核酸引入细胞。核酸分子可以是编码完整蛋白质或其功能部分的基因序列。非病毒转染方法包括不使用病毒DNA或病毒颗粒作为将核酸分子引入细胞的递送系统的任何合适的转染方法。示例性非病毒转染方法包含磷酸钙转染、脂质粒转染、核转染、声穿孔、通过热激转染、磁转染和电穿孔。在一些实施例中，按照本领域公知的标准程序使用电穿孔将核酸分子引入细胞中。对于基于病毒的转染方法，任何有用的病毒载体均可用于本文所述的方法。病毒载体的实例包括但不限于逆转录病毒的、腺病毒的、慢病毒的和腺相关的病毒载体。在一些实施例中，按照本领域公知的标准程序使用逆转录病毒载体将核酸分子引入细胞中。术语“转染”或“转导”还指从外部环境将蛋白质引入细胞。通常，蛋白的转导或转染依赖于能够穿过细胞膜的肽或蛋白与相关蛋白质的附接。参见例如Ford et al.(2001)Gene Therapy 8:1-4and Prochiantz(2007)Nat.Methods 4:119-20。

术语“质粒”或“表达载体”是指编码基因和/或基因表达所必需的调节元件的核酸分子。来自质粒的基因表达可以顺式发生或反式发生。如果基因以顺式表达，则基因和调节元件由同一质粒编码。反式表达是指其中基因和调节元件由单独的质粒编码的情况。

术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸以及之后被修饰的氨基酸，例如，羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸以及O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即与氢、羧基、氨基和R基团结合的α碳，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有经过修饰的R基(例如，正亮氨酸)或经过修饰的肽主链，但是保留了与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构，但以与天然存在的氨基酸相似的方式起作用的化合物。

氨基酸在本文中可以通过其通常已知的三字母符号或通过IUPAC-IUB生物化学命名法委员会(the IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)推荐的单字母符号来指代。同样，核苷酸可以通过其普遍接受的单字母代码来表示。

当在给定氨基酸或多核苷酸序列的编号的上下文中使用时，术语“参考...编号”或“对应于”是指当将给定氨基酸或多核苷酸序列与参考序列进行比较时，给定参考序列的残基的编号。当蛋白质中的氨基酸残基在蛋白质中与给定残基占据相同的基本结构位置时，它“对应”于给定残基。本领域技术人员将立即识别与具有不同编号系统的其他蛋白质中的蛋白质(例如，ROR-1)中的特定位置相对应的残基的身份和位置。例如，通过与蛋白质(例如，ROR-1)进行简单的序列对比，在与所述蛋白质比对的其他蛋白质序列中可鉴定对应于蛋白质特定位置的残基的身份和位置。例如，当所选残基与位置138处的谷氨酸具有相同的基本空间或其他结构关系时，所选蛋白质中的所选残基对应于位置138处的谷氨酸。在一些实施例中，其中将所选蛋白质与蛋白质进行最大同源性比对，则与谷氨酸138比对的所选蛋白质中的位置将对应于谷氨酸138。代替一级序列比对，也可以使用三维结构比对，例如，其中将所选蛋白质的结构与位置138处的谷氨酸，进行最大对应性比对，并且比较整体结构。在这种情况下，与结构模型中的谷氨酸138占据相同必需位置的氨基酸是对应于谷氨酸138残基的氨基酸。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用以指代氨基酸残基的聚合物，其中聚合物可任选地与不由氨基酸组成的部分缀合。所述术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是对应天然存在的氨基酸的人造化学模拟物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。“融合蛋白”是指编码重组表达为单个部分的两个或更多个单独蛋白质序列的嵌合蛋白质。

当参考例如细胞、核酸、蛋白质或载体使用时，术语"重组"指该细胞、核酸、蛋白质或载体已通过实验室方法修饰或是实验室方法的结果。因此，例如，重组蛋白包括通过实验室方法产生的蛋白。重组蛋白可以包括在蛋白质的天然(非重组)形式的蛋白质中找不到的氨基酸残基，或者可以包括经过修饰(例如，标记)的氨基酸残基。

当将术语“分离的”应用于核酸或蛋白质时，是指该核酸或蛋白质基本上不含在天然状态下与其缔合的其他细胞成分。它可以例如处于均质状态并且可以处于干燥状态或水溶液中。纯度和均质性通常使用分析化学技术，如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法确定。制剂中存在的主要蛋白质基本上得以纯化。

在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，术语“相同”或“同一性”百分比是指当如使用以下序列比较算法之一或通过手动比对和目视检测测量的针对在比较窗或指定区域上的最大对应进行比较和对齐时，相同的或具有特定百分比的相同的氨基酸氨基或核苷酸(即在例如本发明的整个多肽序列或本发明的多肽的单个结构域的特定区域上，60％同一性，任选地65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性)的两个或更多个序列或子序列。此类序列随后所述“基本上相同”。此定义还涉及或可以应用于测试序列的互补物。任选地，同一性存在于长度至少约50个核苷酸的区域上，或更优选地存在于长度为100-500个或1000个或更多个核苷酸的区域上。

通过在比较窗中比较两个最佳比对的序列来确定“序列同一性的百分比”，其中对于两个序列的最佳比对，与参考序列(其不包含添加或缺失)相比，比较窗中的多核苷酸或多肽序列的部分可以包括添加或缺失(即缺口)。通过确定两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数以产生匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗口中的位置总数，并将结果乘以100以得出序列同一性的百分比，来计算百分比。

为了进行序列比较，通常将一个序列用作参考序列，将其与测试序列进行比较。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机中，必要时指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，或者可以指定可选参数。然后，序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。

如本文所用，“比较窗”包括提及选自例如全长序列或20至600个、约50个至约200个或约100个至约150个氨基酸或核苷酸序列的任一数目的连续位置的片段，其中在将两个序列最佳比对后，可以将序列与相同数目的连续位置的参考序列进行比较。考虑了本领域公知的用于比较的任何序列比对方法。用于比较的最佳序列比对可以通过以下方法来进行:例如，通过Smith和Waterman(1970年)《应用数学进展(Adv.Appl.Math.)》2:482c的局部同源性算法；通过Needleman和Wunsch(1970年)《分子生物学期刊(J.Mol.Biol.)48:443》的同源性比对算法，通过Pearson和Lipman(1988年)《美国科学院院刊(Proc.Nat’.Acad.Sci.USA)》85:2444的相似性搜索方法、通过这些算法的计算机实现(威斯康辛遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，遗传学计算机组(Genetics Computer Group)，575科学(Science)，Madison博士、WI)，或者通过手动比对和目测观察(参见，例如，Ausubel et al.,Current Protocols in MolecularBiology(1995supplement))。

适用于确定序列一致性百分比和序列相似性的算法的一实例是BLAST和BLAST2.0算法，其分别描述于Altschul et al.(1977)Nuc.Acids Res.25:3389-3402，和Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403-410中。用于进行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。此算法涉及通过识别查询序列中长度为W的短字来首先识别高评分序列对(HSP)，所述短字当与数据库序列中相同长度的字比对时匹配或满足某些正值阈值分数T。T称作临近字分数阈值(Altschul etal.，同上)。这些初始邻近字命中点充当启动检索以找到含有其的更长HSP的种子。字命中点沿每一序列在两个方向上延伸，直到可以增加累积比对评分为止。对于核苷酸序列来说，累积评分使用参数M(一对匹配残基的奖励评分；始终>0)和N(失配残基的惩罚评分；始终<0)来计算。对于氨基酸序列，使用计分矩阵计算累积评分。当累积比对评分从其达到的最大值降低量X；累积评分因一次或多次负分残基比对的累积而变成零或低于零；或到达任一序列的末端时，中断字命中点在各方向上的延伸。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(针对核苷酸序列)使用字长(W)为11、期望值(E)为10、M＝5、N＝-4、以及双链比较值作为默认参数。对于氨基酸序列来说，BLASTP程序使用以下默认参数:字长为3、期望值(E)为10、以及BLOSUM62计分矩阵(参见Henikoff and Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915)比对值(B)为50、期望值(E)为10、M＝5、N＝-4和双链比较值。

BLAST算法还进行两个序列之间的相似性统计分析(参见，例如，Karlin andAltschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787)。由BLAST算法提供的一种类似性度量是最小和概率(P(N))，其提供对两个核苷酸或氨基酸序列之间将偶然发生匹配的概率的指示。举例来说，如果测试核酸与参考核酸的比较中最小和概率约低于0.2，更优选地约低于0.01，并且最优选地约低于0.001，则认为核酸类似于参考序列。

如下所述，两个核酸序列或多肽基本相同的指示是由第一核酸编码的多肽与针对由第二核酸编码的多肽产生的抗体在免疫学上交叉反应。因此，多肽通常与第二多肽通常或基本上相同，例如，其中两种肽仅通过保守取代而不同。两个核酸序列基本上一致的另一个指示是，两个分子或其互补序列在严格条件下彼此杂交，如下文所述。两个核酸序列基本相同的又一个指示是，相同引物可以用于扩增序列。

抗体是具有复杂内部结构的大而复杂的分子(分子量为～150,000或约1320个氨基酸)。天然抗体分子包括两对相同的多肽链，每对具有一条轻链和一条重链。每条轻链和重链依次由两个区域组成:与靶抗原结合的可变(“V”)区，和与免疫系统的其他组分相互作用的恒定(“C”)区。轻链和重链可变区在三维空间中结合在一起以形成结合抗原(例如，细胞表面上的受体)的可变区。在每个轻链或重链可变区内，有三个称之为互补性决定区(“CDR”)的短链段(平均长度为10个氨基酸)。抗体可变结构域中的六个CDR(三个来自轻链，且三个来自重链)在3维空间中折叠在一起，以形成对接在靶抗原上的实际抗体结合位点。CDR的位置和长度已由Kabat,E.et al.,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,U.S.Department of Health and Human Services,1983,1987.精确定义。CDR中未包含的可变区部分称为框架(“FR”)，它形成了CDRs的环境。

如本文所提供的“抗体变体”是指能够结合抗原并且包括抗体或其片段的一个或多个结构域(例如，轻链可变结构域、重链可变结构域)的多肽。抗体变体的非限制性实例包括单结构域抗体或纳米抗体、单特异性Fab₂、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、单价IgG、scFv、双特异性抗体、双特异性双抗体、三特异性三抗体、scFv-Fc、小抗体、IgNAR、V-NAR、hcIgG、VhH或肽体。如本文提供的“肽体”是指(通过共价或非共价接头)附接至抗体的Fc结构域的肽部分。本领域已知的抗体变体的其他非限制性实例包括由软骨鱼或骆驼科动物产生的抗体。骆驼科动物的抗体及其可变区及它们的产生、分离和使用方法的一般描述可在参考文献WO97/49805和WO 97/49805中找到，通过引用将其整体并入本文中，并用于所有目的。同样，软骨鱼的抗体及其可变区及它们的产生、分离和使用的方法可在WO2005/118629中找到，通过引用将其整体并入本文中，并用于所有目的。

本文提供的术语“CDR L1”、“CDR L2”和“CDR L3”是指抗体可变轻链(L)的互补性决定区(CDR)1、2和3。在实施例中，本文提供的可变轻链在N-末端至C-末端的方向上包括CDR L1、CDR L2和CDR L3。本文提供的术语“CDR H1”、“CDR H2”和“CDR H3”是指抗体可变重链(H)的互补性决定区(CDR)1、2和3。在实施例中，本文提供的可变轻链在N-末端至C-末端的方向上包括CDR L1、CDR L2和CDR L3。

根据其在通常已知的含义使用术语“抗体”。抗体，例如，以完整的免疫球蛋白形式存在或以各种肽酶消化产生的许多充分表征的片段形式存在。因此，例如，胃蛋白酶消化铰链区中二硫键下方的抗体以产生F(ab)'₂，其为Fab的二聚体，本身为通过二硫键与V_H-C_H1连接的轻链。F(ab)'₂可以在温和的条件下还原以破坏铰链区中的二硫键，从而将F(ab)'₂二聚体转化为Fab'单体。Fab'单体基本上为具有铰链区的一部分的Fab(参见FundamentalImmunology(Paul ed.,3d ed.1993))。尽管就完整抗体的消化而言定义了各种抗体片段，但是本领域技术人员将理解，可以化学方式或通过使用重组DNA方法从头合成此类片段。因此，如本文所使用的术语抗体还包括通过修饰完整抗体产生的抗体片段，或使用重组DNA方法从头合成的抗体片段(例如，单链Fv)或使用噬菌体展示文库识别的抗体片段(参见，例如，McCafferty et al.,Nature 348:552-554(1990))。

如本文提供的术语“抗原”是指能够结合本文提供的抗体结合结构域的分子。如本文提供的“抗原结合结构域”是与抗原(表位)结合的抗体区域。如上所述，抗原结合结构域通常由每条重链和轻链的一个恒定域和一个可变域(分别为V_L、V_H、C_L和C_H1)组成。互补位或抗原结合位点形成于抗原结合结构域的N-末端。抗原结合结构域的两个可变结构域通常与抗原上的表位结合。

抗体，例如，以完整的免疫球蛋白形式存在或以各种肽酶消化产生的许多充分表征的片段形式存在。因此，例如，胃蛋白酶消化铰链区中二硫键下方的抗体以产生F(ab)’₂，Fab的其本身是通过二硫键与V_H-C_H1连接的轻链的一种二聚体。F(ab)’₂可以在温和条件下还原以破坏铰链区中的二硫键，从而将F(ab)’₂二聚体转化为Fab'单体。Fab'单体基本上为具有铰链区的一部分的Fab(参见Fundamental Immunology(Paul ed.,3d ed.1993))。尽管就完整抗体的消化而言定义了各种抗体片段，但是本领域技术人员将理解，可以化学方式或通过使用重组DNA方法从头合成此类片段。因此，如本文所使用的术语抗体还包括通过修饰完整抗体产生的抗体片段，或使用重组DNA方法从头合成的抗体片段(例如，单链Fv)或使用噬菌体展示文库识别的抗体片段(参见，例如，McCafferty et al.,Nature 348:552-554(1990))。

单链可变片段(scFv)通常免疫球蛋白的重链(V_H)和轻链(V_L)的可变区的融合蛋白，其与10至约25个氨基酸的短接头肽连接。所述接头通常可富含甘氨酸以提高柔韧性，以及丝氨酸或苏氨酸以提高溶解度。所述接头可以将V_H的N-末端与V_L的C-末端相连，反之亦然。

抗体的表位是其抗原结合的抗原区域。如果两种抗体中的每种竞争性地抑制(阻断)另一种抗体与抗原的结合，则两种抗体会结合到相同或重叠的表位上。也就是说，如在竞争性结合测定中测定的，1x、5x、10x、20x或100x过量的一种抗体将另一种抗体的结合抑制至少30％，但优选为50％、75％、90％或甚至99％(参见，例如，Junghans et al.,CancerRes.50:1495,1990)。或者，如果抗原中基本上所有减少或消除一种抗体的结合的氨基酸突变均减少或消除了另一种抗体的结合，则两种抗体具有相同的表位。如果减少或消除一种抗体的结合的一些氨基酸突变减少或消除了另一种抗体的结合，则两种抗体具有重叠的表位。

如本文所用，术语“ROR-1”或“ROR1”包括酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR-1)或其保持ROR-1活性的变体或同源物的任何重组或天然存在形式(例如，相比于ROR-1，在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％活性内)。在一些方面，与天然存在的ROR-1蛋白相比，变体或同源物在整个序列或序列的一部分(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，ROR-1蛋白与登录号NP_005003.1鉴定的蛋白或与之具有实质同一性的变体或同源物基本相同。在实施例中，ROR-1蛋白包括SEQ ID NO:55的氨基酸序列。在实施例中，ROR-1蛋白是SEQ ID NO:55的氨基酸序列。在实施例中，ROR-1蛋白包括SEQ ID NO:56的氨基酸序列。在实施例中，ROR-1蛋白包括SEQ ID NO:57的氨基酸序列。

术语“cirmtuzumab”、“UC-961”和“99961.1”是指能够结合人受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR-1)的细胞外结构域的人源化单克隆抗体。在实施例中，cirmtuzumab是公开于美国专利申请号14/422,519的任何一种抗体或其片段，其全文并入本文作为参考并用于所有目的。

本文提供的术语“CD28跨膜结构域”包括CD28的跨膜结构域的任何重组或天然存在形式，或其维持CD28跨膜活性的变体或同源物(例如，与CD28跨膜结构域相比，在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％活性内)。在一些方面，与天然存在的CD28跨膜结构域多肽相比，变体或同源物在整个序列或一部分序列(例如50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列一致性。在实施例中，CD28跨膜结构域是人CD28跨膜结构域蛋白。在实施例中，与天然存在的CD28跨膜结构域蛋白相比，CD28跨膜结构域蛋白的变体或突变体包括不超过5、4、3、2或1个缺失。在实施例中，与天然存在的CD28跨膜结构域蛋白相比，CD28跨膜结构域蛋白的变体或突变体包括不超过5、4、3、2或1个插入。在实施例中，与天然存在的CD28跨膜结构域蛋白相比，CD28跨膜结构域蛋白的变体或突变体不包括缺失。在实施例中，与天然存在的CD28跨膜结构域蛋白相比，CD28跨膜结构域蛋白的变体或突变体不包括插入。在实施例中，与天然存在的CD28跨膜结构域蛋白相比，CD28跨膜结构域蛋白的变体或突变体包括为保守性置换的置换。在实施例中，CD28跨膜结构域包括由NCBI序列参考NP_001230006.1鉴定的蛋白质的全部或部分，或其异形体或天然存在的突变体或变体。在实施例中，CD28跨膜结构域包括由NCBI序列参考NP_001230007.1鉴定的蛋白质的全部或部分，或其异形体或天然存在的突变体或变体。在实施例中，CD28跨膜结构域包括由NCBI序列参考NP_006130.1鉴定的蛋白质的全部或部分，或其异形体或天然存在的突变体或变体。

本文提供的术语“CD4跨膜结构域”包括CD4的跨膜结构域的任何重组或天然存在形式，或其维持CD4跨膜结构域活性的变体或同源物(例如，与CD4跨膜结构域相比，在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％活性内)。在一些方面，与天然存在的CD4跨膜结构域多肽相比，变体或同源物在整个序列或一部分序列(例如50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列一致性。在实施例中，CD4跨膜结构域是人CD4跨膜结构域蛋白。在实施例中，与天然存在的CD4跨膜结构域蛋白相比，CD4跨膜结构域蛋白的变体或突变体包括不超过5、4、3、2或1个缺失。在实施例中，与天然存在的CD4跨膜结构域蛋白相比，CD4跨膜结构域蛋白的变体或突变体包括不超过5、4、3、2或1个插入。在实施例中，与天然存在的CD4跨膜结构域蛋白相比，CD4跨膜结构域蛋白的变体或突变体不包括缺失。在实施例中，与天然存在的CD4跨膜结构域蛋白相比，CD4跨膜结构域蛋白的变体或突变体不包括插入。在实施例中，与天然存在的CD4跨膜结构域蛋白相比，CD4跨膜结构域蛋白的变体或突变体包括为保守性置换的置换。在实施例中，CD4跨膜结构域包括由NCBI序列参考NP_000607.1鉴定的蛋白质的全部或部分，或其异形体或天然存在的突变体或变体。在实施例中，CD4跨膜结构域包括由NCBI序列参考NP_001181943.1鉴定的蛋白质的全部或部分，或其异形体或天然存在的突变体或变体。在实施例中，CD4跨膜结构域包括由NCBI序列参考NP_001181944.1鉴定的蛋白质的全部或部分，或其异形体或天然存在的突变体或变体。在实施例中，CD4跨膜结构域包括由NCBI序列参考NP_001181945.1鉴定的蛋白质的全部或部分，或其异形体或天然存在的突变体或变体。在实施例中，CD4跨膜结构域包括由NCBI序列参考NP_001181946.1鉴定的蛋白质的全部或部分，或其异形体或天然存在的突变体或变体。

本文提供的术语“CD8跨膜结构域”包括CD8的跨膜结构域的任何重组或天然存在形式，或其维持CD8跨膜结构域活性的变体或同源物(例如，与CD8跨膜结构域相比，在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％活性内)。在一些方面，与天然存在的CD8跨膜结构域多肽相比，变体或同源物在整个序列或一部分序列(例如50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列一致性。在实施例中，CD8跨膜结构域是CD8A跨膜结构域。在实施例中，CD8跨膜结构域是CD8B跨膜结构域。在实施例中，CD8跨膜结构域是人CD8跨膜结构域蛋白。在实施例中，与天然存在的CD8跨膜结构域蛋白相比，CD8跨膜结构域蛋白的变体或突变体包括不超过5、4、3、2或1个缺失。在实施例中，与天然存在的CD8跨膜结构域蛋白相比，CD8跨膜结构域蛋白的变体或突变体包括不超过5、4、3、2或1个插入。在实施例中，与天然存在的CD8跨膜结构域蛋白相比，CD8跨膜结构域蛋白的变体或突变体不包括缺失。在实施例中，与天然存在的CD8跨膜结构域蛋白相比，CD8跨膜结构域蛋白的变体或突变体不包括插入。在实施例中，与天然存在的CD8跨膜结构域蛋白相比，CD8跨膜结构域蛋白的变体或突变体包括为保守性置换的置换。在实施例中，CD8跨膜结构域包括由NCBI序列参考NP_001139345.1鉴定的蛋白质的全部或部分，或其异形体或天然存在的突变体或变体。在实施例中，CD8跨膜结构域包括由NCBI序列参考NP_001181943.1鉴定的蛋白质的全部或部分，或其异形体或天然存在的突变体或变体。在实施例中，CD8跨膜结构域包括由NCBI序列参考NP_001181944.1鉴定的蛋白质的全部或部分，或其异形体或天然存在的突变体或变体。在实施例中，CD8跨膜结构域包括由NCBI序列参考NP_001181945.1鉴定的蛋白质的全部或部分，或其异形体或天然存在的突变体或变体。在实施例中，CD8跨膜结构域包括由NCBI序列参考NP_741969.1鉴定的蛋白质的全部或部分，或其异形体或天然存在的突变体或变体。在实施例中，CD8跨膜结构域包括由NCBI序列参考NP_001759.3鉴定的蛋白质的全部或部分，或其异形体或天然存在的突变体或变体。在实施例中，CD8跨膜结构域包括由NCBI序列参考XP_011531466.1鉴定的蛋白质的全部或部分，或其异形体或天然存在的突变体或变体。在实施例中，CD8跨膜结构域包括由NCBI序列参考NP_001171571.1鉴定的蛋白质的全部或部分，或其异形体或天然存在的突变体或变体。在实施例中，CD8跨膜结构域包括由NCBI序列参考NP_757362.1鉴定的蛋白质的全部或部分，或其异形体或天然存在的突变体或变体。在实施例中，CD8跨膜结构域包括由NCBI序列参考NP_742100.1鉴定的蛋白质的全部或部分，或其异形体或天然存在的突变体或变体。在实施例中，CD8跨膜结构域包括由NCBI序列参考NP_742099.1鉴定的蛋白质的全部或部分，或其异形体或天然存在的突变体或变体。在实施例中，CD8跨膜结构域包括由NCBI序列参考NP_004922.1鉴定的蛋白质的全部或部分，或其异形体或天然存在的突变体或变体。

本文提供的术语“CD3ζ跨膜结构域”包括CD3ζ的跨膜结构域的任何重组或天然存在形式，或其维持CD3ζ跨膜结构域活性的变体或同源物(例如，与CD3ζ跨膜结构域相比，在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％活性内)。在一些方面，与天然存在的CD3ζ跨膜结构域多肽相比，变体或同源物在整个序列或一部分序列(例如50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列一致性。在实施例中，CD3ζ跨膜结构域是人CD3ζ跨膜结构域蛋白。在实施例中，与天然存在的CD3ζ跨膜结构域蛋白相比，CD3ζ跨膜结构域蛋白的变体或突变体包括不超过5、4、3、2或1个缺失。在实施例中，与天然存在的CD3ζ跨膜结构域蛋白相比，CD3ζ跨膜结构域蛋白的变体或突变体包括不超过5、4、3、2或1个插入。在实施例中，与天然存在的CD3ζ跨膜结构域蛋白相比，CD3ζ跨膜结构域蛋白的变体或突变体不包括缺失。在实施例中，与天然存在的CD3ζ跨膜结构域蛋白相比，CD3ζ跨膜结构域蛋白的变体或突变体不包括插入。在实施例中，与天然存在的CD3ζ跨膜结构域蛋白相比，CD3ζ跨膜结构域蛋白的变体或突变体包括为保守性置换的置换。在实施例中，CD3ζ跨膜结构域包括由NCBI序列参考NP_000725.1鉴定的蛋白质的全部或部分，或其异形体或天然存在的突变体或变体。在实施例中，CD3ζ跨膜结构域包括由NCBI序列参考NP_932170.1鉴定的蛋白质的全部或部分，或其异形体或天然存在的突变体或变体。

本文提供的术语“CD28共同刺激结构域”包括CD28的共同刺激结构域的任何重组或天然存在形式，或其维持CD28共刺激域活性的变体或同源物(例如，与CD28共同刺激结构域相比，在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％活性内)。在一些方面，与天然存在的CD28共同刺激结构域多肽相比，变体或同源物在整个序列或一部分序列(例如50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列一致性。在实施例中，CD28共刺激域是人CD28共刺激结构域蛋白。在实施例中，与天然存在的CD28共刺激结构域蛋白相比，CD28共刺激结构域蛋白的变体或突变体包括不超过5、4、3、2或1个缺失。在实施例中，与天然存在的CD28共刺激结构域蛋白相比，CD28共刺激结构域蛋白的变体或突变体包括不超过5、4、3、2或1个插入。在实施例中，与天然存在的CD28共刺激结构域蛋白相比，CD28共刺激结构域蛋白的变体或突变体不包括缺失。在实施例中，与天然存在的CD28共刺激结构域蛋白相比，CD28共刺激结构域蛋白的变体或突变体不包括插入。在实施例中，与天然存在的CD28共刺激结构域蛋白相比，CD28共刺激结构域蛋白的变体或突变体包括为保守性置换的置换。在实施例中，CD28共刺激结构域包括由NCBI序列参考NP_001230006.1鉴定的蛋白质的全部或部分，或其异形体或天然存在的突变体或变体。在实施例中，CD28共刺激结构域包括由NCBI序列参考NP_001230007.1鉴定的蛋白质的全部或部分，或其异形体或天然存在的突变体或变体。在实施例中，CD28共刺激结构域包括由NCBI序列参考NP_006130.1鉴定的蛋白质的全部或部分，或其异形体或天然存在的突变体或变体。

本文提供的术语“4-1BB共同刺激结构域”包括4-1BB的共同刺激结构域的任何重组或天然存在形式，或其维持4-1BB共刺激结构域活性的变体或同源物(例如，与4-1BB共同刺激结构域相比，在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％活性内)。在一些方面，与天然存在的4-1BB共同刺激结构域多肽相比，变体或同源物在整个序列或一部分序列(例如50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列一致性。在实施例中，4-1BB共刺激结构域是人4-1BB共刺激结构域蛋白。在实施例中，与天然存在的4-1BB共刺激结构域蛋白相比，4-1BB共刺激结构域蛋白的变体或突变体包括不超过5、4、3、2或1个缺失。在实施例中，与天然存在的4-1BB共刺激结构域蛋白相比，4-1BB共刺激结构域蛋白的变体或突变体包括不超过5、4、3、2或1个插入。在实施例中，与天然存在的4-1BB共刺激结构域蛋白相比，4-1BB共刺激结构域蛋白的变体或突变体不包括缺失。在实施例中，与天然存在的4-1BB共刺激结构域蛋白相比，4-1BB共刺激结构域蛋白的变体或突变体不包括插入。在实施例中，与天然存在的4-1BB共刺激结构域蛋白相比，4-1BB共刺激结构域蛋白的变体或突变体包括为保守性置换的置换。在实施例中，4-1BB共刺激结构域蛋白与SEQ ID NO:14具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在实施例中，4-1BB共刺激结构域包括由NCBI序列参考NP_001552.2鉴定的蛋白质的全部或部分，或其异形体或天然存在的突变体或变体。

本文提供的术语“ICOS共同刺激结构域”包括ICOS的共同刺激结构域的任何重组或天然存在形式，或其维持ICOS共刺激结构域活性的变体或同源物(例如，与ICOS共同刺激结构域相比，在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％活性内)。在一些方面，与天然存在的ICOS共同刺激结构域多肽相比，变体或同源物在整个序列或一部分序列(例如50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列一致性。在实施例中，ICOS共刺激结构域是人ICOS共刺激结构域蛋白。在实施例中，与天然存在的ICOS共刺激结构域蛋白相比，ICOS共刺激结构域蛋白的变体或突变体包括不超过5、4、3、2或1个缺失。在实施例中，与天然存在的ICOS共刺激结构域蛋白相比，ICOS共刺激结构域蛋白的变体或突变体包括不超过5、4、3、2或1个插入。在实施例中，与天然存在的ICOS共刺激结构域蛋白相比，ICOS共刺激结构域蛋白的变体或突变体不包括缺失。在实施例中，与天然存在的ICOS共刺激结构域蛋白相比，ICOS共刺激结构域蛋白的变体或突变体不包括插入。在实施例中，与天然存在的ICOS共刺激结构域蛋白相比，ICOS共刺激结构域蛋白的变体或突变体包括是保守性置换的置换。在实施例中，ICOS共刺激结构域包括由NCBI序列参考NP_036224.1鉴定的蛋白质的全部或部分，或其异形体或天然存在的突变体或变体。

本文提供的术语“OX-40共同刺激结构域”包括OX-40的共同刺激结构域的任何重组或天然存在形式，或其维持OX-40共刺激结构域活性的变体或同源物(例如，与OX-40共同刺激结构域相比，在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％活性内)。在一些方面，与天然存在的OX-40共同刺激结构域多肽相比，变体或同源物在整个序列或一部分序列(例如50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列一致性。在实施例中，OX-40共刺激域是人OX-40共刺激结构域蛋白。在实施例中，与天然存在的OX-40共刺激结构域蛋白相比，OX-40共刺激结构域蛋白的变体或突变体包括不超过5、4、3、2或1个缺失。在实施例中，与天然存在的OX-40共刺激结构域蛋白相比，OX-40共刺激结构域蛋白的变体或突变体包括不超过5、4、3、2或1个插入。在实施例中，与天然存在的OX-40共刺激结构域蛋白相比，OX-40共刺激结构域蛋白的变体或突变体不包括缺失。在实施例中，与天然存在的OX-40共刺激结构域蛋白相比，OX-40共刺激结构域蛋白的变体或突变体不包括插入。在实施例中，与天然存在的OX-40共刺激结构域蛋白相比，OX-40共刺激结构域蛋白的变体或突变体包括为保守性置换的置换。在实施例中，OX-40共刺激结构域包括由NCBI序列参考NP_003318.1鉴定的蛋白质的全部或部分，或其异形体或天然存在的突变体或变体。

本文提供的术语“CTLA-4共同刺激结构域”包括CTLA-4的共同刺激结构域的任何重组或天然存在形式，或其维持CTLA-4共刺激结构域活性的变体或同源物(例如，与CTLA-4共同刺激结构域相比，在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％活性内)。在一些方面，与天然存在的CTLA-4共同刺激结构域多肽相比，变体或同源物在整个序列或一部分序列(例如50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列一致性。在实施例中，CTLA-4共刺激结构域蛋白是人CTLA-4共刺激结构域蛋白。在实施例中，CTLA-4共刺激结构域包括不超过5、4、3、2或1个缺失。在实施例中，CTLA-4共刺激结构域蛋白包括不超过5、4、3、2或1个插入。在实施例中，CTLA-4共刺激结构域蛋白不包括缺失。在实施例中，CTLA-4共刺激结构域蛋白不包括插入。在实施例中，CTLA-4共刺激结构域蛋白包括保守置换的置换。在实施例中，CTLA-4共刺激域是人CTLA-4共刺激结构域蛋白。在实施例中，与天然存在的CTLA-4共刺激结构域蛋白相比，CTLA-4共刺激结构域蛋白的变体或突变体包括不超过5、4、3、2或1个缺失。在实施例中，与天然存在的CTLA-4共刺激结构域蛋白相比，CTLA-4共刺激结构域蛋白的变体或突变体包括不超过5、4、3、2或1个插入。在实施例中，与天然存在的CTLA-4共刺激结构域蛋白相比，CTLA-4共刺激结构域蛋白的变体或突变体不包括缺失。在实施例中，与天然存在的CTLA-4共刺激结构域蛋白相比，CTLA-4共刺激结构域蛋白的变体或突变体不包括插入。在实施例中，与天然存在的CTLA-4共刺激结构域蛋白相比，CTLA-4共刺激结构域蛋白的变体或突变体包括为保守置换的置换。

本文提供的术语“CD3ζ细胞内T细胞信号转导结构域”包括CD3ζ细胞内T细胞信号转导结构域的任何重组或天然存在形式，或其维持CD3ζ细胞内T细胞信号转导结构域活性的变体或同源物(例如，与CD3ζ细胞内T细胞信号转导结构域相比，在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％活性内)。在一些方面，与天然存在的CD3ζ细胞内T细胞信号转导结构域多肽相比，变体或同源物在整个序列或序列的一部分(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，CD3ζ细胞内T细胞信号转导结构域是人CD3ζ细胞内T细胞信号转导结构域蛋白。在实施例中，与天然存在的CD3ζ细胞内T细胞信号转导结构域蛋白相比，CD3ζ细胞内T细胞信号转导结构域蛋白的变体或突变体包括不超过5、4、3、2或1个缺失。在实施例中，与天然存在的CD3ζ细胞内T细胞信号转导结构域蛋白相比，CD3ζ细胞内T细胞信号转导结构域蛋白的变体或突变体包括不超过5、4、3、2或1个插入。在实施例中，与天然存在的CD3ζ细胞内T细胞信号转导结构域蛋白相比，CD3ζ细胞内T细胞信号转导结构域蛋白的变体或突变体不包括缺失。在实施例中，与天然存在的CD3ζ细胞内T细胞信号转导结构域蛋白相比，CD3ζ细胞内T细胞信号转导结构域蛋白的变体或突变体不包括插入。在实施例中，与天然存在的CD3ζ细胞内T细胞信号转导结构域蛋白相比，CD3ζ细胞内T细胞信号转导结构域蛋白的变体或突变体包括为保守置换的置换。在实施例中，CD3ζ细胞内T细胞信号转导结构域包括由NCBI序列参考NP_000725.1鉴定的蛋白质的全部或部分，或其异形体或天然存在的突变体或变体。在实施例中，CD3ζ细胞内T细胞信号转导结构域包括由NCBI序列参考NP_932170.1鉴定的蛋白质的全部或部分，或其异形体或天然存在的突变体或变体。上文确定了NCBI序列参考下可用的人CD3ζ氨基酸序列的非限制性示例。

在实施例中，CD3ζ细胞内T细胞信号转导结构域由NCBI序列参考NM_000734.3鉴定的核酸序列的全部或部分或其异形体或天然存在的突变体或变体编码。在实施例中，CD3ζ细胞内T细胞信号转导结构域由NCBI序列参考NM_198053.2鉴定的核酸序列的全部或部分或其异形体或天然存在的突变体或变体编码。在实施例中，与天然存在的CD3ζ细胞内T细胞信号转导结构域核酸序列相比，CD3ζ细胞内T细胞信号转导结构域核酸序列的变体或突变体包括不超过5、4、3、2或1个缺失。在实施例中，与天然存在的CD3ζ细胞内T细胞信号转导结构域核酸序列相比，CD3ζ细胞内T细胞信号转导结构域核酸序列的变体或突变体包括不超过5、4、3、2或1个插入。在实施例中，与天然存在的CD3ζ细胞内T细胞信号转导结构域核酸序列相比，CD3ζ细胞内T细胞信号转导结构域核酸序列的变体或突变体不包括缺失。在实施例中，与天然存在的CD3ζ细胞内T细胞信号转导结构域核酸序列相比，CD3ζ细胞内T细胞信号转导结构域核酸序列的变体或突变体不包括插入。在实施例中，与天然存在的CD3ζ细胞内T细胞信号转导结构域核酸序列相比，CD3ζ细胞内T细胞信号转导结构域核酸序列的变体或突变体包括为保守置换的置换。

“对照”样品或值是指用作参照物，通常是已知参照物，以与测试样品进行比较的样品。例如，可以从测试条件下，例如在存在测试化合物的情况下采集测试样品，并与已知条件下的样品进行比较，例如在不存在测试化合物的情况下(阴性对照)，或在存在已知化合物情况下(阳性对照)。对照也可以代表从多个测试或结果中收集的平均值。本领域技术人员将认识到可以设计对照，以评估任何数量的参数。例如，可以设计对照，以基于药理学数据(例如半衰期)或治疗措施(例如副作用的比较)比较治疗益处。对照对于确定数据的显著性也很有价值。例如，如果给定参数的值在对照中变化很大，则测试样品中的变化将不被认为是显著的。

如本文所使用的，术语“癌症”或“肿瘤”是指在哺乳动物(例如，人)中发现的所有类型的癌症、肿瘤或恶性肿瘤，包含白血病、淋巴瘤、癌和肉瘤。可以用本文所提供的化合物或方法治疗的示例性癌症包括脑癌、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、前列腺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、成神经管细胞瘤、黑色素瘤、子宫颈癌、胃癌、卵巢癌、肺癌、头部癌症、霍奇金氏病和非霍奇金氏淋巴瘤。可以用本文所提供的化合物或方法治疗的示例性癌症包括甲状腺癌、内分泌系统癌、脑癌、乳癌、子宫颈癌、结肠癌、头颈癌、肝癌、肾癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、直肠癌、胃癌和子宫癌。另外的实例包括甲状腺癌、胆管癌、胰腺腺癌、皮肤黑色素瘤、结肠腺癌、直肠腺癌、胃腺癌、食道腺癌、头颈部鳞状细胞癌、乳腺浸润性癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、非小细胞肺癌、间皮瘤、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤、卵巢癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多症、原发性巨球蛋白血症、原发性脑肿瘤、恶性胰腺胰岛素瘤、恶性类癌、膀胱癌、癌前皮肤病变、睾丸癌、甲状腺癌、神经母细胞瘤、食道癌、泌尿生殖道癌、恶性高钙血症、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌、内分泌或外分泌胰腺肿瘤、甲状腺髓样癌(medullary thyroid cancer)、甲状腺髓样癌瘤(medullarythyroid carcinoma)、黑色素瘤、结肠直肠癌、甲状腺乳头状癌、肝细胞癌或前列腺癌。

如本文所使用的(并且在本领域中被充分理解的)，“治疗(treating或treatment)”还广泛地包含用于在受试者的病状中获得有益的或期望的结果(包含临床结果)的任何方法。有益的或期望的临床结果可以包含但不限于:减轻或改善一种或多种症状或病状、减轻疾病程度、稳定(即，不恶化)疾病状态、预防疾病传播或扩散、延迟或减缓疾病进展、改善或缓解疾病状态、减少疾病复发以及缓解(无论是部分的还是全部的，以及无论是可检测的还是不可检测的)。换句话说，本文所使用的“治疗”包括对疾病的任何治愈、改善或预防。治疗可预防疾病发生；抑制疾病扩散；缓解疾病的症状；完全或部分地移除疾病潜在病因；缩短疾病的持续时间；或进行这些事情的组合。

如本文所使用的，“治疗(Treating和treatment)”包含预防性治疗。治疗方法包含向受试者施用治疗有效量的活性剂。施用步骤可以由单次施用组成，或者可以包含一系列施用。治疗期的长度取决于多种因素，如病状的严重程度、患者的年龄、活性剂的浓度、在治疗中使用的组合物的活性或其组合。还应理解，用于治疗或预防的试剂的有效剂量可以在特定治疗或预防方案的过程中增加或减少。通过本领域中已知的标准诊断测定，剂量的变化可以产生并且变得显而易见。在一些情况下，可以需要长期施用。例如，以足以治疗患者的量向受试者施用组合物，且持续足够的持续时间。在实施例中，治疗(treating或treatment)不是预防性治疗。

“患者”或“有需要的受试者”是指遭受或易于遭受可以通过施用如本文所提供的药物组合物治疗的疾病或病状的活生物体。非限制性实例包含人、其它哺乳动物、牛科动物、大鼠、小鼠、狗、猴、山羊、绵羊、牛、鹿和其它非哺乳动物。在一些实施例中，患者是人。

“有效量”是相对于不存在化合物，足以使化合物实现所述目的(例如实现其施用效果、治疗疾病、降低酶活性、增加酶活性、减少信号通路或减轻疾病或病况的一种或多种症状)的量。“有效量”的实例是足以促成治疗、预防或减少疾病的一种或多种症状的量，所述量也可以被称为“治疗有效量”。一种或多种症状(和此短语的语法等同物)的“减少”意指降低一种或多种症状的严重程度或频率，或消除一种或多种症状。药物的“预防有效量”是当施用于受试者时，将具有预期的预防效果的药物的量，例如预防或延迟损伤、疾病、病理或病状的发作(或复发)或降低损伤、疾病、病理或病状或其症状发作(或复发)的可能性。完全预防效果不一定通过施用一次剂量发生，并且可以在仅施用一系列剂量之后发生。因此，预防有效量可以按一次或多次施用形式施用。如本文所使用，“活性降低量”是指相对于不存在拮抗剂，降低酶的活性所需的拮抗剂的量。如本文所使用，“功能破坏量”是指相对于不存在拮抗剂，破坏酶或蛋白质的功能所需的拮抗剂的量。确切量将取决于治疗的目的，并且将可由本领域的技术人员使用已知的技术确定(参见例如，Lieberman,PharmaceuticalDosage Forms(vols.1-3,1992)；Lloyd,The Art,Science and Technology ofPharmaceutical Compounding(1999)；Pickar,Dosage Calculations(1999)；和Remington:The Science and Practice of Pharmacy,20th Edition,2003,Gennaro,Ed.,Lippincott,Williams&Wilkins)。

对于本文所描述的任何化合物，治疗有效量可以最初由细胞培养测定确定。目标浓度将是能够实现本文所描述的方法的，如使用本文所描述或本领域已知的方法测量的一种或多种活性化合物的浓度。

如本领域所熟知的，用于人的治疗有效量也可以根据动物模型确定。例如，可以调配针对人的剂量以实现已发现对动物有效的浓度。人体内的剂量可以通过监测化合物有效性以及上调或下调如上文所描述的剂量来调整。基于以上所描述的方法和其它方法调整剂量以实现在人中的最大功效完全处于普通技术人员的能力内。

如本文所使用的，术语“治疗有效量”是指如上文所描述的足以改善病症的治疗剂的量。例如，对于给定参数，治疗有效量将显示增加或降低至少5％、10％、15％、20％、25％、40％、50％、60％、75％、80％、90％或至少100％。治疗功效也可以表示为“倍数”增加或减少。例如，治疗有效量相对于对照物可以具有至少1.2倍、1.5倍、2倍、5倍或更多的效果。

剂量可以根据患者的需要和所采用的化合物而变化。在本公开的上下文中，向患者施用的剂量应足以随时间推移而在患者体内产生有益治疗应答。剂量的大小也将通过任何不良副作用的存在、性质和程度确定。针对具体情况来确定适当的剂量是在执业者的技能之内的。通常，治疗开始于比化合物的最优剂量小的较小剂量。此后，以小的增量来增加剂量，直到在多个情况下达到最佳效果。剂量和间隔可以单独调整以提供所施用化合物的对所治疗的特定临床适应症有效的水平。这将提供与个体疾病状态的严重程度相称的治疗方案。

如本文所使用的，术语“施用”意指向受试者口服施用、以栓剂形式施用、局部接触、静脉内、肠胃外、腹膜内、肌内、病灶内、鞘内、鼻内或皮下施用，或植入缓慢释放装置(例如，微型渗透泵)。通过任何途径进行施用，包含肠胃外和经粘膜(例如，颊、舌下、腭、牙龈、鼻、阴道、直肠或经皮)。肠胃外施用包括例如静脉内、肌内、动脉内、皮内、皮下、腹膜内、心室内和颅内施用。其它递送模式包括但不限于使用脂质体制剂、静脉内输注、经皮贴片等。在实施例中，所述施用不包括施用除所叙述活性剂以外的任何活性剂。

“共施用”意思指，在施用一种或多种另外的疗法的同时、恰好之前或恰好之后，来施用本文所描述的组合物。本文所提供的化合物可以向患者单独施用或可以共施用。共施用意图包括化合物单独地或以组合形式(多于一种化合物)同时或依序施用。因此，当需要时，制剂还可以与其它活性物质结合(例如以减少代谢降解)。本公开的组合物可以透皮，通过表面途径递送，或配制成施用棒、溶液、悬浮液、乳液、凝胶、乳膏、软膏、糊剂、胶状物、涂剂、粉剂和气雾剂形式。

如本文所用，“抗癌剂”是指用于通过破坏或抑制癌细胞或组织来治疗癌症的分子(例如化合物、肽、蛋白质、核酸、0103)。抗癌剂可能对某些癌症或某些组织具有选择性。在实施例中，文中的抗癌剂可能包括表观遗传抑制剂和多激酶抑制剂，“抗癌剂”根据其平常普通的含义使用，并且是指具有抗肿瘤特性或抑制细胞生长或增殖的能力的组合物(例如化合物、药物、拮抗剂、抑制剂、调节剂)。在一些实施例中，抗癌剂是化学治疗剂。在一些实施例中，抗癌剂是本文鉴定的在治疗癌症的方法中具有效用的药剂。在一些实施例中，抗癌剂是由FDA或美国以外的其它国家的类似管理机构批准用于治疗癌症的药剂。抗癌剂的实例包括但不限于MEK(例如MEK1、MEK2或MEK1和MEK2)抑制剂(例如XL518、CI-1040、PD035901、司美替尼(selumetinib)/AZD6244、GSK1120212/曲美替尼(trametinib)、GDC-0973、ARRY-162、ARRY-300、AZD8330、PD0325901、U0126、PD98059、TAK-733、PD318088、AS703026、BAY 869766)、烷化剂(例如，环磷酰胺、异环磷酰胺、苯丁酸氮芥、白消安、美法仑(melphalan)、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、乌拉莫司汀(uramustine)、噻替派(thiotepa)、亚硝基脲(nitrosoureas))、氮芥(例如，二氯甲基二乙胺、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、美法仑)、乙烯亚胺和甲基三聚氰胺(例如，六甲基三聚氰胺、噻替派)、烷基磺酸盐(例如白消安)、亚硝基脲(例如，卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomusitne)、司莫司汀(semustine)、链脲佐菌素(streptozocin)、三氮烯(达卡巴嗪(decarbazine)))、抗代谢物(例如5-硫唑嘌呤、甲酰四氢叶酸、卡培他滨(capecitabine)、氟达拉滨(fludarabine)、吉西他滨(gemcitabine)、培美曲塞(pemetrexed)、雷替曲塞(raltitrexed)、叶酸类似物(例如甲氨蝶呤)或嘧啶类似物(例如氟尿嘧啶、氟尿苷、阿糖胞苷)、嘌呤类似物(例如，巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、喷司他汀(pentostatin))等、植物生物碱(例如长春新碱、长春碱、长春瑞滨、长春地辛、鬼臼毒素、紫杉醇、多西紫杉醇等)、拓扑异构酶抑制剂(例如伊立替康(irinotecan)、拓扑替康(topotecan)、安吖啶(amsacrine)、依托泊苷(etoposide)(VP16)、磷酸依托泊苷、替尼泊苷(teniposide)等)、抗肿瘤抗生素(例如多柔比星(doxorubicin)、阿霉素、柔红霉素、表柔比星(epirubicin)、放线菌素、博来霉素(bleomycin)、丝裂霉素、米托蒽醌(mitoxantrone)、普卡霉素(plicamycin)等)、铂类化合物(例如顺铂、奥沙利铂、卡铂))、蒽二酮(例如，米托蒽醌)、经取代的脲(例如，羟基脲)、甲基肼衍生物(例如，丙卡巴肼(procarbazine))、肾上腺皮质抑制剂(例如，米托坦、氨基乙酰亚胺)、表鬼臼毒素(例如依托泊苷)、抗生素(例如柔红霉素、多柔比星、博来霉素)、酶(例如L-天冬酰胺酶)、丝裂原激活蛋白激酶信号传导的抑制剂(例如U0126、PD98059、PD184352、PD0325901、ARRY-142886、SB239063、SP600125、BAY 43-9006、渥曼青霉素(wortmannin)或LY294002、Syk抑制剂、mTOR抑制剂、抗体(例如利妥昔单抗(rituxan))、棉子酚(gossyphol)、genasense、多酚E、Chlorofusin、全反式维甲酸(ATRA)、苔藓抑素、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)、5-氮杂-2'-脱氧胞苷、全反式维甲酸、多柔比星、长春新碱、依托泊苷、吉西他滨、伊马替尼(Gleevec.RTM.)、格尔德霉素(geldanamycin)、17-N-烯丙基氨基-17-去甲氧基格尔德霉素(17-AAG)、夫拉平度(flavopiridol)、LY294002、硼替佐米(bortezomib)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、BAY 11-7082、PKC412、PD184352、20-表-1,25二羟基维生素D3；5-乙炔基尿嘧啶；阿比特龙(abiraterone)；阿柔比星(aclarubicin)；酰基富烯(acylfulvene)；腺环戊醇(adecypenol)；阿多来新(adozelesin)；阿地白介素(aldesleukin)；ALL-TK拮抗剂；六甲蜜胺(altretamine)；氨莫司汀(ambamustine)；2,4-二氯苯氧乙酸(amidox)；氨磷汀(amifostine)；氨基酮戊酸；氨柔比星(amrubicin)；安吖啶(amsacrine)；阿那格雷(anagrelide)；阿那曲唑(anastrozole)；穿心莲内酯(andrographolide)；血管生成抑制剂；拮抗剂D；拮抗剂G；安雷利克斯(antarelix)；抗背转形态发生蛋白-1；抗雄激素、前列腺癌物质；抗雌激素；抗瘤酮(antineoplaston)；反义寡核苷酸；姆肠菌素甘氨酸(aphidicolin glycinate)；凋亡基因调节剂；细胞凋亡调节剂；脱嘌呤核酸；ara-CDP-DL-PTBA；精氨酸脱氨酶；奥沙那宁(asulacrine)；阿他美坦(atamestane)；阿莫司汀(atrimustine)；海洋环肽1(axinastatin 1)；海洋环肽2；海洋环肽3；偶氮丝氨酸(azasetron)；阿扎毒素(azatoxin)；重氮酪氨酸(azatyrosine)；浆果赤霉素III(baccatinIII)衍生物；balanol；巴马司他(batimastat)；BCR/ABL措抗剂；苯并二氢卟酚(benzochlorin)；苯甲酰星孢素(benzoylstaurosporine)；β-内酰胺衍生物；β-阿里辛(β-alethine)；β克拉霉素B；桦木酸(betulinic acid)；bFGF抑制剂；比卡鲁胺(bicalutamide)；比生群(bisantrene)；双氮丙啶精胺(bisaziridinylspermine)；双奈法德(bisnafide)；比特迪尼(bistratene)A；比折来新(bizelesin)；贝伏特(breflate)；溴匹立明(bropirimine)；布布度钛(budotitane)；丁胱亚磺酸亚胺(buthioninesulfoximine)；卡泊三醇(calcipotriol)；卡弗他丁(calphostin)C；喜树减衍生物；金丝雀痘(canarypox)IL-2；卡培他滨(capecitabine)；羧酸胺-氨基-三唑(carboxamide-amino-triazole)；羧基酸胺三唑(carboxyamidotriazole)；CaRest M3；CARN 700；软骨衍生抑制剂；卡折来新(carzelesin)；酪蛋白激酶抑制剂(ICOS)；粟精胺(castanospermine)；杀菌肽B(cecropin B)；西曲瑞克(cetrorelix)；双氢叶吩(chlorin)；氯代喹喔啉磺酰胺(chloroquinoxaline sulfonamide)；西卡前列素(cicaprost)；顺式-卟啉(cis-porphyrin)；克拉屈滨(cladribine)；氯米芬类似物(clomifene analogues)；克霉唑(clotrimazole)；克利霉素(collismycin)A；克利霉素B；考布他汀A4(combretastatinA4)；考布他汀类似物；克纳宁(conagenin)；科莱贝司丁(crambescidin)816；克立那托(crisnatol)；念珠藻素(cryptophycin)8；念珠藻素A衍生物；麻疯树毒蛋白(curacin A)；环戊蒽醌(cyclopentanthraquinone)；环普拉坦(cycloplatam)；塞培霉素(cypemycin)；阿糖胞苷十八烷基磷酸盐(cytarabine ocfosfate)；溶细胞因子(cytolytic factor)；磷酸己烷雌酚(cytostatin)；达昔单抗(dacliximab)；地西他滨(decitabine)；脱氢代代宁B；地洛瑞林(deslorelin)；地塞米松(dexamethasone)；右异环磷酰胺(dexifosfamide)；右雷佐生(dexrazoxane)；右维拉帕米(dexverapamil)；地吖醌(diaziquone)；代代宁B；二羟基苯并氧肟酸(didox)；二乙基正精胺(diethyInorspermine)；二氢-5-氮胞苷；9-二氧霉素(9-dioxamycin)；联苯螺莫司汀(diphenyl spiromustine)；二十二烷醇(docosanol)；多拉司琼(dolasetron)；去氧氟尿苷(doxifIuridine)；屈洛昔芬(droloxifene)；屈大麻酚(dronabinol)；多卡霉素(duocarmycin)SA；依布硒(ebselen)；依考莫司汀(ecomustine)；依地福新(edelfosine)；依决洛单抗(edrecolomab)；依氟鸟氨酸(eflornithine)；榄香烯(elemene)；乙嘧替氟(emitefur)；表柔比星；依立雄胺(epristeride)；雌氮芥类似物；雌激素激动剂；雌激素拮抗剂；依他硝唑(etanidazole)；磷酸依托泊苷；依西美坦(exemestane)；法倔唑(fadrozole)；法扎拉宾(fazarabine)；芬维A胺(fenretinide)；非格司亭(filgrastim)；非那雄胺(finasteride)；黄皮酮(flavopiridol)；氟卓司汀(flezelastine)；夫卢丝龙(fIuasterone)；氟达拉滨(fludarabine)；盐酸氟代柔红霉素(fluorodaunorunicin hydrochloride)；福酚美克(forfenimex)；福美坦(formestane)；福司曲星(fostriecin)；福莫司汀(fotemustine)；德卟啉钆(gadolinium texaphyrin)；硝酸镓；加洛他滨(galocitabine)；加尼瑞克(ganirelix)；明胶酶抑制剂；吉西他滨；谷胱甘肽抑制剂；赫舒反(hepsulfam)；调蛋白(heregulin)；六亚甲基二乙酰胺；金丝桃素(hypericin)；伊班膦酸(ibandronic acid)；伊达比星(idarubicin)；艾多昔芬(idoxifene)；伊决孟酮(idramantone)；伊莫福新(ilmofosine)；伊洛马司他(ilomastat)；咪唑并吖啶酮(imidazoacridone)；咪喹莫特(imiquimod)；免疫剌激肽；胰岛素样生长因子-1受体抑制剂；干扰素激动剂；干扰素；白细胞介素；碘苄胍(iobenguane)；碘阿霉素(iododoxorubicin)；4-甘薯苦醇(ipomeanol，4-)；伊罗普拉(iroplact)；伊索拉定(irsogladine)；异本格唑(isobengazole)；异高软海绵素B(isohomohalicondrin)B；依他司琼(itasetron)；促微丝聚合剂(jasplakinolide)；卡哈拉得(kahalalide)F；片螺素(lamellarin)-N三乙酸；兰瑞肽(lanreotide)；雷纳霉素(leinamycin)；来格斯汀(lenograstim)；硫酸香菇多糖(lentinan sulfate)；莱托斯汀(leptolstatin)；来曲唑(Ietrozole)；白血病抑制因子；白细胞α干扰素；亮丙立德+雌激素+孕酮；亮丙瑞林(Ieuprorelin)；左旋咪唑(Ievamisole)；利阿唑(liarozole)；直链多胺类似物；亲脂二糖肽；亲脂铂化合物；利索纳得(lissoclinamide)7；洛铂(lobaplatin)；蚯蚓磷脂(lombricine)；洛美曲索(lometrexol)；氯尼达明(lonidamine)；洛索蒽醌(losoxantrone)；洛伐他汀(lovastatin)；洛索立滨(loxoribine)；勒托替康(lurtotecan)；德卟啉镥(lutetium texaphyrin)；莱索菲林(lysofylline)；裂解肽；美坦辛(maitansine)；抑甘露糖苷酶素A(mannostatin A)；马立马司他(marimastat)；马索罗芬(masoprocol)；马斯平(maspin)；溶基质蛋白抑制剂(matrilysin inhibitor)；基质金属蛋白酶抑制剂；美诺立尔(menogaril)；硫巴妥苯胺(merbarone)；美替瑞林(meterelin)；甲硫氨酸酶(methioninase)；甲氧氯普胺(metoclopramide)；MIF抑制剂；米非司酮(mifepristone)；米替福新(miltefosine)；米立司亭(mirimostim)；错配双链RNA；米托胍腙(mitoguazone)；二溴卫矛醇(mitolactol)；丝裂霉素类似物；米托萘胺(mitonafide)；米托毒素(mitotoxin)成纤维细胞生长因子-皂草毒蛋白；米托蒽醌；莫法罗汀(mofarotene)；莫拉司亭(molgramostim)；人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体；单磷酰脂质A+分枝杆菌细胞壁骨架；莫哌达醇(mopidamol)；多抗药基因抑制剂；基于多肿瘤抑制剂-1的疗法；芥类抗癌剂；印度洋海绵B(mycaperoxide B)；分枝杆菌细胞壁提取物；米亚普龙(myriaporone)；N-乙酰地那林(N-acetyldinaline)；N-取代的苯甲酰胺；那法瑞林(nafarelin)；那瑞替喷(nagrestip)；纳洛酮+喷他佐新(naloxone+pentazocine)；纳帕英(napavin)；萘萜二醇(naphterpin)；那托司亭(nartograstim)；奈达铂(nedaplatin)；奈莫柔比星(nemorubicin)；奈立膦酸(neridronic acid)；中性内肽酶；尼鲁米特(nilutamide)；尼萨霉素(nisamycin)；一氧化氮调节剂；一氧化二氮抗氧化剂；尼多林(nitrullyn)；O6-苄基鸟嘌呤；奥曲肽(octreotide)；奥可斯酮(okicenone)；寡核苷酸；奥那司酮(onapristone)；昂丹司琼(ondansetron)；昂丹司琼；奥莱辛(oracin)；口服细胞因子诱导剂；奥马铂；奥沙特隆(osaterone)；奥沙利铂(oxaliplatin)；氧杂奥诺霉素(oxaunomycin)；帕劳胺(palauamine)；棕榈酰根霉素(palmitoylrhizoxin)；帕米膦酸(pamidronic acid)；人参炔三醇(panaxytriol)；帕诺米芬(panomifene)；副菌铁素(parabactin)；帕折普汀(pazelIiptine)；培门冬酶(pegaspargase)；培得星(peldesine)；戊聚硫钠(pentosanpolysulfate sodium)；喷司他丁(pentostatin)；喷托唑(pentrozole)；全氟溴烷(perflubron)；培磷酰胺(perfosfamide)；紫苏子醇(perillyl alcohol)；苯那霉素(phenazinomycin)；苯乙酸；磷酸酶抑制剂；皮西巴尼(picibanil)；盐酸匹鲁卡品(pilocarpine hydrochloride)；吡柔比星(pirarubicin)；吡曲克辛(piritrexim)；胎盘素(placetin)A；胎盘素B；纤溶酶原激活物抑制剂；铂复合物；铂化合物；铂-三胺复合物；卟吩姆钠(porfimer sodium)；泊非霉素(porfiromycin)；泼尼松(prednisone)；丙基双吖啶酮(propyl bis-acridone)；前列腺素J2(prostaglandin J2)；蛋白酶体抑制剂；基于蛋白A的免疫调节剂；蛋白激酶C抑制剂；微藻蛋白激酶C抑制剂；蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂；嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂；红紫素(purpurins)；吡唑啉吖啶(pyrazoloacridine)；吡哆醛化的血红蛋白聚氧乙烯偶联物；raf拮抗剂；雷替曲塞(raltitrexed)；雷莫司琼(ramosetron)；ras法尼基蛋白转移酶抑制剂；ras抑制剂；ras-GAP抑制剂；去甲基化瑞替普汀(retelliptinedemethylated)依替膦酸铼Re186；根霉素(rhizoxin)；核酶；RII维甲酰胺(retinamide)；罗谷亚胺(rogletimide)；罗希吐碱(rohitukine)；罗莫肽(romurtide)；罗喹美克(roquinimex)；卢比格酮(rubiginone)B1；卢伯西(ruboxyl)；沙芬戈(safingol)；伞托平(saintopin)；SarCNU；萨可菲醇(sarcophytol)A；沙格司亭；Sdi 1模拟物；司莫司汀；衰老衍生的抑制剂1；有义寡核苷酸；信号转导抑制剂；信号转导调节剂；单链抗原结合蛋白；西佐喃(sizofuran)；索布佐生(sobuzoxane)；硼卡钠；苯基乙酸钠；索尔醇(solverol)；生长调节素结合蛋白；索纳明(sonermin)；膦门冬酸(sparfosic acid)；斯卡霉素(spicamycin)D；螺莫司汀；脾脏五肽(splenopentin)；海绵他汀(spongistatin)1；角鲨胺；干细胞抑制剂；干细胞分裂抑制剂；斯提酰胺(stipiamide)；溶基质素(stromelysin)抑制剂；斯菲诺辛(sulfinosine)；强效血管活性肠肽拮抗剂；素拉迪塔(suradista)；苏拉明(suramin)；苦马豆碱(suramin)；合成粘多糖；他莫司汀；甲碘他莫昔芬；牛磺莫司汀；他扎罗汀；替可加兰钠；替加氟(tegafur)；碲吡喃洋(tellurapyrylium)；端粒酶抑制剂；替莫泊芬(temoporfin)；替莫唑胺(temozolomide)；替尼泊苷；十氧化四氯(tetrachlorodecaoxide)；四佐胺(tetrazomine)；泰立拉汀(thaliblastine)；噻可拉林；血小板生成素(thrombopoietin)；血小板生成素模拟物；胸腺法新(thymalfasin)；胸腺生成素受体激动剂；胸腺曲南(thymotrinan)；促甲状腺激素；本紫红素乙酯锡(tin ethyletiopurpurin)；替拉扎明(tirapazamine)；二氯环戊二烯钛；拓扑森汀(topsentin)；托瑞米芬(toremifene)；全能干细胞因子；翻译抑制剂；维甲酸；三乙酰基尿苷；曲西立滨(triciribine)；三甲曲沙(trimetrexate)；曲普瑞林(triptorelin)；托烷司琼(tropisetron)；妥罗雄脲(turosteride)；酪氨酸激酶抑制剂；酪氨酸磷酸化抑制剂(tyrphostin)；UBC抑制剂；乌苯美司(ubenimex)；泌尿生殖窦来源的生长抑制因子；脲激酶受体拮抗剂；伐普肽(vapreotide)；瓦立奥林(variolin)B；载体系统，红细胞基因疗法；维拉雷琐(velaresol)；藜芦明(veramine)；瓦尔丁(verdins)；维替泊芬(verteporfin)；长春瑞滨；威科萨汀(vinxaltine)；维他辛(vitaxin)；伏氯唑(vorozole)；扎诺特隆(zanoterone)；折尼铂(zeniplatin)；亚苄维C(zilascorb)；净司他丁斯酯(zinostatinstimalamer)、阿霉素(Adriamycin)、放线菌素D(Dactinomycin)、博来霉素、长春碱、顺铂、阿西维辛(acivicin)；阿柔比星；盐酸阿可达佐(acodazole hydrochloride)；阿克罗宁(acronine)；阿多来新(adozelesin)；阿地白介素；六甲蜜胺；安波霉素(ambomycin)；醋酸阿美坦醌(ametantrone acetate)；氨鲁米特(aminoglutethimide)；安吖啶(amsacrine)；阿那曲唑(anastrozole)；氨茴霉素(anthramycin)；天冬酰胺酶；曲林菌素(asperlin)；阿扎胞苷；阿扎替派(azetepa)；阿佐霉素(azotomycin)；巴马司他(batimastat)；苯佐替派(benzodepa)；比卡鲁胺(bicalutamide)；盐酸必桑郡(bisantrene hydrochloride)；双奈法德(bisnafide dimesylate)；比折来新(bizelesin)；硫酸博来霉素；布喹那(brequinarsodium)；溴匹立明(bropirimine)；白消安；放线菌素(cactinomycin)；卡普睾酮(calusterone)；卡拉酰胺(caracemide)；卡贝替姆(carbetimer)；卡铂；卡莫司汀；盐酸卡米诺霉素(carubicin hydrochloride)；卡折来新(carzelesin)；西地芬戈(cedefingol)；苯丁酸氮芥；西罗霉素(cirolemycin)；克拉屈滨(cladribine)；甲磺酸克雷斯托(crisnatol mesylate)；环磷酰胺；阿糖胞苷；达卡巴嗪；盐酸柔红霉素；地西他滨；右奥马铂(dexormaplatin)；地扎胍宁(dezaguanine)；甲磺酸地扎胍宁；亚丝醌(diaziquone)；多柔比星；盐酸多柔比星；屈洛昔芬(droloxifene)；柠檬酸屈洛昔芬；丙酸屈他雄酮；达佐霉素(duazomycin)；依达曲沙；盐酸依氟鸟氨酸；依沙芦星(elsamitrucin)；恩洛铂(enloplatin)；恩普氨酯(enpromate)；依匹哌啶(epipropidine)；盐酸表柔比星；厄布洛唑(erbulozole)；盐酸依索比星(esorubicin)；雌莫司汀；雌莫司汀磷酸钠；依他硝唑(etanidazole)；依托泊苷；磷酸依托泊苷；艾托卜宁(etoprine)；盐酸法屈唑(fadrozolehydrochloride)；法扎拉滨(fazarabine)；芬维A胺(fenretinide)；氟尿苷；磷酸氟达拉滨；氟尿嘧啶；氟西他滨(fluorocitabine)；磷喹酮(fosquidone)；福司曲星钠(fostriecinsodium)；吉西他滨；盐酸吉西他滨；羟基脲；盐酸伊达比星；异环磷酰胺；伊莫福新(ilmofosine)；白细胞介素I1(包括重组白细胞介素II或rIL2)、干扰素α-2a；干扰素α-2b；干扰素α-n1；干扰素α-n3；干扰素β-1a；干扰素γ-1b；异丙铂(iproplatin)；盐酸伊立替康；醋酸兰瑞肽(lanreotide acetate)；来曲唑(letrozole)；醋酸亮丙瑞林(leuprolideacetate)；盐酸利唑(liarozole hydrochloride)；洛美曲索钠(lometrexol sodium)；洛莫司汀；盐酸洛索蒽醌(losoxantrone hydrochloride)；马索罗酚(masoprocol)；美坦辛(maytansine)；盐酸氮芥；醋酸甲地孕酮；醋酸美仑孕酮(melengestrol acetate)；美法仑；美诺立尔(menogaril)；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；甲氨蝶呤钠；氯苯氨啶(metoprine)；美妥替哌(meturedepa)；米丁度胺(mitindomide)；米托卡星(mitocarcin)；丝裂红素(mitocromin)；米托洁林(mitogillin)；米托马星(mitomalcin)；丝裂霉素；米托司培(mitosper)；米托坦；盐酸米托蒽醌；霉酚酸(mycophenolic acid)；诺考达唑(nocodazole)；诺拉霉素(nogalamycin)；奥马铂(ormaplatin)；奥昔舒仑(oxisuran)；培加帕酶(pegaspargase)；培利霉素(peliomycin)；戊氮芥(pentamustine)；硫酸培洛霉素(peplomycin sulfate)；培磷酰胺(perfosfamide)；哌泊溴烷(pipobroman)；哌泊舒凡(piposulfan)；盐酸吡罗蒽醌(piroxantrone hydrochloride)；普卡霉素；普洛美坦(plomestane)；卟吩姆钠(porfimersodium)；泊非霉素(porfiromycin)；泼尼莫司汀(prednimustine)；盐酸丙卡巴肼；嘌呤霉素(puromycin)；盐酸嘌呤霉素；吡唑呋喃菌素(pyrazofurin)；利波腺苷(riboprine)；罗谷亚胺(rogletimide)；沙芬戈(safingol)；盐酸沙芬戈；司莫司汀；辛曲秦(simtrazene)；磷乙酰天冬氨酸钠(sparfosate sodium)；司帕霉素(sparsomycin)；盐酸螺旋锗(spirogermanium hydrochloride)；螺莫司汀(spiromustine)；螺铂(spiroplatin)；链黑霉素(streptonigrin)；链佐星(streptozocin)；磺氯苯脲(sulofenur)；他利霉素(talisomycin)；替可加兰钠(tecogalan sodium)；替加氟；盐酸替洛蒽醌(teloxantronehydrochloride)；替莫泊芬(temoporfin)；替尼泊苷；替罗昔隆(teroxirone)；睾内酯(testolactone)；硫咪嘌呤(thiamiprine)；硫鸟嘌呤；塞替派；噻唑羧胺核苷(tiazofurin)；替拉扎明(tirapazamine)；柠檬酸托瑞米芬(toremifene citrate)；醋酸曲托龙(trestolone acetate)；磷酸曲西立滨(triciribine phosphate)；三甲曲沙；葡糖醛酸三甲曲沙；曲普瑞林(triptorelin)；盐酸妥布氯唑(tubulozole hydrochloride)；尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；乌瑞替派(uredepa)；伐普肽(vapreotide)；维替泊芬(verteporfin)；硫酸长春碱；硫酸长春新碱；长春地辛；硫酸长春地辛；硫酸长春匹定(vinepidine sulfate)；硫酸长春甘酯(vinglycinate sulfate)；硫酸环氧长春碱(vinleurosine sulfate)；酒石酸长春瑞滨；硫酸异长春碱(vinrosidine sulfate)；硫酸长春利定(vinzolidine sulfate)；伏氯唑(vorozole)；折尼铂(zeniplatin)；净司他丁(zinostatin)；盐酸佐柔比星(zorubicin hydrochloride)，将细胞阻止在G2-M期和/或调节微管的形成或稳定性的药剂(例如Taxol.TM(即紫杉醇)、Taxotere.TM、包含紫杉烷骨架的化合物、Erbulozole(即R-55104)、尾海兔素(Dolastatin)10(即DLS-10和NSC-376128)、Mivobulin羟乙基磺酸盐(即作为CI-980)、长春新碱、NSC-639829、圆皮海绵内酯(Discodermolide)(即作为NVP-XX-A-296)、ABT-751(Abbott，即E-7010)、Altorhyrtins(例如Altorhyrtin A和Altorhyrtin C)、海绵他汀(例如海绵他汀1，海绵他汀2、海绵他汀3、海绵他汀4、海绵他汀5、海绵他汀6、海绵他汀7、海绵他汀8和海绵他汀9)，盐酸西马多丁(Cemadotin hydrochloride)(即LU-103793和NSC-D-669356)、埃博霉素(Epothilone)(例如埃博霉素A、埃博霉素B、埃博霉素C(即脱氧埃博霉素A或dEpoA)、埃博霉素D(即KOS-862、dEpoB和脱氧埃博霉素B)、埃博霉素E、埃博霉素F、埃博霉素B N-氧化物、埃博霉素A N-氧化物、16-氮杂-埃博霉素B、21-氨基埃博霉素B(即BMS-310705)、21-羟基埃博霉素D(即脱氧埃博霉素F和dEpoF)、26-氟埃博霉素、瑞奥他汀PE(即NSC-654663)、索利多汀(Soblidotin)(即TZT-1027)、LS-4559-P(Pharmacia，即LS-4577)、LS-4578(Pharmacia，即LS-477-P)、LS-4477(Pharmacia)、LS-4559(Pharmacia)、RPR-112378(Aventis)、硫酸长春新碱、DZ-3358(Daiichi)、FR-182877(Fujisawa，即WS-9885B)、GS-164(Takeda)、GS-198(Takeda)、KAR-2(Hungarian Academy of Sciences)、BSF-223651(BASF，即ILX-651和LU-223651)、SAH-49960(Lilly/Novartis)、SDZ-268970(Lilly/Novartis)、AM-97(Armad/Kyowa Hakko)、AM-132(Armad)、AM-138(Armad/Kyowa Hakko)、IDN-5005(Indena)、克来普妥素(Cryptophycin)52(即LY-355703)、AC-7739(Ajinomoto，即AVE-8063A和CS-39.HCl)、AC-7700(Ajinomoto，即AVE-8062、AVE-8062A、CS-39-L-Ser.HCl和RPR-258062A)、维替乐福酰胺(Vitilevuamide)、小管素(Tubulysin)A、加纳单索(Canadensol)、矢车菊黄素(Centaureidin)(即NSC-106969)、T-138067(Tularik，即T-67、TL-138067和TI-138067)、COBRA-1(Parker Hughes Institute，即DDE-261和WHI-261)、H10(Kansas StateUniversity)、H16(Kansas State University)、杀肿瘤素(Oncocidin)A1(即BTO-956和DIME)、DDE-313(Parker Hughes Institute)、非将诺来(Fijianolide)B、劳カ马来(Laulimalide)、SPA-2(Parker Hughes Institute)、SPA-1(Parker Hughes Institute，即SPIKET-P)、3-IAABU(Cytoskeleton/Mt.Sinai School of Medicine，即MF-569)、纳可辛(Narcosine)(也称为NSC-5366)、纳司卡滨(Nascapine)、D-24851(Asta Medica)、A-105972(Abbott)、丰星素(Hemiasterlin)、3-BAABU(Cytoskeleton/Mt.Sinai School ofMedicine，即MF-191)、TMPN(Arizona State University)、双钒乙酰丙酮、T-138026(Tularik)、Monsatrol、lnanocine(即NSC-698666)、3-IAABE(Cytoskeleton/Mt.SinaiSchool of Medicine)、A-204197(Abbott)、T-607(Tuiarik，即T-900607)、RPR-115781(Aventis)、五加素(Eleutherobin)(诸如去甲基五加素、去乙酰基五加素、异五加素A和Z-五加素)、卡利贝昔(Caribaeoside)、卡利贝林(Caribaeolin)、海利软骨胶(Halichondrin)B、D-64131(Asta Medica)、D-68144(Asta Medica)、重氮酰胺(Diazonamide)A、A-293620(Abbott)、NPI-2350(Nereus)、他卡诺洛来(Taccalonolide)A、TUB-245(Aventis)、A-259754(Abbott)、ニ奥唑司达汀(Diozostatin)、(-)-苯基阿西司汀(Phenylahistin)(即NSCL-96F037)、D-68838(Asta Medica)、D-68836(Asta Medica)、肌割蛋白(Myoseverin)B、D-43411(Zentaris，即D-81862)、A-289099(Abbott)、A-318315(Abbott)、HTI-286(即SPA-110，三氟乙酸盐)(Wyeth)、D-82317(Zentaris)、D-82318(Zentaris)、SC-12983(NCI)、力司弗拉司达汀(Resverastatin)磷酸钠、BPR-OY-007(National Health ResearchInstitutes)和SSR-250411(Sanofi))，类固醇(例如，地塞米松)、非那甾胺、芳香酶抑制剂、促性腺激素释放激素激动剂(GnRH)如戈舍瑞林或亮丙瑞林、肾上腺皮质激素(例如，泼尼松)、孕激素(例如，羟基孕酮己酸酯、醋酸甲地孕酮、醋酸甲羟孕酮)、雌激素(例如，二乙烯雌酚，乙炔雌二醇)、抗雌激素(例如，他莫昔芬)、雄激素(例如，丙酸睾酮、氟甲睾酮)、抗雄激素(例如，氟他胺)、免疫刺激剂(例如，卡介苗(BCG)、左旋咪唑、白细胞介素-2、α-干扰素等)、单克隆抗体(例如，抗CD20、抗HER2、抗CD52、抗HLA-DR和抗VEGF单克隆抗体)、免疫毒素(例如，抗CD33单克隆抗体-加利车霉素缀合物、抗CD22单克隆抗体-假单胞菌外毒素偶联物等)、放射性免疫疗法(例如，与¹¹¹In、⁹⁰Y或¹³¹I等偶联的抗CD20单克隆抗体)、雷公藤内酯(triptolide)、高三尖杉酯碱(homoharringtonine)、放线菌素D、多柔比星、表柔比星、拓扑替康、伊曲康唑、长春地辛、西立伐他汀(cerivastatin)、长春新碱、脱氧腺苷、舍曲林(sertraline)、匹伐他汀(pitavastatin)、伊立替康、氯法齐明(clofazimine)、5-壬氧基色胺、威罗菲尼(vemurafenib)、达拉菲尼(dabrafenib)、厄洛替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)、EGFR抑制剂、表皮生长因子受体(EGFR)靶向疗法或治疗剂(例如吉非替尼(Iressa^TM)、厄洛替尼(Tarceva^TM)、西妥昔单抗(Erbitux^TM)、拉帕替尼(Tykerb^TM)、帕尼单抗(Vectibix^TM)、凡德他尼(Caprelsa^TM)、阿法替尼/BIBW2992、CI-1033/卡那替尼(canertinib)、来那替尼(neratinib)/HKI-272、CP-724714、TAK-285、AST-1306、ARRY334543、ARRY-380、AG-1478、达克替尼(dacomitinib)/PF299804、OSI-420/去甲埃罗替尼、AZD8931、AEE788、培利替尼(pelitinib)/EKB-569、CUDC-101、WZ8040、WZ4002、WZ3146、AG-490、XL647、PD153035、BMS-599626)、索拉非尼(sorafenib)、伊马替尼(imatinib)、舒尼替尼(sunitinib)、达沙替尼(dasatinib)等。

化合物的“选择性(Selective/selectivity)”或其类似术语是指化合物区分分子靶标的能力(例如对ROR1具有选择性的化合物)。

化合物的“特异性(Specific/specifically/specificity)”或其类似术语是指化合物对特定分子靶标产生特定作用(如抑制)而对细胞中其它蛋白质的作用很小或没有作用的能力。

“ROR1抑制剂”是指当相较于对照，如不存在化合物或已知无活性的化合物时，降低ROR1受体的活性的化合物(例如本文所描述的化合物)。

“接触”按照其简单的普通含义使用，并且是指允许至少两种不同的物质(例如，包括生物分子或细胞的化合物)变得足够近以发生反应、相互作用或物理接触的过程。然而，应理解，所产生的反应产物可以由所添加的试剂之间的反应或由来自一种或多种所添加的试剂的中间物直接产生，所述中间物可以在反应混合物中产生。

如本文所定义，关于蛋白质-抑制剂相互作用，术语“抑制(inhibition/inhibit/inhibiting)”和其类似术语意指，相对于在不存在抑制剂下蛋白质的活性或功能，负面影响(例如，降低)蛋白质活性或功能。在实施例中，抑制意指相对于在不存在抑制剂的情况下的蛋白质的浓度或水平，负面地影响(例如降低)蛋白质的浓度或水平。在实施例中，抑制是指疾病或疾病的症状减少。在实施例中，抑制是指特定蛋白质靶标的活性降低。因此，抑制至少部分地包含部分或完全阻断刺激、降低、预防或延迟激活、脱敏或下调信号转导或酶活性或蛋白质的量。在实施例中，抑制是指由直接相互作用(例如，抑制剂与靶蛋白结合)造成的靶蛋白的活性降低。在实施例中，抑制是指由间接相互作用引起的靶蛋白的活性降低(例如，抑制剂与激活靶蛋白的蛋白质结合，从而防止靶蛋白激活)。“ROR1抑制剂”是相对于在不存在抑制剂的情况下的ROR1的活性或功能，负面影响(例如降低)ROR1的活性或功能的化合物。

术语“表达”包括涉及产生多肽的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。可以使用用于检测蛋白质的常规技术(例如，ELISA、蛋白质印迹、流式细胞术、免疫荧光、免疫组织化学等)来检测表达。

在与疾病(例如蛋白质相关疾病、与ROR1活性相关的癌症、ROR1相关癌症、ROR1相关疾病(例如癌症、炎症性疾病、自身免疫性疾病或感染性疾病))相关的物质或物质活性或功能的情形中，术语“相关”或“与…相关”意思指，所述疾病(例如癌症、炎症性疾病、自身免疫性疾病或感染性疾病))是(完全或部分地)由所述物质或物质活性或功能引起，或所述疾病的症状是(完全或部分地)由所述物质或物质活性或功能引起。如本文所使用，如果病原体可以是治疗疾病的靶，则其被描述为与疾病相关。例如，在ROR1活性或功能(例如，信号通路活性)引起疾病(例如，癌症、炎症性疾病、自身免疫性疾病或传染病)的情况下，与ROR1活性或功能相关的癌症或ROR1相关疾病(例如，癌症、炎症性疾病、自身免疫性疾病或传染病)可以用ROR1调节剂或ROR1抑制剂治疗。例如，在ROR1活性或功能增加(例如，信号通路活性)导致疾病的情况下，与ROR1活性或功能相关的炎症性疾病或ROR1相关的炎症性疾病，可用ROR1调节剂和ROR1抑制剂治疗。

如本文所使用，术语“信号通路”是指细胞的和任选地细胞外组分(例如蛋白质、核酸、小分子、离子、脂质)之间的一系列相互作用，其将一种组分的变化传送至一种或多种其它组分，该一种或多种其它组分又可将变化传送至另外的组分，任选地传播给其它信号通路组分。

应当理解，本文描述的实例和实施例仅用于说明目的，并且鉴于其的各种修改或改变将被建议给本领域技术人员，并且将被包括在本申请的精神和范围以及附加的权利要求的范围之内。本文所引用的所有出版物、专利和专利申请均出于所有目的以其整体通过并入。

组合物

本文提供了重组蛋白/嵌合抗原受体(这些术语自始至终可互换使用)组合物及其使用方法，尤其可用于治疗恶性血液病。申请人已经发现针对ROR-1的嵌合抗原受体(CAR)提供了高度活性和有效的免疫治疗组合物。不受任何特定理论的束缚，已知可抑制它们结合的受体并下调其表面表达的抗体通常不被认为是CAR的良好临床候选物。因此，当由T细胞表达时，包括本文描述的ROR-1抗体的CDR的CAR，包括其实施例，表现出有效的癌症特异性细胞毒性是非常令人惊讶的。

一方面，提供了重组蛋白或包含重组蛋白的组合物，其包括抗原结合区，优选ROR-1结合结构域和跨膜结构域。在实施例中，所述ROR-1结合结构域是抗体。在实施例中，所述ROR-1结合结构域是抗体片段。

在一个方面，提供了重组蛋白，其包括(i)抗体区，其包括：(a)轻链可变结构域，其包含如在SEQ ID NO：43中所列的CDR L1、如SEQ ID NO：44中所列的CDR L2和如SEQ ID NO：45中所列的CDR L3；和(b)重链可变结构域，其包含如SEQ ID NO：46中所列的CDR H1、如SEQID NO：47中所列的CDR H2和如SEQ ID NO：48中所列的CDR H3；和(ii)跨膜结构域。

一方面，提供了嵌合抗原受体。嵌合抗原受体包括：i.抗原结合区，其中抗原结合区特异性结合ROR-1、跨膜结构域、偶联抗原结合区和跨膜结构域的间隔子和细胞内结构域。本文所提供的术语“抗体区”、“抗原结合区”或“抗原结合结构域”自始至终可互换使用，是指本文提供的形成蛋白质的一部分的单价或多价蛋白质部分(即重组蛋白质、嵌合抗原受体)，包括其实施例。因此，本领域普通技术人员会立即认识到抗体区或抗原结合区是能够结合抗原(表位)的蛋白质部分。在实施例中，ROR-1结合结构域包括包含轻链可变区(V_L)和重链可变区(V_H)的抗体区。在实施例中，轻链可变结构域包括如SEQ ID NO:43中所列的CDR L1、如SEQ ID NO:44中所列的CDR L2和如SEQ ID NO:45中所列的CDR L3，并且重链可变结构域包括如SEQ ID NO:46中所列的CDR H1、如SEQ ID NO:47中所列的CDR H2和如SEQID NO:48中所列的CDR H3。需要注意的是，这些CDR属于或衍生自cirmtuzumab(也称为UC-961或99961.1)。cirmtuzumab的开发和结构公开于美国专利申请第14/422,519号中，其全部内容通过引用并入本文并用于所有目的。在实施例中，所述ROR-1结合域包括一个抗体区域，该抗体区域包括SEQ ID NO:49所列的CDR L1、SEQ ID NO:50所列的CDR L2和SEQ IDNO:51所列的CDR L3，并且重链可变结构域包括SEQ ID NO:52所列的CDR H1、SEQ ID NO:53所列的CDR H2和SEQ ID NO:54所列的CDR H3。

一方面，提供了嵌合抗原受体。嵌合抗原受体包括:i.抗原结合区，其中所述抗原结合区特异性结合ROR-1，并且其中所述抗原结合区包括轻链可变区和重链可变区；(a)其中轻链可变结构域包括，如SEQ ID NO:43所列的CDR L1、如SEQ ID NO:44所列的CDR L2和如SEQ ID NO:45所列的CDR L3；重链可变结构域包括，如SEQ ID NO:46所列的CDR H1、如SEQ ID NO:47所列的CDR H2和如SEQ ID NO:48所列的CDR H3；或(b)其中轻链可变结构域，包括如SEQ ID NO:49所列的CDR L1、如SEQ ID NO:50所列的CDR L2和如SEQ ID NO:51所列的CDR L3；重链可变结构域包括，如SEQ ID NO:52所列的CDR H1、如SEQ ID NO:53所列的CDR H2和如SEQ ID NO:54所列的CDR H3；ii.间隔子，其中间隔子包括长度在10至240个氨基酸之间的间隔子；iii.跨膜结构域；和iv.细胞内结构域。

一方面，提供了嵌合抗原受体。嵌合抗原受体包括:i.抗原结合区，其中所述抗原结合区特异性结合ROR-1，并且其中所述抗原结合区包括轻链可变区和重链可变区；(a)其中轻链可变结构域包括，如SEQ ID NO:43所列的CDR L1、如SEQ ID NO:44所列的CDR L2和如SEQ ID NO:45所列的CDR L3；重链可变结构域包括，如SEQ ID NO:46所列的CDR H1、如SEQ ID NO:47所列的CDR H2和如SEQ ID NO:48所列的CDR H3；或(b)其中轻链可变结构域，包括如SEQ ID NO:49所列的CDR L1、如SEQ ID NO:50所列的CDR L2和如SEQ ID NO:51所列的CDR L3；重链可变结构域包括，如SEQ ID NO:52所列的CDR H1、如SEQ ID NO:53所列的CDR H2和如SEQ ID NO:54所列的CDR H3；ii.跨膜结构域；iii.细胞内结构域，其中细胞内结构域包括细胞内T细胞信号转导结构域和选自4-1BB，ICOS，OX-40及其组合的细胞内共刺激结构域。

本文提供的术语“抗体区”和“抗原结合区”自始至终可互换使用，是指形成本文提供的蛋白质(即重组蛋白质、嵌合抗原受体)的一部分的单价或多价蛋白质部分，包括其实施例。因此，本领域普通技术人员会立即认识到抗体区或抗原结合区是能够结合抗原(表位)的蛋白质部分。本文提供的抗体区可包括抗体结构域或其片段域(例如，Fab)。因此，抗体区可以包括轻链可变结构域(VL)和/或重链可变结构域(VH)。

如本文提供的“轻链可变(VL)结构域”是指抗体、抗体变体或其片段的轻链的CDR序列和框架区(FR)序列。在实施例中，抗体区或抗原结合区包括可变轻链结构域和可变重链结构域。本文提供的“可变轻链结构域”是指包含在轻链可变(VL)区(形成其一部分)中的多肽。在实施例中，所述的可变轻链区是轻链可变(VL)结构域。本文提供的“可变重链结构域”是指包含在重链可变(VH)区(形成其一部分)中的多肽。在实施例中，所述可变重链区是重链可变(VH)结构域。在实施例中，轻链可变(VL)结构域包括CDR L1(SEQ ID NO:43)、CDRL2(SEQ ID NO:44)和CDR L3(SEQ ID NO:45)。在实施例中，重链可变(VH)结构域包括CDRH1(SEQ ID NO:46)、CDR H2(SEQ ID NO:47)和CDR H3(SEQ ID NO:48)。需要注意的是，这些CDR属于或衍生自cirmtuzumab(也称为UC-961或99961.1)。cirmtuzumab的开发和结构在美国专利申请第14/422,519号中公开，其全部内容并入本文作为参考并用于所有目的。

在实施例中，所述可变轻链区域是轻链可变(VL)域轻链可变结构域包括SEQ IDNO:21的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:21至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列。在实施例中，所述轻链可变结构域具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:21至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列。在实施例中，所述重链可变结构域包括SEQ IDNO:27的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:27至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列。在实施例中，所述重链可变结构域具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:27至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列。在实施例中

，所述轻链可变结构域包括SEQ ID NO:19的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:19至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列。在实施例中，所述轻链可变结构域具有SEQ IDNO:19的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:19至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列。在实施例中，所述轻链可变结构域包括SEQ ID NO:20的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:20至少80％、85％、90％或95％相同的序列。在实施例中，所述轻链可变结构域具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:20至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列。在实施例中，所述重链可变结构域包括SEQ ID NO:25的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:25至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列。在实施例中，所述重链可变结构域具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:25至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列。在实施例中，所述重链可变结构域包括SEQ ID NO:26的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:26至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列。在实施例中，所述重链可变结构域具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:26至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列。

在实施例中，轻链可变结构域的C-末端与重链可变结构域的N-末端结合。在实施例中，轻链可变结构域的N-末端与重链可变结构域的C-末端结合。在实施例中，轻链可变结构域通过化学接头共价结合至重链可变结构域。如本文提供的“化学接头”是共价接头、非共价接头、肽接头(包括肽部分的接头)、可切割的肽接头、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基，或者取代或未取代的杂亚芳基或以上的任何组合。因此，如本文提供的化学接头可以包括多个化学部分，其中多个化学部分中的每个在化学上是不同的。可选地，化学接头可以是非共价接头。非共价接头的实例包括但不限于离子键、氢键、卤素键、范德瓦尔兹相互作用(例如偶极-偶极、偶极诱导的偶极、伦敦分散体)、环堆积(π效应)和疏水性相互作用。在实施例中，使用共轭化学形成化学接头，所述共轭化学包括但不限于亲核取代(例如，胺和醇与酰基卤、活性酯的反应)、亲电子取代(例如，烯胺反应)以及向碳-碳和碳-杂原子多重键的加成(例如，Michael反应、Diels-Alder加成)。在实施例中，化学接头是肽接头，其包含5-100、5-80、5-70、5-60、5-50、10-50、10-40或10-30个氨基酸长度。任何在轻链可变结构域和重链可变结构域之间提供足够灵活性的序列都被考虑用于本文提供的重组蛋白，包括其实施例。在实施例中，肽接头包括或具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列。在实施例中，肽接头具有与SEQ ID NO:24至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列。

涵盖能够锚定本文提供的蛋白质的任何跨膜结构域，包括其实施例。虽然本文考虑了任何合适的跨膜结构域，但跨膜结构域的示例性但非限制性实例包括CD28、CD8、CD4、CD3ζ或CD8α的跨膜结构域。在优选的实施例中，跨膜结构域是CD28跨膜结构域。本文提供的术语“CD28跨膜结构域”包括CD28的跨膜结构域的任何重组或天然存在形式，或其维持CD28跨膜结构域活性的变体或同源物(例如，与CD28跨膜结构域相比，在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％活性内)。在一些方面，变体或同源物与在天然存在的CD28跨膜结构域多肽的整个序列或一部分有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同的氨基酸序列。在实施例中，所述CD28跨膜结构域包括SEQ ID NO:32的氨基酸序列。在实施例中，所述CD28跨膜结构域是SEQ ID NO:32的氨基酸序列。在实施例中，本文所述的ROR1 CAR中的CD28跨膜结构域具有与SEQ ID NO:32至少80％、85％、90％或95％相同的序列。

在实施例中，所述重链可变结构域的C-末端与跨膜结构域的N-末端偶联。在实施例中，所述轻链可变结构域的C-末端与跨膜结构域的N-末端偶联。在实施例中，所述重链可变结构域或轻链可变结构域通过间隔子结构域与跨膜结构域共价结合。在实施例中，所述抗原结合区对抗原的结合亲和力在具有间隔子结构域的CAR构建体中增加。在实施例中，具有间隔子结构域的CAR的活性高于没有间隔子结构域的CAR的活性。在实施例中，所述CAR的抗原结合区的灵活性因间隔子结构域的存在而增加。

可以为抗原结合区或抗原结合结构域提供空间或灵活性，而不会对抗原结合结构域提供过度空间位阻的任何合适的化学或生物部分都被考虑在内。优选地，间隔子结构域包含长度为10-250个氨基酸、12-250个氨基酸、12-200个氨基酸、14-250个氨基酸、14-200个氨基酸、14-150个氨基酸的多肽。因此，本文的示例性间隔子结构域包括但不限于免疫球蛋白分子或其片段(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恒定重链1(CH1)结构域、恒定重链2(CH2)结构域或恒定重链3(CH3)结构域)或包括影响Fc受体结合的突变免疫球蛋白分子或其片段(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)。或者和/或另外，一些预期的间隔子结构域包括免疫球蛋白(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)铰链区的全部或部分，即落入免疫球蛋白的CH1和CH2结构域之间的序列，例如，IgG4 Fc铰链或CD8铰链。一些间隔子结构域包括免疫球蛋白CH3结构域或CH3结构域和CH2结构域两者。免疫球蛋白衍生序列可以包括一个或多个氨基酸修饰，例如，1、2、3、4或5个置换(例如，减少脱靶结合的置换)或在其N-末端或C-末端添加少于10个、少于5个、少于3个氨基酸序列。

在实施例中，间隔子结构域包括铰链结构域，以及任选地免疫球蛋白分子的CH3结构域和CH2结构域之一或其两者。因此，在实施例中，间隔子结构域具有铰链区或修饰的铰链区或由其铰链区或修饰的铰链区组成(例如，具有一个或多个氨基酸取代或添加)。在实施例中，间隔子结构域具有或由铰链区组成，该铰链区在铰链区的C-末端与hIgG4的CH3结构域偶联。在实施例中，间隔子结构域具有或由铰链区组成，该铰链区在铰链区的C-末端与hIgG4的CH2结构域偶联。或者，间隔子结构域具有或由铰链区组成，该铰链区在铰链区的C-末端与hIgG4的CH2-CH3结构域偶联。在实施例中，本文使用的铰链区包含或由SEQ ID NO:29的氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO:29至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列或由与SEQ ID NO:29至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列组成。在实施例中，间隔子结构域包括SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42的氨基酸序列或与SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列。在实施例中，所述间隔子结构域具有由SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42的氨基酸序列或由SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42的氨基酸序列组成，具有与SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列或由与SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列组成。

在实施例中，重组蛋白(例如，细胞内结构域)进一步包括一个或多个细胞内共刺激信号转导结构域。如本文提供的“细胞内共刺激信号转导结构域(intracellular co-stimulatory signaling domain)”包括能够响应抗原与本文提供的包括其实施例的抗体区域的结合而提供共刺激信号的氨基酸序列。在实施例中，共刺激信号转导结构域的信号转导导致细胞因子的产生和表达该细胞因子的T细胞的增殖。在实施例中，细胞内共刺激信号转导结构域包含一个或多个的CD28细胞内共刺激信号域、4-1BB(CD137)细胞内共刺激信号域、ICOS细胞内共刺激信号域、OX-40细胞内共刺激信号转导结构域，或其任何组合。例如，优选的细胞内共刺激信号转导结构域包含至少一部分的CD28细胞内共刺激信号转导结构域，或至少一部分的4-1BB(CD137)细胞内共刺激信号转导结构域，或由其组成。另一种优选的细胞内共刺激信号转导结构域包含与至少一部分4-1BB(CD137)细胞内共刺激信号转导结构域偶联的至少一部分CD28细胞内共刺激信号转导结构域，或由其组成。在实施例中，至少一部分的CD28细胞内结构域包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列或与SEQ ID NO:32至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列，或由其组成。在实施例中，至少一部分的CD28细胞内结构域包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列或与SEQ ID NO:32至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列，或由其组成。在实施例中，至少一部分的4-1BB细胞内共刺激信号转导结构域包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列或与SEQ ID NO:33至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列，或由其组成。在实施例中，至少一部分的4-1BB细胞内共刺激信号转导结构域包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列或与SEQ ID NO:29至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列，或由其组成。在实施例中，本文公开的嵌合抗原受体或重组蛋白包括SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33的组合(存在于SEQ ID NO:33的N'末端的SEQ ID NO:32，或存在于SEQ ID NO:32的N'末端的SEQ ID NO:33)，或与SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33的组合(存在于SEQ ID NO:33的N'末端的SEQ ID NO:32，或存在于SEQ ID NO:32的N'末端的SEQ ID NO:33)至少80％，85％，90％或95％相同的氨基酸序列。

在实施例中，所述重组蛋白进一步包括细胞内T细胞信号转导结构域。本文提供的“细胞内T细胞信号转导结构域”包括能够响应抗原与本文提供的抗体区域(包括其实施例)的结合而提供初级信号转导的氨基酸序列。在实施例中，细胞内T细胞信号转导结构域的信号转导导致表达其的T细胞的激活。在实施例中，细胞内T细胞信号转导结构域的信号转导导致表达其的T细胞的增殖(细胞分裂)。在实施例中，细胞内T细胞信号转导结构域的信号转导导致T细胞表达本领域已知的具有激活T细胞特征的蛋白质(例如，CTLA-4、PD-1、CD28、CD69)。在实施例中，细胞内T细胞信号转导结构域是CD3ζ细胞内T细胞信号转导结构域。在实施例中，CD3ζ细胞内T细胞信号转导结构域包括SEQ ID NO:34的氨基酸序列或与SEQ IDNO:34至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列，其产生与具有SEQ ID NO:34的CD3ζ细胞内T细胞信号转导结构域的至少80％、85％、90％或95％的活性的CD3ζ细胞内T细胞信号转导结构域。在实施例中，CD3ζ胞内T细胞信号转导结构域具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列或与SEQ ID NO:34至少80％、85％、90％或95％相同的序列，其产生与具有SEQ ID NO:34的CD3ζ细胞内T细胞信号转导结构域至少80％、85％、90％或95％的活性的肽。

在实施例中，本文公开的ROR-1CAR包括：i)ROR1 scFv(具有CDR L1(SEQ ID NO:43)、CDR L2(SEQ ID NO:44)和CDR L3(SEQ ID NO:45)，CDR H1(SEQ ID NO:46)、CDR H2(SEQ ID NO:47)和CDR H3(SEQ ID NO:48)，或具有SEQ ID NO:21的序列或具有与SEQ IDNO:21至少80％、85％、90％或95％相同的序列的VL结构域，或具有SEQ ID NO:27的序列或具有与SEQ ID NO:27至少80％、85％、90％或95％相同的序列的VH结构域)或可替代的ROR1scFv(CDR L1(SEQ ID NO:49)、CDR L2(SEQ ID NO:50)和CDR L3(SEQ ID NO:51)，CDR H1(SEQ ID NO:52)、CDR H2(SEQ ID NO:53)和CDR H3(SEQ ID NO:54)，或具有SEQ ID NO:19的序列或具有与SEQ ID NO:19至少80％、85％、90％或95％相同的序列的VL结构域，或具有SEQ ID NO:20的序列或具有与SEQ ID NO:20至少80％、85％、90％或95％相同的序列的VH结构域)，ii)具有铰链和CH2和CH3结构域的间隔子，iii)CD28跨膜结构域，iv)4-1BB(CD137)共刺激结构域，以及v)CD3Z T细胞激活结构域。

或者，在实施例中，本文公开的ROR1 CAR包括：i)ROR1 scFv(具有CDR L1(SEQ IDNO:43)、CDR L2(SEQ ID NO:44)和CDR L3(SEQ ID NO:45)，CDR H1(SEQ ID NO:46)、CDR H2(SEQ ID NO:47)和CDR H3(SEQ ID NO:48)，或具有SEQ ID NO:21的序列或具有与SEQ IDNO:21至少80％、85％、90％或95％相同的序列的VL结构域，或具有SEQ ID NO:27的序列或具有与SEQ ID NO:27至少80％、85％、90％或95％相同的序列的VH结构域)或可替代的ROR1scFv(CDR L1(SEQ ID NO:49)、CDR L2(SEQ ID NO:50)和CDR L3(SEQ ID NO:51)，CDR H1(SEQ ID NO:52)、CDR H2(SEQ ID NO:53)和CDR H3(SEQ ID NO:54)，或具有SEQ ID NO:19的序列或具有与SEQ ID NO:19至少80％、85％、90％或95％相同的序列的VL结构域，或具有SEQ ID NO:20的序列或具有与SEQ ID NO:20至少80％、85％、90％或95％相同的序列的VH结构域)，ii)具有铰链和CH2结构域的间隔子，iii)CD28跨膜结构域，iv)4-1BB(CD137)共刺激结构域，以及v)CD3Z T细胞激活结构域。

或者，在实施例中，本文公开的ROR1 CAR包括：i)ROR1 scFv(具有CDR L1(SEQ IDNO:43)、CDR L2(SEQ ID NO:44)和CDR L3(SEQ ID NO:45)，CDR H1(SEQ ID NO:46)、CDR H2(SEQ ID NO:47)和CDR H3(SEQ ID NO:48)，或具有SEQ ID NO:21的序列或具有与SEQ IDNO:21至少80％、85％、90％或95％相同的序列的VL结构域，或具有SEQ ID NO:27的序列或具有与SEQ ID NO:27至少80％、85％、90％或95％相同的序列的VH结构域)或可替代的ROR1scFv(CDR L1(SEQ ID NO:49)、CDR L2(SEQ ID NO:50)和CDR L3(SEQ ID NO:51)，CDR H1(SEQ ID NO:52)、CDR H2(SEQ ID NO:53)和CDR H3(SEQ ID NO:54)，或具有SEQ ID NO:19的序列或具有与SEQ ID NO:19至少80％、85％、90％或95％相同的序列的VL结构域，或具有SEQ ID NO:20的序列或具有与SEQ ID NO:20至少80％、85％、90％或95％相同的序列的VH结构域)，ii)具有铰链和CH3结构域的间隔子，iii)CD28跨膜结构域，iv)4-1BB(CD137)共刺激结构域，以及v)CD3Z T细胞激活结构域。

或者，在实施例中，本文公开的ROR1 CAR包括：i)ROR1 scFv(具有CDR L1(SEQ IDNO:43)、CDR L2(SEQ ID NO:44)和CDR L3(SEQ ID NO:45)，CDR H1(SEQ ID NO:46)、CDR H2(SEQ ID NO:47)和CDR H3(SEQ ID NO:48)，或具有SEQ ID NO:21的序列或具有与SEQ IDNO:21至少80％、85％、90％或95％相同的序列的VL结构域，或具有SEQ ID NO:27的序列或具有与SEQ ID NO:27至少80％、85％、90％或95％相同的序列的VH结构域)或可替代的ROR1scFv(CDR L1(SEQ ID NO:49)、CDR L2(SEQ ID NO:50)和CDR L3(SEQ ID NO:51)，CDR H1(SEQ ID NO:52)、CDR H2(SEQ ID NO:53)和CDR H3(SEQ ID NO:54)，或具有SEQ ID NO:19的序列或具有与SEQ ID NO:19至少80％、85％、90％或95％相同的序列的VL结构域，或具有SEQ ID NO:20的序列或具有与SEQ ID NO:20至少80％、85％、90％或95％相同的序列的VH结构域)，ii)具有铰链和一部分CH3结构域(例如，CH3结构域的一半，CH3结构域的N-末端43个氨基酸等)的间隔子，iii)CD28跨膜结构域，iv)4-1BB(CD137)共刺激结构域，以及v)CD3ZT细胞激活结构域。

或者，在实施例中，本文公开的ROR1 CAR包括：i)ROR1 scFv(具有CDR L1(SEQ IDNO:43)、CDR L2(SEQ ID NO:44)和CDR L3(SEQ ID NO:45)，CDR H1(SEQ ID NO:46)、CDR H2(SEQ ID NO:47)和CDR H3(SEQ ID NO:48)，或具有SEQ ID NO:21的序列或具有与SEQ IDNO:21至少80％、85％、90％或95％相同的序列的VL结构域，或具有SEQ ID NO:27的序列或具有与SEQ ID NO:27至少80％、85％、90％或95％相同的序列的VH结构域)或可替代的ROR1scFv(CDR L1(SEQ ID NO:49)、CDR L2(SEQ ID NO:50)和CDR L3(SEQ ID NO:51)，CDR H1(SEQ ID NO:52)、CDR H2(SEQ ID NO:53)和CDR H3(SEQ ID NO:54)，或具有SEQ ID NO:19的序列或具有与SEQ ID NO:19至少80％、85％、90％或95％相同的序列的VL结构域，或具有SEQ ID NO:20的序列或具有与SEQ ID NO:20至少80％、85％、90％或95％相同的序列的VH结构域)，ii)具有铰链结构域的间隔子，iii)CD28跨膜结构域，iv)4-1BB(CD137)共刺激结构域，以及v)CD3Z T细胞激活结构域。

因此，在实施例中，本文公开的ROR1 CAR包括：i)ROR1 scFv(具有CDR L1(SEQ IDNO:43)、CDR L2(SEQ ID NO:44)和CDR L3(SEQ ID NO:45)，CDR H1(SEQ ID NO:46)、CDR H2(SEQ ID NO:47)和CDR H3(SEQ ID NO:48)，或具有SEQ ID NO:21的序列或具有与SEQ IDNO:21至少80％、85％、90％或95％相同的序列的VL结构域，或具有SEQ ID NO:27的序列或具有与SEQ ID NO:27至少80％、85％、90％或95％相同的序列的VH结构域)或可替代的ROR1scFv(CDR L1(SEQ ID NO:49)、CDR L2(SEQ ID NO:50)和CDR L3(SEQ ID NO:51)，CDR H1(SEQ ID NO:52)、CDR H2(SEQ ID NO:53)和CDR H3(SEQ ID NO:54)，或具有SEQ ID NO:19的序列或具有与SEQ ID NO:19至少80％、85％、90％或95％相同的序列的VL结构域，或具有SEQ ID NO:20的序列或具有与SEQ ID NO:20至少80％、85％、90％或95％相同的序列的VH结构域)，ii)具有铰链和CH2和CH3结构域的间隔子，iii)CD28跨膜结构域，iv)与4-1BB(CD137)共刺激结构域偶联的CD28共刺激结构域，以及v)CD3Z T细胞激活结构域。

或者，在实施例中，本文公开的ROR-1CAR包括：i)ROR1 scFv(具有CDR L1(SEQ IDNO:43)、CDR L2(SEQ ID NO:44)和CDR L3(SEQ ID NO:45)，CDR H1(SEQ ID NO:46)、CDR H2(SEQ ID NO:47)和CDR H3(SEQ ID NO:48)，或具有SEQ ID NO:21的序列或具有与SEQ IDNO:21至少80％、85％、90％或95％相同的序列的VL结构域，或具有SEQ ID NO:27的序列或具有与SEQ ID NO:27至少80％、85％、90％或95％相同的序列的VH结构域)或可替代的ROR1scFv(CDR L1(SEQ ID NO:49)、CDR L2(SEQ ID NO:50)和CDR L3(SEQ ID NO:51)，CDR H1(SEQ ID NO:52)、CDR H2(SEQ ID NO:53)和CDR H3(SEQ ID NO:54)，或具有SEQ ID NO:19的序列或具有与SEQ ID NO:19至少80％、85％、90％或95％相同的序列的VL结构域，或具有SEQ ID NO:20的序列或具有与SEQ ID NO:20至少80％、85％、90％或95％相同的序列的VH结构域)，ii)具有铰链和CH2结构域的间隔子，iii)CD28跨膜结构域，iv)与4-1BB(CD137)共刺激结构域偶联的CD28共刺激结构域，以及v)CD3Z T细胞激活结构域。

或者，在实施例中，本文公开的ROR-1CAR包括：i)ROR1 scFv(具有CDR L1(SEQ IDNO:43)、CDR L2(SEQ ID NO:44)和CDR L3(SEQ ID NO:45)，CDR H1(SEQ ID NO:46)、CDR H2(SEQ ID NO:47)和CDR H3(SEQ ID NO:48)，或具有SEQ ID NO:21的序列或具有与SEQ IDNO:21至少80％、85％、90％或95％相同的序列的VL结构域，或具有SEQ ID NO:27的序列或具有与SEQ ID NO:27至少80％、85％、90％或95％相同的序列的VH结构域)或可替代的ROR1scFv(CDR L1(SEQ ID NO:49)、CDR L2(SEQ ID NO:50)和CDR L3(SEQ ID NO:51)，CDR H1(SEQ ID NO:52)、CDR H2(SEQ ID NO:53)和CDR H3(SEQ ID NO:54)，或具有SEQ ID NO:19的序列或具有与SEQ ID NO:19至少80％、85％、90％或95％相同的序列的VL结构域，或具有SEQ ID NO:20的序列或具有与SEQ ID NO:20至少80％、85％、90％或95％相同的序列的VH结构域)，ii)具有铰链和CH3结构域的间隔子，iii)CD28跨膜结构域，iv)与4-1BB(CD137)共刺激结构域偶联的CD28共刺激结构域，以及v)CD3Z T细胞激活结构域。

或者，在实施例中，本文公开的ROR-1CAR包括：i)ROR1 scFv(具有CDR L1(SEQ IDNO:43)、CDR L2(SEQ ID NO:44)和CDR L3(SEQ ID NO:45)，CDR H1(SEQ ID NO:46)、CDR H2(SEQ ID NO:47)和CDR H3(SEQ ID NO:48)，或具有SEQ ID NO:21的序列或具有与SEQ IDNO:21至少80％、85％、90％或95％相同的序列的VL结构域，或具有SEQ ID NO:27的序列或具有与SEQ ID NO:27至少80％、85％、90％或95％相同的序列的VH结构域)或可替代的ROR1scFv(CDR L1(SEQ ID NO:49)、CDR L2(SEQ ID NO:50)和CDR L3(SEQ ID NO:51)，CDR H1(SEQ ID NO:52)、CDR H2(SEQ ID NO:53)和CDR H3(SEQ ID NO:54)，或具有SEQ ID NO:19的序列或具有与SEQ ID NO:19至少80％、85％、90％或95％相同的序列的VL结构域，或具有SEQ ID NO:20的序列或具有与SEQ ID NO:20至少80％、85％、90％或95％相同的序列的VH结构域)，ii)具有铰链和一部分CH3结构域(例如，CH3结构域的一半，CH3结构域的N-末端43个氨基酸等)的间隔子，iii)CD28跨膜结构域，iv)与4-1BB(CD137)共刺激结构域偶联的CD28共刺激结构域，以及v)CD3Z T细胞激活结构域。

或者，在实施例中，本文公开的ROR-1CAR包括：i)ROR1 scFv(具有CDR L1(SEQ IDNO:43)、CDR L2(SEQ ID NO:44)和CDR L3(SEQ ID NO:45)，CDR H1(SEQ ID NO:46)、CDR H2(SEQ ID NO:47)和CDR H3(SEQ ID NO:48)，或具有SEQ ID NO:21的序列或具有与SEQ IDNO:21至少80％、85％、90％或95％相同的序列的VL结构域，或具有SEQ ID NO:27的序列或具有与SEQ ID NO:27至少80％、85％、90％或95％相同的序列的VH结构域)或可替代的ROR1scFv(CDR L1(SEQ ID NO:49)、CDR L2(SEQ ID NO:50)和CDR L3(SEQ ID NO:51)，CDR H1(SEQ ID NO:52)、CDR H2(SEQ ID NO:53)和CDR H3(SEQ ID NO:54)，或具有SEQ ID NO:19的序列或具有与SEQ ID NO:19至少80％、85％、90％或95％相同的序列的VL结构域，或具有SEQ ID NO:20的序列或具有与SEQ ID NO:20至少80％、85％、90％或95％相同的序列的VH结构域)，ii)具有铰链结构域的间隔子，iii)CD28跨膜结构域，iv)与4-1BB(CD137)共刺激结构域偶联的CD28共刺激结构域，以及v)CD3Z T细胞激活结构域。

预期本文所述的嵌合抗原受体与ROR-1的氨基酸130-160位或其片段结合，优选与在对应于ROR-1多肽的138位处的位置的肽(包括谷氨酸)结合。或者和/或另外，本文所述的嵌合抗原受体特异性结合ROR-1蛋白胞外结构域的3'端或中间Ig样区，优选结合ROR-1蛋白的位置1-147的胞外结构域Ig样区的的3'端。

因此，本文公开的ROR-1CAR与表达ROR-1的细胞结合并且可以启动或诱导针对表达ROR-1的细胞的免疫应答，包括癌细胞，例如白血病细胞、淋巴瘤细胞、慢性淋巴细胞白血病(CLL)细胞、成人急性髓性白血病(AML)细胞、急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞、套细胞淋巴瘤细胞、卵巢癌细胞、结肠癌细胞、肺癌细胞、皮肤癌细胞，胰腺癌细胞、睾丸癌细胞、膀胱癌细胞、子宫癌细胞、前列腺癌细胞或肾上腺癌细胞。其中重组蛋白形成细胞的一部分。

在实施例中，本文提供的重组蛋白，包括其实施例，还包括可检测结构域。本文提供的“可检测结构域”是可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其他物理方法检测的肽部分。例如，本文提供的可检测结构域可以是蛋白质或其他实体，其可以例如通过掺入放射性标记或与抗体特异性反应而变得可检测。可以使用本领域已知的用于使抗体与标记结合的任何适当方法，例如使用Hermanson,Bioconjugate Techniques 1996,AcademicPress,Inc.,San Diego.中描述的方法。在本发明中，可检测结构域用于确认T细胞的转染。

在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体具有约500pM至约6nM的结合亲和力。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体具有约550pM至约6nM的结合亲和力。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体具有约600pM至约6nM的结合亲和力。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体具有约650pM至约6nM的结合亲和力。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体具有约700pM至约6nM的结合亲和力。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体具有约750pM至约6nM的结合亲和力。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体具有约800pM至约6nM的结合亲和力。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体具有约850pM至约6nM的结合亲和力。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体具有约900pM至约6nM的结合亲和力。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体具有约950pM至约6nM的结合亲和力。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体具有约1nM至约6nM的结合亲和力。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体具有约1nM至约6nM的结合亲和力。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体具有约1.5nM至约6nM的结合亲和力。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体具有约2nM至约6nM的结合亲和力。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体具有约2.5nM至约6nM的结合亲和力。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体具有约3nM至约6nM的结合亲和力。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体具有约3.5nM至约6nM的结合亲和力。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体具有约4nM至约6nM的结合亲和力。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体具有约4.5nM至约6nM的结合亲和力。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体具有约5nM至约6nM的结合亲和力。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体具有约5.5nM至约6nM的结合亲和力。

在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体具有约500pM的结合亲和力。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体具有500pM的结合亲和力。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体具有约550pM的结合亲和力。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体具有550pM的结合亲和力。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体具有约600pM的结合亲和力。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体具有600pM的结合亲和力。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体具有约650pM的结合亲和力。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体具有650pM的结合亲和力。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体具有约700pM的结合亲和力。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体具有700pM的结合亲和力。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体具有约750pM的结合亲和力。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体具有750pM的结合亲和力。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体具有约800pM的结合亲和力。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体具有800pM的结合亲和力。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体具有约850pM的结合亲和力。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体具有850pM的结合亲和力。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体具有约900pM的结合亲和力。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体具有900pM的结合亲和力。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体具有约950pM的结合亲和力。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体具有950pM的结合亲和力。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体具有约1nM的结合亲和力。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体具有约1nM的结合亲和力。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体具有1nM的结合亲和力。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体具有约1.5nM的结合亲和力。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体具有1.5nM的结合亲和力。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体具有约2nM的结合亲和力。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体具有2nM的结合亲和力。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体具有约2.5nM的结合亲和力。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体具有2.5nM的结合亲和力。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体具有约3nM的结合亲和力。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体具有3nM的结合亲和力。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体具有约3.5nM的结合亲和力。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体具有3.5nM的结合亲和力。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体具有约4nM的结合亲和力。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体具有4nM的结合亲和力。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体具有约4.5nM的结合亲和力。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体具有4.5nM的结合亲和力。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体具有约5nM的结合亲和力。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体具有5nM的结合亲和力。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体具有约5.5nM的结合亲和力。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体具有5.5nM的结合亲和力。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体具有约6nM的结合亲和力。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体具有6nM的结合亲和力。

在实施例中，所述重组蛋白或嵌合抗原受体以约小于40nM的K_D(例如，35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5、0.25、0.1nM)结合ROR-1蛋白。。在实施例中，所述重组蛋白或嵌合抗原受体以小于40nM的K_D(例如，35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5、0.25、0.1nM)结合ROR-1蛋白。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体以约小于35nM的K_D结合ROR-1蛋白。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体以小于35nM的K_D结合ROR-1蛋白。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体以约小于30nM的K_D结合ROR-1蛋白。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体以小于30nM的K_D结合ROR-1蛋白。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体以约小于25nM的K_D结合ROR-1蛋白。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体以小于25nM的K_D结合ROR-1蛋白。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体以约小于20nM的K_D结合ROR-1蛋白。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体以小于20nM的K_D结合ROR-1蛋白。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体以约小于15nM的K_D结合ROR-1蛋白。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体以小于15nM的K_D结合ROR-1蛋白。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体以约小于10nM的K_D结合ROR-1蛋白。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体以小于10nM的K_D结合ROR-1蛋白。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体以约小于9nM的K_D结合ROR-1蛋白。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体以小于9nM的K_D结合ROR-1蛋白。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体以约小于8nM的K_D结合ROR-1蛋白。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体以小于8nM的K_D结合ROR-1蛋白。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体以约小于7nM的K_D结合ROR-1蛋白。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体以小于7nM的K_D结合ROR-1蛋白。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体以约小于6nM的K_D结合ROR-1蛋白。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体以小于6nM的K_D结合ROR-1蛋白。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体以约小于5nM的K_D结合ROR-1蛋白。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体以小于5nM的K_D结合ROR-1蛋白。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体以约小于4nM的K_D结合ROR-1蛋白。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体以小于4nM的K_D结合ROR-1蛋白。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体以约小于3nM的K_D结合ROR-1蛋白。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体以小于3nM的K_D结合ROR-1蛋白。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体以约小于2nM的K_D结合ROR-1蛋白。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体以小于2nM的K_D结合ROR-1蛋白。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体以约小于1nM的K_D结合ROR-1蛋白。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体以小于1nM的K_D结合ROR-1蛋白。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体以约小于0.5nM的K_D结合ROR-1蛋白。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体以小于0.5nM的K_D结合ROR-1蛋白。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体以约小于0.25nM的K_D结合ROR-1蛋白。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体以小于0.25nM的K_D结合ROR-1蛋白。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体以约小于0.1nM的K_D结合ROR-1蛋白。在实施例中，重组蛋白或嵌合抗原受体以小于0.1nM的K_D结合ROR-1蛋白。

预期通过对T细胞进行基因工程以表达编码嵌合核酸受体的异源核酸序列，在T淋巴细胞或T细胞(例如，CD8+T细胞、CD4+T细胞)的表面上表达本文所述的嵌合抗原受体。此类产生的CAR-T细胞特异性结合表达ROR-1的细胞，优选为表达ROR1的癌细胞，以引起针对表达ROR-1的癌细胞的免疫应答。在一些实施例中，本文所述的嵌合抗原受体在自然杀伤细胞(NK细胞或遗传修饰或工程改造的NK细胞)的表面上表达。在某些实施例中，NK细胞是CD56阳性细胞。CD56阳性可以通过例如细胞群的流式细胞术分析来确定，并且被定义为，与用同种型对照抗体染色的细胞相比，至少10x、100x或1000x的细胞。在某些实施例中，NK细胞是原代NK细胞。在某些实施例中，NK细胞包括NK细胞系。在某些实施例中，NK细胞对于用本公开的表达CAR的NK细胞治疗的个体是自体的。在某些实施例中，NK细胞对于用本公开的表达CAR的NK细胞治疗的个体是异源的。在某些实施例中，NK细胞对于用本公开的表达CAR的NK细胞治疗的个体是同种异体的。NK细胞可以衍生自任何合适来源，骨髓、诱导多能干细胞、外周血单核细胞、胎儿或胎盘细胞。

本文进一步提供了编码本文提供的重组蛋白或嵌合抗原受体的重组核酸，包括其实施例。在一些实施例中，嵌合抗原受体由形成表达载体的一部分的单个重组核酸编码。考虑了能够转染到免疫细胞(例如，CD8+T细胞、CD4+T细胞、CD56+免疫细胞、NK细胞或基因修饰或工程改造的NK细胞)中并在其中表达的任何合适的表达载体。示例性和/或优选的表达载体可以包括病毒表达载体(例如，腺病毒、腺相关病毒、甲病毒、疱疹病毒、慢病毒等的表达载体)。在一些实施例中，腺病毒是复制缺陷型和非免疫原性病毒，其通常通过靶向删除选定的病毒蛋白(例如，E1、E2b、E3蛋白)来实现。例如，可以将重组核酸置于非病毒载体(例如哺乳动物表达载体)中并使用任何常用的转染方法将其转染至T细胞。例如，病毒载体中的重组核酸使得包括重组核酸的病毒颗粒感染T细胞以将重组核酸递送到T细胞中。再例如，当重组核酸是基于自我复制的RNA的载体时，基于自我复制的RNA的载体可以与药学上可接受的载体(例如，在缓冲液或细胞培养基中，优选与RNA酶抑制剂一起配制))使得基于自我复制的RNA的载体可以通过直接接触细胞膜以裸露的形式递送到细胞中。在一些实施例中，基于自我复制的RNA的载体可以与载体分子偶联。示例性的载体分子包括蛋白A、蛋白G、蛋白Z、白蛋白、重折叠白蛋白(refolded albumin)、纳米颗粒(例如，量子点、金纳米颗粒、磁性纳米颗粒、纳米管、聚合物纳米颗粒、树枝状聚合物等)或珠子(例如，聚苯乙烯珠、乳胶珠、dynabead等)。优选地，纳米颗粒和/或珠有一个尺寸小于1μm，优选小于100nm的直径。在其他实施例中，基于自我复制的RNA载体可以与微粒(例如，PLG RG503(50:50丙交酯/乙交酯摩尔比)偶联，其中基于自我复制的RNA的载体可以被吸收到微粒上来进一步输送到细胞。在其他实施例中，可将基于自我复制的RNA的载体封装在脂质体(例如基于PEG的脂质体等)中以保护基于自我复制的RNA的载体免于被RNA酶消化并通过将脂质体融合到靶细胞膜递送基于RNA的载体。

在实施例中，可将编码本文提供的重组蛋白或嵌合抗原受体的重组核酸插入具有用于基因编辑的盒的载体(例如，CRISPR-CAS表达载体)。另一种示例性表达载体可以包括基于转座子的表达系统(例如，睡美人系统(Sleeping Beauty system)，如Deninger etal.,PLOS ONE,June 1,2015所公开的)。

药物组合物

表达嵌合抗原受体的免疫细胞和/或编码嵌合抗原受体的重组核酸可以进一步配制成药物组合物，任选地与任何药学上可接受的载体(例如，作为用于表达嵌合抗原受体的免疫细胞的无菌可注射组合物，用于编码嵌合抗原受体的重组核酸的药学上可接受的盐等)来配制。虽然药物组合物的剂量或细胞滴度可根据治疗程序、治疗方案、治疗条件等而变化，但药物组合物的剂量或细胞滴度的一个实例可包括至少1×10³细胞/毫升，优选至少1×10⁵细胞/毫升，更优选至少1×10⁶细胞/毫升，和至少1ml，优选至少5ml，更优选每剂量单位至少20毫升。

在一些实施例中，药物组合物可包括同质细胞或其多个(例如，表达嵌合抗原受体的CD8+T细胞、表达嵌合抗原受体的CD4+T细胞、表达嵌合抗原受体的NK细胞等)。在其他实施例中，组合物可以包含异质细胞的混合物(例如，表达嵌合抗原受体的CD8+T细胞和表达嵌合抗原受体的NK细胞的混合物等，比例为1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、4∶1、3∶1、2∶1等)。在该药物组合物中，不同类型细胞的比例可以根据癌症的类型、年龄、性别或患者的健康状况、肿瘤的大小和患者的细胞计数而变化。针对特定应用有效的实际量尤其取决于所治疗的病症。当在治疗疾病的方法中施用时，本文所述的重组蛋白将包含一定量的活性成分，其可有效实现所需结果，例如，调节靶分子的活性，和/或降低、消除或减慢疾病症状的进展。确定本发明的化合物的治疗有效量完全处于本领域的技术人员的能力内，尤其是根据本文的详细公开。

给予哺乳动物的剂量和频率(单次或多次剂量)可根据多种因素而变化，例如，哺乳动物是否患有另一种疾病及其施用途径；接受者的大小、年龄、性别、健康状况、体重、体重指数和饮食；所治疗疾病症状的性质和程度(例如癌症症状和此类症状的严重程度)、同时治疗的种类、所治疗疾病引起的并发症或其他与健康相关的问题。其它治疗方案或药剂可以与本发明的方法和化合物结合使用。对建立的剂量(例如，频率和持续时间)的调整和操纵完全处于本领域技术人员的能力范围内。

对于本文提供的任何组合物(例如重组蛋白、核酸)，可以从细胞培养测定中初步确定治疗有效量。目标浓度将是能够实现本文所描述的方法的，如使用本文所描述或本领域已知的方法测量的一种或多种活性化合物的浓度。如本领域众所周知的，用于人类的有效量也可以从动物模型中确定。例如，可以调配针对人的剂量以实现已发现对动物有效的浓度。如上所述，可以通过监测效果并向上或向下调节剂量来调节人的剂量。基于以上所描述的方法和其它方法调整剂量以实现在人中的最大功效完全处于普通技术人员的能力内。

剂量可以根据患者的需要和所采用的化合物而变化。在本发明的上下文中，给予患者的剂量应足以随着时间的推移在患者中产生有益治疗反应。剂量的大小也将通过任何不良副作用的存在、性质和程度确定。针对具体情况来确定适当的剂量是在执业者的技能之内的。通常，治疗开始于比化合物的最优剂量小的较小剂量。此后，以小的增量来增加剂量，直到在多个情况下达到最佳效果。

剂量和间隔可以单独调整以提供所施用化合物的对所治疗的特定临床适应症有效的水平。这将提供与个体疾病状态的严重程度相称的治疗方案。

利用本文提供的教导，可以计划有效的预防性或治疗性治疗方案，该方案不会引起实质性毒性，而是可以有效地治疗特定患者显示出的临床症状。该计划应涉及通过考虑诸如化合物效价、相对生物利用度、患者体重、不良副作用的存在和严重性等因素来谨慎选择活性化合物，优选的

“药学上可接受的赋形剂”和“药学上可接受的载体”是指有助于向对象给予活性剂并被其吸收的物质，并且可以包括在本发明的组合物中而不会引起对患者的明显不良毒理作用。药学上可接受的赋形剂的非限制性实例包含水、NaCl、生理盐水溶液、乳酸化林格氏(Ringer’s)液、普通蔗糖、普通葡萄糖、粘合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、包衣、甜味剂、调味剂、盐溶液(如林格氏溶液)、醇、油、明胶、碳水化合物(如乳糖、直链淀粉或淀粉)、脂肪酸酯、羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮和颜料等。这类制剂可以进行灭菌，且必要时，与不与本发明化合物有害地反应的助剂混合，所述助剂如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲液、着色物质和/或芳香物质等。本领域技术人员将认识到其他药物赋形剂可用于本发明。

术语“药学上可接受的盐”是指来源于本领域众所周知的各种有机和无机抗衡离子的盐，并且包括(仅通过实例的方式)钠、钾、钙、镁、铵、四烷基铵等；并且当分子包含碱性官能团时，有机或无机酸的盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、马来酸盐、草酸盐等。

术语“制剂”旨在包括具有包封材料作为载体的活性化合物的制剂，该包封物质提供胶囊，其中具有或不具有其他载体的活性成分被因此与其缔合的载体包围。类似地，包含了扁囊剂和锭剂。片剂、粉剂、胶囊、丸剂、扁囊剂以及锭剂可以用作适用于口服施用的固体剂型。

药物制剂任选地为单位剂型。以这种形式，将制剂细分为包含适当量的活性成分的单位剂量。单位剂型可以是包装制剂，所述包装件含有离散量的制剂，比如，小瓶或安瓿中的包装片剂、胶囊和粉末。同样，单位剂型本身可以是胶囊剂、片剂、扁囊剂或锭剂，或者其可以是包装形式的适当数量的任何这些剂型。单位剂型可以是冷冻分散剂。

治疗方法

本文所述的CAR-T细胞组合物可用于治疗个体的癌症或肿瘤。因此，本文描述了一种在有需要的受试者中治疗癌症的方法。该方法包括向受试者施用本文提供的治疗有效量的CAR-T细胞，包括其实施例，从而治疗受试者的癌症或肿瘤。CAR T细胞组合物通常与一种或多种药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂一起施用。

在某些实施例中，本文公开了用于治疗癌症或肿瘤的抗ROR-1CAR T细胞和抗ROR-1CAR-T细胞组合物。治疗是指寻求改善或缓解所治疗病症的方法。对于癌症，治疗包括但不限于肿瘤体积的减少、肿瘤体积生长的减缓、无进展生存时间或总体预期寿命的增加。在某些实施例中，治疗将实现所正在治疗的癌症的缓解。在某些实施例中，治疗包括作为预防或维持剂量的用途，旨在防止先前治疗的癌症或肿瘤的复发或进展。本领域技术人员应当理解，并非所有个体都会对所施用的治疗产生同等反应或完全的反应，然而这些个体被认为是接受治疗的。

在某些实施例中，使用本文所述的抗ROR-1CAR-T细胞治疗的癌症或肿瘤是实体癌或肿瘤。在某些实施例中，癌症或肿瘤是血癌或肿瘤。在某些实施例中，血癌是白血病或淋巴瘤。在某些实施例中，白血病或淋巴瘤包括B细胞白血病、淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴细胞性急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、T细胞淋巴细胞急性淋巴细胞白血病T-ALL及其组合。在某些实施例中，实体癌/肿瘤包括卵巢癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、皮肤癌、胰腺癌、睾丸癌、膀胱癌、子宫癌、前列腺癌、肾上腺癌及其组合。在某些实施例中，癌症是复发的或对至少一种其它治疗是难以治愈的。

在某些实施例中，抗ROR-1CAR T细胞和抗ROR-1CAR-T细胞组合物可以通过任何适合的含细胞药物组合物的给药途径施用于有需要的受试者，例如，皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内、肿瘤内或脑内等。在某些实施例中，抗体为静脉内给药。在某些实施例中，抗体为皮下给药。在某些实施例中，抗体为肿瘤内给药。

抗-ROR-1CAR-T细胞和抗-ROR-1CAR-T细胞组合物可以根据合适的剂量方案来施用。在某些实施例中，施用CAR T细胞一次，随后的剂量取决于临床标准。如果个体没有反应或仅部分反应，则所述患者可以第二次、第三次或第四次施用抗ROR-1CAR-T细胞组合物，直到观察到所需的临床反应。一剂CAR-T细胞通常包含至少1x10⁶个细胞，但不超过5x10⁸个细胞。可以基于用CAR构建体转导的个体活PBMC的总量施用细胞。在某些实施例中，单一剂量包含100万个转导的PBMC至1亿个转导的PBMC。在某些实施例中，单个剂量包括100万个转导的PBMC至200万个转导的PBMC、100万个转导的PBMC至300万个转导的PBMC、100万个转导的PBMC至400万个转导的PBMC、100万个转导的PBMC至500万个转导的PBMC、100万个转导的PBMC至600万个转导的PBMC、100万个转导的PBMC至700万个转导的PBMC、100万个转导的PBMC至800万个转导的PBMC、100万个转导的PBMC至900万个转导的PBMC、100万个转导的PBMC至1000万个转导的PBMC、100万个转导的PBMC至5000万个转导的PBMC、100万个转导的PBMC至1亿转导的PBMC、200万个PBMC转导至300万个转导的PBMC、200万个转导的PBMC至400万个转导的PBMC、200万个转导的PBMC至500万个转导的PBMC、200万个转导的PBMC至600万个转导的PBMC、200万个转导的PBMC至700万个转导的PBMC、200万个转导的PBMC至800万个转导的PBMC、200万个转导的PBMC至900万个转导的PBMC、200万个转导的PBMC至1000万个转导的PBMC、200万个转导的PBMC至5000万个转导的PBMC、200万个转导的PBMC至1亿转导的PBMC、300万个转导的PBMC至400万个转导的PBMC、300万个转导的PBMC至500万个转导的PBMC、300万个转导的PBMC至600万个转导的PBMC、300万个转导的PBMC至700万个转导的PBMC、300万个转导的PBMC至800万个转导的PBMC、300万个转导的PBMC至900万个转导的PBMC、300万个转导PBMCs至1000万个转导PBMCs、300万个转导PBMCs至5000万个转导PBMCs、300万个转导PBMCs至1亿转导PBMCs、400万个转导的PBMC至500万个转导的PBMC、400万个转导的PBMC至600万个转导的PBMC、400万个转导的PBMC至700万个转导的PBMC、400万个转导的PBMC至800万个转导的PBMC、400万个转导的PBMC至900万个转导的PBMC、400万个转导的PBMC至1000万个转导的PBMC、400万个转导的PBMC至5000万个转导的PBMC、400万个转导的PBMC至1亿个转导的PBMC、500万个转导的PBMC至600万个转导的PBMC、500万个转导的PBMC至700万个转导的PBMC、500万个转导的PBMC至800万个转导的PBMC、500万个转导的PBMC至900万个转导的PBMC、500万个转导的PBMC至1000万个转导的PBMC、500万个转导的PBMC至5000万个转导的PBMC、500万个转导的PBMCs至1亿个转导的PBMCs、600万个转导的PBMC至700万个转导的PBMC、600万个转导的PBMC至800万个转导的PBMC、600万个转导的PBMC至900万个转导的PBMC、600万个转导的PBMC至1000万个转导的PBMC、600万个转导的PBMC至5000万个转导的PBMC、600万个转导的PBMCs至1亿个转导的PBMCs、700万个转导的PBMC至800万个转导的PBMC、700万个转导的PBMC至900万个转导的PBMC、700万个转导的PBMC至1000万个转导的PBMC、700万个转导的PBMC至5000万个转导的PBMC、700万个转导的PBMC至1亿转导的PBMC、800万个转导的PBMC至900万个转导的PBMC、800万个转导的PBMC至1000万个转导的PBMC、800万个转导的PBMC至5000万个转导的PBMC、800万个转导的PBMC至1亿转导的PBMC、900万个转导的PBMC至1000万个转导的PBMC、900万个转导的PBMC至5000万个转导的PBMC、900万个转导的PBMC至1亿个转导的PBMC、1000万个转导的PBMC至5000万个转导的PBMC、1000万个转导的PBMC至1亿个转导的PBMC、或5000万个转导的PBMC至1亿个转导的PBMC。在某些实施例中，单一剂量包含100万个转导的PBMC、200万个转导的PBMC、300万个转导的PBMC、400万个转导的PBMC、500万个转导的PBMC、600万个转导的PBMC、700万个转导的PBMC、800万个转导的PBMC、900万个转导的PBMC、1000万个转导的PBMC、5000万个转导的PBMC或1亿个转导的PBMC。在某些实施例中，单一剂量包含至少100万个转导的PBMC、200万个转导的PBMC、300万个转导的PBMC、400万个转导的PBMC、500万个转导的PBMC、600万个转导的PBMC、700万个转导的PBMC、800万个转导的PBMC、900万个转导的PBMC、1000万个转导的PBMC或5000万个转导的PBMC。在某些实施例中，单一剂量包含至多200万个转导的PBMC、300万个转导的PBMC、400万个转导的PBMC、500万个转导的PBMC、600万个转导的PBMC、700万个转导的PBMC、800万个转导的PBMC、900万个转导的PBMC、1000万个转导的PBMC、5000万个转导的PBMC或1亿个转导的PBMC。

可以使用更多或更少的细胞，取决于个体T细胞的转导效率，其具体情况要具体分析。在某些实施例中，单剂量包含100万个CAR-T细胞至1亿个CAR-T细胞。在某些实施例中，单次剂量包括100万个CAR-T细胞至200万个CAR-T细胞、100万个CAR-T细胞至300万个CAR-T细胞、100万个CAR-T细胞至400万个CAR-T细胞、100万个CAR-T细胞至500万个CAR-T细胞、100万个CAR-T细胞至600万个CAR-T细胞、100万个CAR-T细胞至700万个CAR-T细胞、100万个CAR-T细胞至800万个CAR-T细胞、100万个CAR-T细胞至900万个CAR-T细胞、100万个CAR-T细胞至1000万个CAR-T细胞、100万个CAR-T细胞至5000万个CAR-T细胞、100万个CAR-T细胞至1亿个CAR-T细胞、200万个CAR-T细胞至300万个CAR-T细胞、200万个CAR-T细胞至400万个CAR-T细胞、200万个CAR-T细胞至500万个CAR-T细胞、200万个CAR-T细胞至600万个CAR-T细胞、200万个CAR-T细胞至700万个CAR-T细胞、200万个CAR-T细胞至800万个CAR-T细胞、200万个CAR-T细胞至900万个CAR-T细胞、200万个CAR-T细胞至1000万个CAR-T细胞、200万个CAR-T细胞至5000万个CAR-T细胞、200万个CAR-T细胞至1亿个CAR-T细胞、300万个CAR-T细胞至400万个CAR-T细胞、300万个CAR-T细胞至500万个CAR-T细胞、300万个CAR-T细胞至600万个CAR-T细胞、300万个CAR-T细胞至700万个CAR-T细胞、300万个CAR-T细胞至800万个CAR-T细胞、300万个CAR-T细胞至900万个CAR-T细胞、300万个CAR-T细胞至1000万个CAR-T细胞、300万个CAR-T细胞至5000万个CAR-T细胞、300万个CAR-T细胞至1亿个CAR-T细胞、400万个CAR-T细胞至500万个CAR-T细胞、400万个CAR-T细胞至600万个CAR-T细胞、400万个CAR-T细胞至700万个CAR-T细胞、400万个CAR-T细胞至800万个CAR-T细胞、400万个CAR-T细胞至900万个CAR-T细胞、400万个CAR-T细胞至1000万个CAR-T细胞、400万个CAR-T细胞至5000万个CAR-T细胞、400万个CAR-T细胞到1亿个CAR-T细胞、500万个CAR-T细胞至600万个CAR-T细胞、500万个CAR-T细胞至700万个CAR-T细胞、500万个CAR-T细胞至800万个CAR-T细胞、500万个CAR-T细胞至900万个CAR-T细胞、500万个CAR-T细胞至1000万个CAR-T细胞、500万个CAR-T细胞至5000万个CAR-T细胞、500万个CAR-T细胞至1亿个CAR-T细胞、600万个CAR-T细胞至700万个CAR-T细胞、600万个CAR-T细胞至800万个CAR-T细胞、600万个CAR-T细胞至900万个CAR-T细胞、600万个CAR-T细胞至1000万个CAR-T细胞、600万个CAR-T细胞至5000万个CAR-T细胞、600万个CAR-T细胞至1亿个CAR-T细胞、700万个CAR-T细胞至800万个CAR-T细胞、700万个CAR-T细胞至900万个CAR-T细胞、700万个CAR-T细胞至1000万个CAR-T细胞、700万个CAR-T细胞至5000万个CAR-T细胞、700万个CAR-T细胞至1亿个CAR-T细胞、800万个CAR-T细胞至900万个CAR-T细胞、800万个CAR-T细胞至1000万个CAR-T细胞、800万个CAR-T细胞至5000万个CAR-T细胞、800万个CAR-T细胞至1亿个CAR-T细胞、900万个CAR-T细胞至1000万个CAR-T细胞、900万个CAR-T细胞至5000万个CAR-T细胞、900万个CAR-T细胞至1亿个CAR-T细胞1000万个CAR-T细胞至5000万个CAR-T细胞、1000万个CAR-T细胞至1亿个CAR-T细胞、或5000万个CAR-T细胞至1亿个CAR-T细胞。在某些实施例中，单剂量包含100万个CAR-T细胞、200万个CAR-T细胞、300万个CAR-T细胞、400万个CAR-T细胞、500万个CAR-T细胞、600万个CAR-T细胞、700万个CAR-T细胞、800万个CAR-T细胞、900万个CAR-T细胞、1000万个CAR-T细胞、5000万个CAR-T细胞、或1亿个CAR-T细胞。在某些实施例中，单个剂量包含至少100万个CAR-T细胞、200万个CAR-T细胞、300万个CAR-T细胞、400万个CAR-T细胞、500万个CAR-T细胞、600万个CAR-T细胞、700万个CAR-T细胞、800万个CAR-T细胞、900万个CAR-T细胞、1000万个CAR-T细胞、或5000万个CAR-T细胞。在某些实施例中，单一剂量包含至多200万个CAR-T细胞、300万个CAR-T细胞、400万个CAR-T细胞、500万个CAR-T细胞、600万个CAR-T细胞、700万个CAR-T细胞、800万个CAR-T细胞、900万个CAR-T细胞、1000万个CAR-T细胞、5000万个CAR-T细胞、或1亿个CAR-T细胞。

在某些实施例中，本公开的抗ROR-1CAR-T细胞群包含在包含一种或多种药学上可接受的赋形剂、载体和稀释剂的药物组合物中。在某些实施例中，本公开的CAR-T细胞悬浮于无菌等渗溶液中施用。在某些实施例中，溶液包含约0.9％的NaCl。在某些实施例中，溶液包含约5.0％的葡萄糖。在某些实施例中，溶液还包含以下一种或多种：缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸盐、组氨酸、琥珀酸盐、磷酸盐、碳酸氢盐和羟甲基氨基甲烷(Tris)；表面活性剂，例如聚山梨醇酯80(吐温80)、聚山梨醇酯20(吐温20)和泊洛沙姆188；多元醇/二糖/多糖，例如葡萄糖、右旋糖、甘露糖、甘露醇、山梨糖醇、蔗糖、海藻糖和葡聚糖40；氨基酸，例如甘氨酸或精氨酸；抗氧化剂，例如抗坏血酸、蛋氨酸；或螯合剂，例如EDTA或EGTA。CAR-T细胞在配制时，可以在一定的pH值下缓冲，通常在约7.0和约8.0之间。在某些实施例中，细胞在约7.4(平均在约7.35和7.45之间)的生理pH值下缓冲。

本文还描述了治疗已经发生一种或多种与CAR T细胞治疗相关的严重不良事件的个体的方法，包括施用cirmtuzumab的推注。这种给药方式会阻止CAR T细胞与其靶标相互作用并减弱其活性。

本文还描述了试剂盒，其包含在合适容器中的一种或多种编码本文所述的CAR-t细胞的核酸和一种或多种选自以下的额外组分：使用说明；稀释剂、赋形剂、载体和施用装置。

在某些实施例中，本文描述了一种制备癌症治疗的方法，包括将一种或多种药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂与本公开的抗体混合。在某些实施例中，本文描述了一种制备储存或运输的癌症治疗的方法，包括冻干本公开的一种或多种抗体。

实施例

以下说明性实施例代表本文所述的组合物和方法的实施例，并不意味着以任何方式进行限制。

实施例1：靶向ROR-1的嵌合抗原受体修饰的T细胞(CAR-T)

之前已经描述了一系列靶向ROR-1抗原的单克隆抗体，该靶标是在患有CLL、MCL和乳腺癌的患者中使用抗人ROR-1mAb UC-961(cirmtuzumab)与标准化疗组合进行的临床试验的主题。在这些实施例中构建和测试的CAR利用了cirmtuzumab抗体的互补决定区(CDR)和可变区(V_H/V_L)。在WO 2014/031174中公开了cirmtuzumab抗体和编码其CDRS和VH/VL的序列。

在CAR-T领域，有几个未满足的癌症治疗需求。本文所述的CAR T细胞解决了这些未满足的需求。

治疗失败

CAR-T治疗后，复发的患者人数越来越多，通常是由于逃避CAR-T细胞的靶肿瘤抗原(例如CD19)的突变或丢失。使用ROR-1作为靶标可能会减少抗原阴性复发，因为ROR-1表达与侵袭性肿瘤表型相关，而ROR-1突变或抗原丢失可能会使癌细胞侵袭性降低并对化疗敏感。

安全问题

持续存在的CAR-T安全问题包括潜在地与表达靶抗原的正常细胞(“靶点非肿瘤效应(on-target/off-tumor)”)的激活相关的死亡。之前的研究表明，在GLP组织交叉反应性研究中，Cirmtuzumab不与正常人体组织结合，并且在临床研究中没有与仅cirmtuzumab相关的严重不良事件的报道。

治疗干预的另一个途径是使用这些抗人ROR-1抗体(包括UC-961)的抗原结合结构域作为CAR的靶向部分。图1A示出了抗ROR-1CAR-T细胞与表达ROR-1的癌细胞(CLL)相互作用的艺术构想图。图1B示出了本公开内容的CAR的不同非限制性实施例的示意图。本公开的CAR描述了抗人ROR-1mAb4A5或UC-961的轻链CDR，其通过特异性接头连接至相同mAb的重链CDR，所述接头产生高亲和力单链(scFv)分子，其以足够亲和力特异性结合人ROR-1以激活转导的T淋巴细胞中的细胞内信号转导和细胞毒性。为了将scFv附着到跨膜结构域，已经创建了一系列由IgG4生成的蛋白质间隔子。这些间隔子使抗ROR-1scFv结合结构域具有足够的灵活性以最佳地结合靶ROR-1抗原。

仍然参考图1B，来自CAR的细胞外抗原结合结构域与CD28跨膜结构域结合。然后，该跨膜结构域被附着到CD28和/或CD137衍生自的细胞内激活结构域，其被单独(第2代CAR)使用或组合(第3代CAR)使用。然后将这些激活结构域连接到包含在CD3 zeta链(CD3ζ链)中的T细胞受体激活结构域。因此，抗ROR-1CAR(如图1A、1B、1C所示)表达为单个多肽，从N-末端开始依次包含：将构建体引导至细胞表面的前导、4A5或UC-961mAb的轻链CDR、连接轻链和重链的接头、由相应轻链分子补充的4A5或UC-961mAb的重链CDR、由包括IgG4铰链区的IgG4产生的限定长度的间隔子、CD28跨膜区、CD28和41-BB(CD137)的细胞内激活结构域，其单独地或串联地连接到延伸到该分子羧基末端的T细胞ζ链。图2A和2B示出了说明具有不同间隔子结构域的CAR的载体示意图。

如图3所示，本文所述的CAR可以被包含在基于转座子的或慢病毒的载体中，并采用标准转染或转导技术引入靶淋巴细胞。为了最大限度地稳定CAR产品的转导和长期表达，使用了逆转录病毒传递系统，其包括鼠γ和人类慢病毒。目前，第三代慢病毒、四质粒系统(Addgene,Inc.)用于使T淋巴细胞对表达ROR-1的CAR进行转基因。所述第三代系统基于慢病毒载体系统，其描述于Naldini et al,“Efficient transfer,integration,andsustained long-term expression of the transgene in adult rat brains injectedwith a lentiviral vector”Proc Natl Acad Sci USA.1996Oct 15；93(21):11382–11388。所述四质粒系统包括：质粒1-gag/pol；质粒2-rev；质粒3VSV-G蛋白；和质粒4转移质粒，其包含编码抗-ROR1 CAR的核酸序列，该核酸序列已使用多接头中的限制性位点插入。

图4A和4B说明制备表达抗ROR-1CAR的T细胞的步骤。参考图4A，从外周血单核细胞(PBMC)中分离T细胞，随后用CD3/Cd28纳米颗粒激活，用慢病毒转导，以及可选的分析步骤以验证CAR表达和特异性。

图5A示出总PBMC的流式细胞术分析。图5B示出纯化后的CD8+和CD4+群体。图6A示出CD3/CD28的激活导致CD4+(80％)和CD8+(63％)细胞两者的激活，并且图6B示出慢病毒转导导致CD8+T细胞的剂量依赖性转导效率为10％(MOI 1)或28％(MOI 3)；或CD4+T细胞的剂量依赖性转导效率为15％(MOI 1)或34％(MOI 3)的。图7A和7B示出了T淋巴细胞慢病毒转导后抗ROR-1CAR表达的时间进程。

实施例2：靶向ROR-1的嵌合抗原受体修饰的T细胞(CAR-T)的体外活性

根据上述方案创建了几种靶向癌症相关抗原ROR-1的嵌合抗原受体(CAR)并用于转导细胞毒性T淋巴细胞。

为了产生抗人ROR1 T细胞CAR，用不同的信号和间隔子结构域产生了多个候选第2代和第3代CAR构建体。为了测试这些构建体，在补充有IL-2的无血清生长培养基中生产并扩增了候选CAR-T。使用该方案，已经生成了来自20多个健康供体的CAR-T细胞，并使用铬释放和阻抗测定法在体外检查了它们对淋巴癌的活性。使用4-1BB共刺激结构域的第2代CAR甚至在低效应物与靶标(E：T)比率下也具有活性，消除了原代B细胞白血病和淋巴瘤，以及表达ROR1靶标的肿瘤细胞系。

这些T细胞CAR在血液和实体瘤癌症上表达的靶向ROR-1中显示特异的活性。如图8A所示，表达抗ROR-1CAR的T淋巴细胞在不同的效应物与靶标(E:T)比率下可有效杀死白血病MEC-1/ROR1细胞。这些结果是通过使用4小时铬释放测定得出的。在这项研究中，表达铰链和CH3间隔子的抗ROR1 CAR具有最大的活性。对于图8A，“仅激活”(最左边的条；ET9)是从PBMC或血液制品中分离的T细胞，其经历了与CAR-T细胞相同的激活和细胞培养过程，但没有慢病毒CAR的转导；“长UC961(long UC961)”(左起第二个条形)是指利用CH2CH3间隔子的构建体，包含间隔子#3(SEQ ID NO:29)和hIgG4的CH2和CH3区；“CH3”(左起第三个条)是指使用间隔子CH3的CAR-T构建体，包含间隔子#3和人IgG4的CH3区；“铰链”(左起第四个条形)是指使用间隔子#3(铰链)而没有人IgG4 CH2和CH3结构域的CAR-T构建体。图8B示出了使用非ROR-1表达的MEC-1细胞进行的4小时铬释放测定。该数据表明，ROR-1CAR具有特异性，并且仅基于靶细胞表面存在ROR-1才能杀死。图8B中的条的顺序如图8A所示。

图8C示出了第2或第3代抗ROR-1CAR对细胞毒性的影响。除了将铰链或CH3作为第2代CAR(仅4-1BB细胞内信号转导结构域)或第3代CAR(4-1BB和CD28细胞内信号转导结构域)进行比较外，图8C显示了与图8A和8B类似的实验设置。第2代和第3代CAR对于具有完整CH3铰链的构建体没有区别，但是与仅具有铰链且没有CH3的构建体的第2代的设计相比，第3代的设计的杀伤有所提高。图8D示出不表达ROR-1的MEC-1细胞没有被杀死，表明这些CAR也具有特异性。图8E.来自两个不同供体的CAR T对MEC1-ROR1细胞的细胞杀伤。

如图9A所示抗ROR-1CAR杀死MCF-7ROR-1细胞。该图显示了如实施例1所述产生的具有不同间隔子长度的抗ROR-1T细胞CAR对MCF-7/ROR-1乳腺癌细胞的特异性杀伤。这些结果是通过使用96小时阻抗测定(ACEA)产生的。在这项研究中，表达铰链和CH3结构域的抗ROR-1CAR对ROR-1阳性细胞具有最大的活性。如图9A中所用，“CH3”是指利用间隔子CH3的CAR-T构建体，包含间隔子#3(SEQ ID NO:29)和人IgG4的CH3区；“铰链”是指使用间隔子#3(铰链)而没有人IgG4 CH2或CH3的CAR-T构建体；“ET1”是指在细胞毒性测定中，抗ROR-1CAR-T细胞针对靶细胞的效应物与靶标比例为1比1。图9B表明图9A中观察到的杀伤是特异性的，因为不表达ROR-1的MCF-7细胞不会被抗ROR-1CAR-T细胞杀死。图9C显示了来自两个不同健康供体的CAR T细胞的杀伤。

图10说明表达抗ROR-1CAR的T淋巴细胞以不同的效应物与靶标比率，杀死天然表达ROR-1的MEC1/ROR-1细胞和Jeko细胞。

实施例3:靶向ROR-1的嵌合抗原受体修饰的T细胞(CAR-T)的体内活性

为了在体内测试ROR1 T细胞CAR，创建了荧光素酶/RFP双特异性慢病毒表达载体来修饰人MEC1-ROR1白血病细胞(Yu et al.,J Clin Invest,2015)。当注射到免疫缺陷的NSG小鼠中时，MEC1-ROR1细胞会浸润骨髓(股骨)、肾脏、脾脏和肝脏，产生进行性和致命的白血病/淋巴瘤。如图11A所示，当注射到免疫缺陷小鼠体内时，这种高活性细胞系会迅速扩展到骨髓(股骨)、肾脏、脾脏、肝脏和血液中，动物在大约3周内死于白血病。体内实验如图11B(上)所示进行，简而言之，小鼠在第1天注射1x10⁶个ROR-1/MEC1-荧光素酶细胞，然后在第4天注射1x10⁶或3x10⁶个抗ROR-1CAR-T细胞。在随后的时间点使用修饰的MEC细胞的生物发光测量肿瘤生长。

注射肿瘤细胞的小鼠对体外研究中的第2代CAR-T细胞产生了剂量依赖性的反应。3x10⁶个抗ROR-1CAR T细胞能够清除荧光素酶表达的ROR-1/MEC细胞，如图12和图13所示。到第3周，快速增殖的白血病细胞从骨髓中清除，到第4周检测不到剩余的白血病细胞，动物存活超过90天，而在没有这些CAR-T细胞的情况下，动物存活时间超过21天。图14示出，到第11天和第18天，抗ROR1 CAR-T细胞是动物骨髓和肾脏的主要成分。此外，在用MEC-1ROR1细胞(左图)与模拟对照(右图)预处理的小鼠中，CAR-T细胞的浓度显着更高，这表明携带白血病细胞的动物中CAR-T的扩增增加。

总结这里显示的结果:

单次注射3x10⁶个抗ROR1 4-1BB CAR T细胞，无需预处理方案或细胞因子补充方案，在携带MEC1-ROR1异种移植物的动物中扩增，并定位到MEC1-ROR1疾病活动的位点。

到第四周，快速增殖的白血病细胞从包括骨髓、肾脏和脾脏在内的主要组织库中清除。

CAR-T治疗的动物存活超过90天，而那些仅接受未转导的激活的T细胞或未经处理的对照动物则存活约21天。

注射后几个月，在小鼠组织中检测到所施用的CAR T产品，且具有高度活性。

这些研究已扩展到其他淋巴肿瘤细胞系，包括表达ROR-1的JeKo细胞。

虽然本发明的优选实施例已在本文中示出和描述，但对于本领域技术人员来说，显而易见的是，这些实施例仅通过示例的方式提供。在不脱离本发明的前提下，本领域技术人员能够进行无数次变更、更改和替换。应当理解，在实施本发明时可以采用本文所述的本发明实施例的各种替代方案。

本说明书中提及的所有出版物、专利申请、已授权专利和其它文献通过引用并入本文，如同每个单独的出版物、专利申请、已授权专利或其它文献被具体地和单独地指示通过引用整体并入。通过引用合并的文本中包含的定义与本公开内容中的定义相矛盾，则排除在外。

非正式序列表：

UC961 VL：

DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRASKSISKYLAWYQQKPGQAPRLLIYSGSTLQSGIPPRFSGSGYGTDFTLTINNIESEDAAYYFCQQHDESPYTFGEGTKVEIK(SEQ ID NO:21)

接头#3:

GGGGSGSTSGSGKPGSGEGSTKGGGGGS(SEQ ID NO:24)

UC961 VH:

QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGYAFTAYNIHWVRQAPGQGLEWMGSFDPYDGGSSYNQKFKDRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARGWYYFDYWGHGTLVTVSS(SEQ ID NO:27)

间隔子#3(或“铰链/短”):

VDESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO:29)

间隔子CH3:

VDESKYGPPCPPCPLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:41)

间隔子CH2CH3(或“长/全”)：

VDESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:42)

UC961 CDR L1:

KSISKY(SEQ ID NO:43)

UC961 CDR L2:

SGS(SEQ ID NO:44)

UC961 CDR L3:

QQHDESPY(SEQ ID NO:45)

UC961 CDR H1:

GYAFTAYN(SEQ ID NO:46)

UC961 CDR H2:

FDPYDGGS(SEQ ID NO:47)

UC961 CDR H3:

GWYYFDY(SEQ ID NO:48)

4A5 CDR L1:

PDINSY(SEQ ID NO:49)

4A5 CDR L2:

RAN(SEQ ID NO:50)

4A5 CDR L3:

LQYDEFPYT(SEQ ID NO:51)

4A5 CDR H1:

GFTFSSYA(SEQ ID NO:52)

4A5 CDR H2:

ISRGGTT(SEQ ID NO:53)

4A5 CDR H3:

YDYDGYYAMDY(SEQ ID NO:54)

全长人ROR-1蛋白(SEQ ID NO:55):

MHRPRRRGTRPPLLALLAALLLAARGAAAQETELSVSAELVPTSSWNISSELNKDSYLTLDEPMNNITTSLGQTAELHCKVSGNPPPTIRWFKNDAPVVQEPRRLSFRSTIYGSRLRIRNLDTTDTGYFQCVATNGKEVVSSTGVLFVKFGPPPTASPGYSDEYEEDGFCQPYRGIACARFIGNRTVYMESLHMQGEIENQITAAFTMIGTSSHLSDKCSQFAIPSLCHYAFPYCDETSSVPKPRDLCRDECEILENVLCQTEYIFARSNPMILMRLKLPNCEDLPQPESPEAANCIRIGIPMADPINKNHKCYNSTGVDYRGTVSVTKSGRQCQPWNSQYPHTHTFTALRFPELNGGHSYCRNPGNQKEAPWCFTLDENFKSDLCDIPACDSKDSKEKNKMEILYILVPSVAIPLAIALLFFFICVCRNNQKSSSAPVQRQPKHVRGQNVEMSMLNAYKPKSKAKELPLSAVRFMEELGECAFGKIYKGHLYLPGMDHAQLVAIKTLKDYNNPQQWMEFQQEASLMAELHHPNIVCLLGAVTQEQPVCMLFEYINQGDLHEFLIMRSPHSDVGCSSDEDGTVKSSLDHGDFLHIAIQIAAGMEYLSSHFFVHKDLAARNILIGEQLHVKISDLGLSREIYSADYYRVQSKSLLPIRWMPPEAIMYGKFSSDSDIWSFGVVLWEIFSFGLQPYYGFSNQEVIEMVRKRQLLPCSEDCPPRMYSLMTECWNEIPSRRPRFKDIHVRLRSWEGLSSHTSSTTPSGGNATTQTTSLSASPVSNLSNPRYPNYMFPSQGITPQGQIAGFIGPPIPQNQRFIPINGYPIPPGYAAFPAAHYQPTGPPRVIQHCPPPKSRSPSSASGSTSTGHVTSLPSSGSNQEANIPLLPHMSIPNHPGGMGITVFGNKSQKPYKIDSKQASLLGDANIHGHTESMISAEL

人ROR-1的21个氨基酸段，包括第138位谷氨酸(SEQ ID NO:56)：

VATNGKEVVSSTGVLFVKFGP

人ROR-1的15个氨基酸段，包括第138位谷氨酸(SEQ ID NO:57)：EVVSSTGVLFVKFGP

P实施例

P实施例1.重组蛋白包括：(i)抗体区域，其包括：(a)轻链可变结构域，其包含如在SEQ ID NO：43中所列的CDR L1、如SEQ ID NO：44中所列的CDR L2和如SEQ ID NO：45中所列的CDR L3；和(b)重链可变结构域，其包含如SEQ ID NO：46中所列的CDR H1、如SEQ ID NO：47中所列的CDR H2和如SEQ ID NO：48中所列的CDR H3；和(ii)跨膜结构域。

P实施例2.重组蛋白包括：(i)抗体区，其包括：(a)轻链可变结构域，其包含如在SEQ ID NO：49中所列的CDR L1、如SEQ ID NO：50中所列的CDR L2和如SEQ ID NO：51中所列的CDR L3；和(b)重链可变结构域，其包含如SEQ ID NO：52中所列的CDR H1、如SEQ ID NO：53中所列的CDR H2和如SEQ ID NO：54中所列的CDR H3；和(ii)跨膜结构域。

P实施例3.根据P实施例1所述的重组蛋白，其中，所述轻链可变结构域的C-末端与所述重链可变结构域的N-末端结合。

P实施例4.根据P实施例1至3中任一项所述的重组蛋白，其中，所述轻链可变结构域通过化学接头共价结合于所述重链可变结构域。

P实施例5.根据P实施例1至4中任一项所述的重组蛋白，其中，所述化学接头是肽接头。

P实施例6.根据P实施例5的重组蛋白，其中，所述肽接头具有SEQ ID NO:24的序列。

P实施例7.根据P实施例1至6中任一项所述的重组蛋白，其中，所述重链可变结构域的C-末端与所述跨膜结构域的N-末端结合。

P实施例8.根据P实施例1至7中所述任一项的重组蛋白，其中，所述重链可变结构域通过间隔子与所述跨膜结构域共价结合。

P实施例9.根据P实施例8所述的重组蛋白，其中，所述间隔子结构域包含抗体结构域。

P实施例10.根据P实施例9所述的重组蛋白，其中，所述抗体结构域包含铰链结构域、恒定重链3(CH3)结构域、恒定重链2(CH2)结构域或其任意组合。

P实施例11.根据P实施例9或10所述的重组蛋白，其中，所述抗体结构域由铰链结构域组成。

P实施例12.根据P实施例9或10所述的重组蛋白，其中，所述抗体结构域由铰链结构域和恒定重链3(CH3)结构域组成。

P实施例13.根据P实施例9或10所述的重组蛋白，其中，所述抗体结构域由铰链结构域、恒定重链3(CH3)结构域和恒定重链2(CH2)结构域组成。

P实施例14.根据P实施例9至13中任一项所述的重组蛋白，其中，所述间隔子结构域包含SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42的序列。

P实施例15.根据P实施例9至13中任一项所述的重组蛋白，其中，所述间隔子结构域具有SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42的序列。

P实施例16.根据P实施例1至15任一项所述的重组蛋白，其中，所述轻链可变结构域包括SEQ ID NO:21的序列。

P实施例17.根据P实施例1至16中任一项所述的重组蛋白，其中，所述轻链可变结构域具有SEQ ID NO:21的序列。

P实施例18.根据P实施例1至17中所述任一项的重组蛋白，其中，所述重链可变结构域包含SEQ ID NO:27的序列。

P实施例19.根据P实施例1至18中任一项所述的重组蛋白，其中，所述重链可变结构域具有SEQ ID NO:27的序列。

P实施例20.根据P实施例2至13中任一项所述的重组蛋白，其中，所述轻链可变结构域包括SEQ ID NO:19的序列。

P实施例21.根据P实施例2至13或实施例20中任一项所述的重组蛋白，其中，所述轻链可变结构域具有SEQ ID NO:19的序列。

P实施例22.根据P实施例2至13中任一项所述的重组蛋白，其中，所述轻链可变结构域包括SEQ ID NO:20的序列。

P实施例23.根据P实施例2至13或实施例22中任一项所述的重组蛋白，其中，所述轻链可变结构域具有SEQ ID NO:20的序列。

P实施例24.根据P实施例2至13中任一项所述的重组蛋白，其中，所述重链可变结构域包含SEQ ID NO:25的序列。

P实施例25.根据P实施例2至13或实施例24中任一项所述的重组蛋白，其中所述重链可变结构域具有SEQ ID NO:25的序列。

P实施例26.根据P实施例2至13中任一项的重组蛋白，其中，所述重链可变结构域包含SEQ ID NO:26的序列。

P实施例27.根据P实施例2至13或实施例26中任一项所述的重组蛋白，其中，所述重链可变结构域具有SEQ ID NO:26的序列。

P实施例28.根据P实施例1至27中任一项所述的重组蛋白，其中，所述跨膜结构域是CD8α跨膜结构域、CD28跨膜结构域、CD4跨膜结构域或CD3ζ跨膜结构域或其任何组合。

P实施例29.根据P实施例1至28中任一项所述的重组蛋白，其中，所述跨膜结构域是CD28跨膜结构域。

P实施例30.根据P实施例29所述的重组蛋白，其中，所述CD28跨膜结构域包含SEQID NO:32的序列。

P实施例31.根据P实施例29所述的重组蛋白，其中，所述CD28跨膜结构域具有SEQID NO:32的序列。

P实施例32.根据P实施例1至31中任一项所述的重组蛋白，进一步包含一个或多个细胞内共刺激信号转导结构域。

P实施例33.根据P实施例32所述的重组蛋白，其中，所述一个或多个细胞内共刺激信号转导结构域是4-1BB细胞内共刺激信号转导结构域、CD28细胞内共刺激信号转导结构域、ICOS细胞内共刺激信号转导结构域、OX-40细胞内共刺激信号转导结构域或其任意组合。

P实施例34.根据P实施例32或33所述的重组蛋白，包含4-1BB细胞内共刺激信号转导结构域。

P实施例35.根据P实施例34所述的重组蛋白，其中，所述4-1BB细胞内共刺激信号转导结构域包含SEQ ID NO:33的序列。

P实施例36.根据P实施例34或35所述的重组蛋白，其中，所述4-1BB细胞内共刺激信号转导结构域具有SEQ ID NO:33的序列。

P实施例37.根据P实施例32所述的重组蛋白，包含CD28细胞内共刺激信号转导结构域和4-1BB胞内共刺激信号转导结构域。

P实施例38.根据P实施例1至37中任一项所述的重组蛋白，进一步包含细胞内T细胞信号转导结构域。

P实施例39.根据P实施例38所述的重组蛋白，其中，所述细胞内T细胞信号转导结构域为CD3ζ细胞内T细胞信号转导结构域。

P实施例40.根据P实施例39所述的重组蛋白，其中，所述CD3ζ细胞内T细胞信号转导结构域包含SEQ ID NO:34的序列。

P实施例41.根据P实施例39所述的重组蛋白，其中，所述CD3ζ细胞内T细胞信号转导结构域具有SEQ ID NO:34的序列。

P实施例42.根据P实施例1至41中任一项的重组蛋白，其中，所述重组蛋白与细胞结合。

P实施例43.根据P实施例42所述的重组蛋白，其中，所述细胞是癌细胞。

P实施例44.根据P实施例43所述的重组蛋白，其中，所述癌细胞是白血病细胞、淋巴瘤细胞、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)细胞、成人急性骨髓性白血病(AML)细胞、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)细胞、套细胞淋巴瘤(MCL)细胞、多发性骨髓瘤细胞、卵巢癌细胞、结肠癌细胞、肺癌细胞、皮肤癌细胞、胰腺癌细胞、睾丸癌细胞、膀胱癌细胞、子宫癌细胞、前列腺癌细胞、乳腺癌细胞或肾上腺癌细胞。

P实施例45.根据P实施例1至44中任一项所述的重组蛋白，其中，所述重组蛋白形成细胞的一部分。

P实施例46.根据P实施例1至46中任一项所述的重组蛋白，其中，所述重组蛋白形成T细胞的一部分。

P实施例47.一种分离的核酸，其编码P实施例1-46中任一项所述的重组细胞因子受体结合蛋白。

P实施例48.一种药物组合物，其包括P实施例1-46中任一项所述的治疗有效量的重组蛋白及药学上可接受的赋形剂。

P实施例49.一种治疗有此需要的受试者所患癌症的方法，所述方法包括向受试者施用P实施例1-46中任一项所述的治疗有效量的重组蛋白来治疗所述受试者所患癌症。

实施例

实施例1.嵌合抗原受体，包括:

抗原结合区，其中，所述抗原结合区特异性地结合ROR-1，其中所述抗原结合区包含轻链可变结构域和重链可变结构域；

其中，所述的轻链可变结构域包含如SEQ ID NO:43中所列的CDR L1、如SEQ IDNO:44中所列的CDR L2和如SEQ ID NO:45中所列的的CDR L3，以及所述的重链可变结构域包含如SEQ ID NO:46中所列的CDR H1、如SEQ ID NO:47中所列的CDR H2和如SEQ ID NO:48中所列的CDR H3；或

所述的轻链可变结构域包含如SEQ ID NO:49中所列的CDR L1、如SEQ ID NO:50中所列的CDR L2和如SEQ ID NO:51中所列的CDR L3，以及所述的重链可变结构域包含如SEQID NO:52中所列的CDR H1、如SEQ ID NO:53中所列的CDR H2和如SEQ ID NO:54中所列的CDR H3。

间隔子结构域，其中所述间隔子包含长度在10至240个氨基酸之间的间隔子结构域；

跨膜结构域；和

细胞内结构域。

实施例2.根据实施例1所述的嵌合抗原受体，其中，间隔子的长度在14到120个氨基酸之间。

实施例3.根据实施例1或2所述的嵌合抗原受体，其中，所述轻链可变结构域是所述重链可变结构域的N-端。

实施例4.根据实施例3所述的嵌合抗原受体，其中，所述轻链可变结构域通过多肽接头共价偶联至所述重链可变结构域。

实施例5.根据实施例4所述的嵌合抗原受体，其中，所述多肽接头由SEQ ID NO:24的序列组成。

实施例6.根据实施例1至5中任一项所述的嵌合抗原受体，其中，所述间隔子结构域包括抗体结构域。

实施例7.根据实施例6所述的嵌合抗原受体，其中，所述抗体结构域包含免疫球蛋白铰链结构域、免疫球蛋白恒定重链3(CH3)结构域、免疫球蛋白恒定重链2(CH2)结构域或其任何组合。

实施例8.根据实施例7所述的嵌合抗原受体，其中，所述抗体结构域由所述免疫球蛋白铰链结构域组成。

实施例9.根据实施例7所述的嵌合抗原受体，其中所述抗体结构域由免疫球蛋白铰链结构域和所述免疫球蛋白恒定重链3(CH3)结构域组成。

实施例10.根据实施例7所述的嵌合抗原受体，其中，所述抗体结构域由所述免疫球蛋白铰链结构域、所述免疫球蛋白恒定重链3(CH3)结构域和所述免疫球蛋白恒定重链2(CH2)结构域组成。

实施例11.根据实施例7所述的嵌合抗原受体，其中，所述间隔子结构域包含SEQID NO:29、SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42的序列。

实施例12.根据实施例7的嵌合抗原受体，其中，所述间隔子结构域由SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42的序列组成。

实施例13.根据实施例7至12中任一项所述的嵌合抗原受体，其中，所述轻链可变结构域包含与SEQ ID NO:21至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。

实施例14.根据实施例7至12中任一项所述的嵌合抗原受体，其中，所述轻链可变结构域由SEQ ID NO:21的序列组成。

实施例15.根据实施例7至12中任一项所述的嵌合抗原受体，其中，所述重链可变结构域包含与SEQ ID NO:27至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。

实施例16.根据实施例1至12中任一项所述的嵌合抗原受体，其中，所述重链可变结构域由SEQ ID NO:27的序列组成。

实施例17.根据实施例1至12中任一项所述的嵌合抗原受体，其中，所述轻链可变结构域包含与SEQ ID NO:19至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。

实施例18.根据实施例1至12中任一项所述的嵌合抗原受体，其中，所述轻链可变结构域由SEQ ID NO:19的序列组成。

实施例19.根据实施例1至12中任一项所述的嵌合抗原受体，其中，所述轻链可变结构域包含与SEQ ID NO:20至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。

实施例20.根据实施例1至12中任一项所述的嵌合抗原受体，其中，所述轻链可变结构域由SEQ ID NO:20的序列组成。

实施例21.根据实施例1至12中任一项所述的嵌合抗原受体，其中，所述重链可变结构域包含与SEQ ID NO:25至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。

实施例22.根据实施例1至12中任一项所述的嵌合抗原受体，其中，所述重链可变结构域由SEQ ID NO:25的序列组成。

实施例23.根据实施例1至12中任一项所述的嵌合抗原受体，其中，所述重链可变结构域包含与SEQ ID NO:26至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。

实施例24.根据实施例1至12中任一项所述的嵌合抗原受体，其中，所述重链可变结构域由SEQ ID NO:26的序列组成。

实施例25.根据实施例1至24中任一项所述的嵌合抗原受体，其中，所述跨膜结构域包含CD8α跨膜结构域、CD28跨膜结构域、CD4跨膜结构域、CD3ζ跨膜结构域或其任何组合。

实施例26.根据实施例25所述的嵌合抗原受体，其中，所述跨膜结构域是CD28跨膜结构域。

实施例27.根据实施例25所述的嵌合抗原受体，其中，所述CD28跨膜结构域包含SEQ ID NO:32的序列。

实施例28.根据实施例25所述的嵌合抗原受体，其中，所述CD28跨膜结构域由SEQID NO:32的序列组成。

实施例29.根据实施例1至28中任一项所述的嵌合抗原受体，其中，所述细胞内结构域包含一个或多个细胞内共刺激信号转导结构域、一个或多个细胞内T细胞信号转导结构域、或一个或多个细胞内共刺激信号转导结构域和一个或多个细胞内T细胞信号转导结构域。

实施例30.根据实施例29所述的嵌合抗原受体，其中，所述一个或多个细胞内共刺激信号转导结构域是4-1BB细胞内共刺激信号转导结构域、CD28细胞内共刺激信号转导结构域、ICOS细胞内共刺激信号转导结构域、OX-40细胞内共刺激信号转导结构域或其任意组合。

实施例31.根据实施例29所述的嵌合抗原受体，包含4-1BB细胞内共刺激信号转导结构域。

实施例32.根据实施例31所述的嵌合抗原受体，其中，所述4-1BB细胞内共刺激信号转导结构域包含SEQ ID NO:33的序列。

实施例33.根据实施例31所述的嵌合抗原受体，其中，所述4-1BB细胞内共刺激信号转导结构域由SEQ ID NO:33的序列组成。

实施例34.根据实施例29所述的嵌合抗原受体包含CD28细胞内共刺激信号转导结构域和4-1BB细胞内共刺激信号转导结构域。

实施例35.根据实施例1至34中任一项所述的嵌合抗原受体，进一步包含细胞内T细胞信号转导结构域。

实施例36.根据实施例35所述的嵌合抗原受体，其中所述细胞内T细胞信号转导结构域为CD3ζ细胞内T细胞信号转导结构域。

实施例37.根据实施例36所述的嵌合抗原受体，其中，所述CD3ζ细胞内T细胞信号转导结构域包含SEQ ID NO:34的序列。

实施例38.根据实施例36所述的嵌合抗原受体，其中，所述CD3ζ细胞内T细胞信号转导结构域由SEQ ID NO:34的序列组成。

实施例39.根据实施例1至38中任一项所述的嵌合抗原受体，其中，所述嵌合抗原受体与表达ROR-1的细胞结合。

实施例40.一种编码实施例1至39中任一项所述的嵌合抗原受体的核酸。

实施例41.根据实施例40所述的核酸，其中，所述核酸是病毒载体，

实施例42.根据实施例41所述的核酸，其中，所述核酸载体是慢病毒载体。

实施例43.一种细胞，其包含实施例40至42中任一项所述的蛋白质。

实施例44.一种表达实施例1至39中任一项所述的嵌合抗原受体的细胞。

实施例45.根据实施例43或44所述的细胞，其中，所述细胞为淋巴细胞。

实施例46.根据实施例45所述的细胞，其中，所述T淋巴细胞是CD8阳性T淋巴细胞。

实施例47.根据实施例43或44所述的细胞，其中，所述细胞为自然杀伤细胞。

实施例48.一种药物组合物，其包含实施例43至47中任一项的治疗有效量的细胞群和药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。

实施例49.根据实施例48所述的药物组合物，配制用于静脉内注射。

实施例50.一种在有需要的个体中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述个体施用实施例48或49所述的药物组合物。

实施例51.根据实施例50所述的方法，其中，所述癌症包括白血病、淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、成人急性髓性白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、卵巢癌、结肠癌、肺癌、皮肤癌、胰腺癌、睾丸癌、膀胱癌、子宫癌、前列腺癌或肾上腺癌。

实施例52.根据实施例50或51所述的方法，其中，该方法进一步包括向个体施用cirmtuzumab。

实施例53.根据实施例52所述的方法，其中，所述cirmtuzumab和实施例48或49的所述药物组合物分开施用。

实施例54.根据实施例48或49所述的药物组合物用于治疗个体癌症的方法。

实施例55.根据实施例54使用的药物组合物，其中，所述癌症包括白血病、淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、成人急性髓性白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、卵巢癌、结肠癌、肺癌、皮肤癌、胰腺癌、睾丸癌、膀胱癌、子宫癌、前列腺癌或肾上腺癌。

实施例56.一种嵌合抗原受体，其包括:

抗原结合区，其中，所述抗原结合区特异性地结合ROR-1，其中所述抗原结合区包含轻链可变结构域和重链可变结构域；

其中，所述的轻链可变结构域包含如SEQ ID NO:43中所列的CDR L1、如SEQ IDNO:44中所列的CDR L2和如SEQ ID NO:45中所列的的CDR L3，以及所述的重链可变结构域包含如SEQ ID NO:46中所列的CDR H1、如SEQ ID NO:47中所列的CDR H2和如SEQ ID NO:48中所列的CDR H3；或

所述的轻链可变结构域包含如SEQ ID NO:49中所列的CDR L1、如SEQ ID NO:50中所列的CDR L2和如SEQ ID NO:51中所列的CDR L3，以及所述的重链可变结构域包含如SEQID NO:52中所列的CDR H1、如SEQ ID NO:53中所列的CDR H2和如SEQ ID NO:54中所列的CDR H3；

跨膜结构域；和

细胞内结构域，其中，所述细胞内结构域包括细胞内T细胞信号转导结构域和选自4-1BB、ICOS、OX-40的胞内共刺激结构域及其组合。

实施例57.根据实施例56所述的嵌合抗原受体，其包含间隔子结构域，其中所述间隔子结构域包含长度在10至200个氨基酸之间的间隔子。

实施例58.根据实施例57所述的嵌合抗原受体，其中，所述间隔子的长度在14到120个氨基酸之间。

实施例59.根据实施例56或58中任一项所述的嵌合抗原受体，其中，所述轻链可变结构域是所述重链可变结构域的N-端。

实施例60.根据实施例59所述的嵌合抗原受体，其中，所述轻链可变结构域通过多肽接头共价偶联至所述重链可变结构域。

实施例61.根据实施例60所述的嵌合抗原受体，其中，所述多肽接头由SEQ ID NO:24的序列组成。

实施例62.根据实施例56至61中任一项所述的嵌合抗原受体，其中，所述间隔子包括抗体结构域。

实施例63.根据实施例62所述的嵌合抗原受体，其中，所述抗体结构域包含免疫球蛋白铰链结构域、免疫球蛋白恒定重链3(CH3)结构域、免疫球蛋白恒定重链2(CH2)结构域或其任何组合。

实施例64.根据实施例63所述的嵌合抗原受体，其中，所述抗体域由所述免疫球蛋白铰链结构域组成。

实施例65.根据实施例63所述的嵌合抗原受体，其中，所述抗体结构域由免疫球蛋白铰链结构域和所述免疫球蛋白恒定重链3(CH3)结构域组成。

实施例66.根据实施例63所述的嵌合抗原受体，其中，所述抗体结构域由所述免疫球蛋白铰链结构域、所述免疫球蛋白恒定重链3(CH3)结构域和所述免疫球蛋白恒定重链2(CH2)结构域组成。

实施例67.根据实施例63所述的嵌合抗原受体，其中，所述间隔子结构域包含SEQID NO:29、SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42的序列。

实施例68.根据实施例63所述的嵌合抗原受体，其中，所述间隔子结构域由SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42的序列组成。

实施例69.根据实施例56至68中任一项所述的嵌合抗原受体，其中，所述轻链可变结构域包含与SEQ ID NO:21至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。

实施例70.根据实施例56至68中任一项所述的嵌合抗原受体，其中，所述轻链可变结构域由SEQ ID NO:21的序列组成。

实施例71.根据实施例56至68中任一项所述的嵌合抗原受体，其中，所述重链可变结构域包含与SEQ ID NO:27至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。

实施例72.根据实施例56至68中任一项所述的嵌合抗原受体，其中，所述重链可变结构域由SEQ ID NO:27的序列组成。

实施例73.根据实施例56至68中任一项所述的嵌合抗原受体，其中，所述轻链可变结构域包含与SEQ ID NO:19至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。

实施例74.根据实施例56至68中任一项所述的嵌合抗原受体，其中，所述轻链可变结构域由SEQ ID NO:19的序列组成。

实施例75.根据实施例56至68中任一项所述的嵌合抗原受体，其中，所述轻链可变结构域包含与SEQ ID NO:20至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。

实施例76.根据实施例56至68中任一项所述的嵌合抗原受体，其中，所述轻链可变结构域由SEQ ID NO:20的序列组成。

实施例77.根据实施例56至68中任一项所述的嵌合抗原受体，，其中，所述重链可变结构域包含与SEQ ID NO:25至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。

实施例78.根据实施例56至68中任一项所述的嵌合抗原受体，其中，所述重链可变结构域由SEQ ID NO:25的序列组成。

实施例79.根据实施例56至68中任一项所述的嵌合抗原受体，其中，所述重链可变结构域包含与SEQ ID NO:26至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。

实施例80.根据实施例56至68中任一项所述的嵌合抗原受体，其中，所述重链可变结构域由SEQ ID NO:26的序列组成。

实施例81.根据实施例56至80中任一项所述的嵌合抗原受体，其中，所述跨膜结构域包含CD8α跨膜结构域、CD28跨膜结构域、CD4跨膜结构域、CD3ζ跨膜结构域或其任何组合。

实施例82.根据实施例81所述的嵌合抗原受体，其中，所述跨膜结构域是CD28跨膜结构域。

实施例83.根据实施例82所述的嵌合抗原受体，其中，所述CD28跨膜结构域包含SEQ ID NO:32的序列。

实施例84.根据实施例82所述的嵌合抗原受体，其中，所述CD28跨膜结构域由SEQID NO:32的序列组成。

实施例85.根据实施例56至84中任一项所述的嵌合抗原受体，其中，所述细胞内结构域包括4-1BB细胞内共刺激信号转导结构域。

实施例86.根据实施例85所述的嵌合抗原受体，其中，所述4-1BB细胞内共刺激信号转导结构域包含SEQ ID NO:33的序列。

实施例87.根据实施例85所述的嵌合抗原受体，其中，所述4-1BB细胞内共刺激信号转导结构域由SEQ ID NO:33的序列组成。

实施例88.根据实施例56至87中任一项所述的嵌合抗原受体，其包含CD28细胞内共刺激信号转导结构域和4-1BB细胞内共刺激信号转导结构域。

实施例89.根据实施例56至88中任一项所述的嵌合抗原受体，其中，所述细胞内T细胞信号转导结构域是CD3ζ细胞内T细胞信号转导结构域。

实施例90.根据实施例89所述的嵌合抗原受体，其中，所述CD3ζ细胞内T细胞信号转导结构域包括SEQ ID NO:34的序列。

实施例91.根据实施例89所述的嵌合抗原受体，其中，所述CD3ζ细胞内T细胞信号转导结构域由SEQ ID NO:34的序列组成。

实施例92.根据实施例56至91中任一项所述的嵌合抗原受体，其中，所述嵌合抗原受体结合表达ROR-1的细胞。

实施例93.一种编码实施例56至92中任一项所述的嵌合抗原受体的核酸。

实施例94.根据实施例93所述的核酸，其中所述核酸是病毒载体。

实施例95.根据实施例94所述的核酸，其中，所述病毒载体是慢病毒载体。

实施例96.一种细胞，其包含实施例93至95中任一项所述的蛋白质。

实施例97.一种细胞，其表达实施例56至92中任一项所述的嵌合抗原受体。

实施例98.根据实施例96或97所述的细胞，其中，所述细胞为淋巴细胞。

实施例99.根据实施例98所述的细胞，其中所述T淋巴细胞是CD8阳性T淋巴细胞。

实施例100.根据实施例96或97所述的细胞，其中，所述细胞为自然杀伤细胞。

实施例101.一种药物组合物，其包含实施例96至100中任一项的治疗有效量的细胞群和药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。

实施例102.根据实施例101所述的药物组合物，配制用于静脉内注射。

实施例103.一种在有需要的个体中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述个体施用实施例的药物组合物

实施例104.根据实施例103所述的方法，其中，所述癌症包括白血病、淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、成人急性髓性白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、卵巢癌、结肠癌、肺癌、皮肤癌、胰腺癌、睾丸癌、膀胱癌、子宫癌、前列腺癌或肾上腺癌。

实施例105.根据实施例103或104所述的方法，其中该方法进一步包括向个体施用cirmtuzumab。

实施例106.根据实施例105所述的方法，其中所述cirmtuzumab和实施例101或102的所述药物组合物分开施用。

实施例107.一种在治疗个体癌症的方法中使用的实施例101或102所述的药物组合物。

实施例108.根据实施例107所使用的药物组合物，其中，所述癌症包括白血病、淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、成人急性髓性白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、卵巢癌、结肠癌、肺癌、皮肤癌、胰腺癌、睾丸癌、膀胱癌、子宫癌、前列腺癌或肾上腺癌。

序列表

<110> 加利福尼亚大学董事会

<120> 用于治疗血液癌症和实体瘤癌症的嵌合抗原受体修饰的T细胞（CAR-T）

<130> 048537-623001WO

<150> US 62/824,080

<151> 2019-03-26

<150> US 62/931,103

<151> 2019-11-05

<150> US 62/969,569

<151> 2020-02-03

<160> 57

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 57

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic construct

<400> 1

atgggatggt catgtatcat cctttttcta gtagcaactg caaccggtgt acattcc 57

<210> 2

<211> 321

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic construct

<400> 2

gacatcaaga tgacccagtc tccatcttcc atgtatgcat ctctaggaga gagagtcact 60

atcacttgca aggcgagtcc ggacattaat agctatttaa gctggttcca gcagaaacca 120

gggaaatctc ctaagaccct gatctatcgt gcaaacagat tggttgatgg ggtcccatca 180

aggttcagtg gcggtggatc tgggcaagat tattctctca ccatcaacag cctggagtat 240

gaagatatgg gaatttatta ttgtctacag tatgatgaat ttccgtacac gttcggaggg 300

gggaccaagc tggaaatgaa a 321

<210> 3

<211> 321

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic construct

<400> 3

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgca aggcgagtcc ggacattaat agctatttaa gctggtttca gcagaggcca 120

ggccaatctc caaggcgcct aatttatcgt gcaaacagat tggttgatgg ggtcccagac 180

aggttcagtg gcagtgggtc aggcactgat ttcacactga aaatcagcag ggtggaggct 240

gaggatgttg gagtttatta ctgtctacag tatgatgaat ttccgtacac gttcggccaa 300

gggaccaagg tggaaatcaa a 321

<210> 4

<211> 321

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic construct

<400> 4

gatattgtga tgacccagac tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60

atctcctgca gggcaagtaa gagcattagc aaatatttag cctggtacca gcagaaacct 120

ggccaggctc ccaggctcct catctattct ggatccactt tgcaatctgg gatcccacct 180

cgattcagtg gcagcgggta tggaacagat tttaccctca caattaataa catagaatct 240

gaggatgctg catattactt ctgtcaacag catgatgaat ccccgtacac gttcggcgag 300

gggaccaagg tggaaatcaa a 321

<210> 5

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic construct

<400> 5

ggctccacct ctggatccgg caagcccgga tctggcgagg gatccaccaa gggc 54

<210> 6

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic construct

<400> 6

ggctccacct ctggatccgg caagcccgga tctggcgagg gatccaccaa gggc 54

<210> 7

<211> 84

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic construct

<400> 7

ggtggtggtg gtagcggctc cacctctgga tccggcaagc ccggatctgg cgagggatcc 60

accaagggcg gaggaggagg aagt 84

<210> 8

<211> 357

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic construct

<400> 8

gaagtgaaac tagtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctatgcca tgtcttgggt tcgccagatt 120

ccagagaaga ggctggagtg ggtcgcatcc attagtcgtg gtggtaccac ctactatcca 180

gacagtgtga agggccgatt caccatctcc agagataatg tcaggaacat cctgtacctg 240

caaatgagca gtctgaggtc tgaggacacg gccatgtatt actgtggaag atatgattac 300

gacgggtact atgcaatgga ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcctca 357

<210> 9

<211> 357

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic construct

<400> 9

gaagtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaggatc 60

tcctgtaagg gttctggatt cactttcagt agctatgcca tgtcttggat caggcagtcc 120

ccatcgagag gccttgagtg gctgggttcc attagtcgtg gtggtaccac ctactatcca 180

gacagtgtga agggcagatt caccatctcc agagacaacg ccaagaactc actgtatctg 240

caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtggaag atatgattac 300

gacgggtact atgcaatgga ctactggggc cagggaacgc tggtcaccgt cagctca 357

<210> 10

<211> 348

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic construct

<400> 10

caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60

acctgcactg tctctggtta tgcattcact gcctacaaca tacactgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggttct tttgatcctt acgatggtgg tagtagttac 180

aaccagaagt tcaaggacag actcaccatc tccaaggaca cctccaaaaa ccaggtggtc 240

cttacaatga ccaacatgga ccctgtggac acagccacgt attactgtgc aagagggtgg 300

tactactttg actactgggg ccacggaacc ctggtcaccg tctcctca 348

<210> 11

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic construct

<400> 11

gtcgacgagt ccaaatatgg tcccccatgc ccaccatgcc ca 42

<210> 12

<211> 399

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic construct

<400> 12

ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaaggcctcc cgtcctccat cgagaaaacc 60

atctccaaag ccaaagggca gccccgagag ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccag 120

gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctaccccagc 180

gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 240

cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca ggctaaccgt ggacaagagc 300

aggtggcagg aggggaatgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 360

tacacacaga agagcctctc cctgtcccta ggtaaaatg 399

<210> 13

<211> 654

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic construct

<400> 13

gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact 60

ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac 120

cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 180

ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 240

caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc 300

tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc 360

ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 420

ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 480

tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaggcta 540

accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag 600

gctctgcaca accactacac acagaagagc ctctccctgt ccctaggtaa aatg 654

<210> 14

<211> 204

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic construct

<400> 14

ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60

gcctttatta ttttctgggt gaggagtaag aggagcaggg gcggacacag tgactacatg 120

aacatgactc cccgccgccc tgggcccacc cgcaagcatt accagcccta tgccccacca 180

cgcgacttcg cagcctatcg ctcc 204

<210> 15

<211> 126

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic construct

<400> 15

aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120

gaactg 126

<210> 16

<211> 339

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic construct

<400> 16

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgctga 339

<210> 17

<211> 7489

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic construct

<400> 17

gtccgaaatc aacctctgga ttacaaaatt tgtgaaagat tgactggtat tcttaactat 60

gttgctcctt ttacgctatg tggatacgct gctttaatgc ctttgtatca tgctattgct 120

tcccgtatgg ctttcatttt ctcctccttg tataaatcct ggttgctgtc tctttatgag 180

gagttgtggc ccgttgtcag gcaacgtggc gtggtgtgca ctgtgtttgc tgacgcaacc 240

cccactggtt ggggcattgc caccacctgt cagctccttt ccgggacttt cgctttcccc 300

ctccctattg ccacggcgga actcatcgcc gcctgccttg cccgctgctg gacaggggct 360

cggctgttgg gcactgacaa ttccgtggtg ttgtcgggga agctgacgtc ctttccatgg 420

ctgctcgcct gtgttgccac ctggattctg cgcgggacgt ccttctgcta cgtcccttcg 480

gccctcaatc cagcggacct tccttcccgc ggcctgctgc cggctctgcg gcctcttccg 540

cgtcttcgcc ttcgccctca gacgagtcgg atctcccttt gggccgcctc cccgcctgga 600

attcgagctc ggtaccttta agaccaatga cttacaaggc agctgtagat cttagccact 660

ttttaaaaga aaagggggga ctggaagggc taattcactc ccaacgaaga caagatctgc 720

tttttgcttg tactgggtct ctctggttag accagatctg agcctgggag ctctctggct 780

aactagggaa cccactgctt aagcctcaat aaagcttgcc ttgagtgctt caagtagtgt 840

gtgcccgtct gttgtgtgac tctggtaact agagatccct cagacccttt tagtcagtgt 900

ggaaaatctc tagcagtagt agttcatgtc atcttattat tcagtattta taacttgcaa 960

agaaatgaat atcagagagt gagaggaact tgtttattgc agcttataat ggttacaaat 1020

aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg 1080

gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatc atgtctggct ctagctatcc cgcccctaac 1140

tccgcccatc ccgcccctaa ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc atggctgact 1200

aatttttttt atttatgcag aggccgaggc cgcctcggcc tctgagctat tccagaagta 1260

gtgaggaggc ttttttggag gcctagggac gtacccaatt cgccctatag tgagtcgtat 1320

tacgcgcgct cactggccgt cgttttacaa cgtcgtgact gggaaaaccc tggcgttacc 1380

caacttaatc gccttgcagc acatccccct ttcgccagct ggcgtaatag cgaagaggcc 1440

cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg gcgaatggga cgcgccctgt 1500

agcggcgcat taagcgcggc gggtgtggtg gttacgcgca gcgtgaccgc tacacttgcc 1560

agcgccctag cgcccgctcc tttcgctttc ttcccttcct ttctcgccac gttcgccggc 1620

tttccccgtc aagctctaaa tcgggggctc cctttagggt tccgatttag tgctttacgg 1680

cacctcgacc ccaaaaaact tgattagggt gatggttcac gtagtgggcc atcgccctga 1740

tagacggttt ttcgcccttt gacgttggag tccacgttct ttaatagtgg actcttgttc 1800

caaactggaa caacactcaa ccctatctcg gtctattctt ttgatttata agggattttg 1860

ccgatttcgg cctattggtt aaaaaatgag ctgatttaac aaaaatttaa cgcgaatttt 1920

aacaaaatat taacgcttac aatttaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc 1980

ctatttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct 2040

gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg 2100

cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg 2160

tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc 2220

tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca 2280

cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac 2340

tcggtcgccg catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa 2400

agcatcttac ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg 2460

ataacactgc ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt 2520

ttttgcacaa catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg 2580

aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc 2640

gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta atagactgga 2700

tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta 2760

ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc 2820

cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg 2880

atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt 2940

cagaccaagt ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa 3000

ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt 3060

cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt 3120

ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt 3180

tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga 3240

taccaaatac tgttcttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag 3300

caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata 3360

agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg 3420

gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga 3480

gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca 3540

ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa 3600

acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt 3660

tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac 3720

ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt 3780

ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga 3840

ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cccaatacgc aaaccgcctc 3900

tccccgcgcg ttggccgatt cattaatgca gctggcacga caggtttccc gactggaaag 3960

cgggcagtga gcgcaacgca attaatgtga gttagctcac tcattaggca ccccaggctt 4020

tacactttat gcttccggct cgtatgttgt gtggaattgt gagcggataa caatttcaca 4080

caggaaacag ctatgaccat gattacgcca agcgcgcaat taaccctcac taaagggaac 4140

aaaagctgga gctgcaagct taatgtagtc ttatgcaata ctcttgtagt cttgcaacat 4200

ggtaacgatg agttagcaac atgccttaca aggagagaaa aagcaccgtg catgccgatt 4260

ggtggaagta aggtggtacg atcgtgcctt attaggaagg caacagacgg gtctgacatg 4320

gattggacga accactgaat tgccgcattg cagagatatt gtatttaagt gcctagctcg 4380

atacataaac gggtctctct ggttagacca gatctgagcc tgggagctct ctggctaact 4440

agggaaccca ctgcttaagc ctcaataaag cttgccttga gtgcttcaag tagtgtgtgc 4500

ccgtctgttg tgtgactctg gtaactagag atccctcaga cccttttagt cagtgtggaa 4560

aatctctagc agtggcgccc gaacagggac ttgaaagcga aagggaaacc agaggagctc 4620

tctcgacgca ggactcggct tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg gcggcgactg 4680

gtgagtacgc caaaaatttt gactagcgga ggctagaagg agagagatgg gtgcgagagc 4740

gtcagtatta agcgggggag aattagatcg cgatgggaaa aaattcggtt aaggccaggg 4800

ggaaagaaaa aatataaatt aaaacatata gtatgggcaa gcagggagct agaacgattc 4860

gcagttaatc ctggcctgtt agaaacatca gaaggctgta gacaaatact gggacagcta 4920

caaccatccc ttcagacagg atcagaagaa cttagatcat tatataatac agtagcaacc 4980

ctctattgtg tgcatcaaag gatagagata aaagacacca aggaagcttt agacaagata 5040

gaggaagagc aaaacaaaag taagaccacc gcacagcaag cggccgctga tcttcagacc 5100

tggaggagga gatatgaggg acaattggag aagtgaatta tataaatata aagtagtaaa 5160

aattgaacca ttaggagtag cacccaccaa ggcaaagaga agagtggtgc agagagaaaa 5220

aagagcagtg ggaataggag ctttgttcct tgggttcttg ggagcagcag gaagcactat 5280

gggcgcagcg tcaatgacgc tgacggtaca ggccagacaa ttattgtctg gtatagtgca 5340

gcagcagaac aatttgctga gggctattga ggcgcaacag catctgttgc aactcacagt 5400

ctggggcatc aagcagctcc aggcaagaat cctggctgtg gaaagatacc taaaggatca 5460

acagctcctg gggatttggg gttgctctgg aaaactcatt tgcaccactg ctgtgccttg 5520

gaatgctagt tggagtaata aatctctgga acagatttgg aatcacacga cctggatgga 5580

gtgggacaga gaaattaaca attacacaag cttaatacac tccttaattg aagaatcgca 5640

aaaccagcaa gaaaagaatg aacaagaatt attggaatta gataaatggg caagtttgtg 5700

gaattggttt aacataacaa attggctgtg gtatataaaa ttattcataa tgatagtagg 5760

aggcttggta ggtttaagaa tagtttttgc tgtactttct atagtgaata gagttaggca 5820

gggatattca ccattatcgt ttcagaccca cctcccaacc ccgaggggac ccgacaggcc 5880

cgaaggaata gaagaagaag gtggagagag agacagagac agatccattc gattagtgaa 5940

cggatctcga cggtatcggt taacttttaa aagaaaaggg gggattgggg ggtacagtgc 6000

aggggaaaga atagtagaca taatagcaac agacatacaa actaaagaat tacaaaaaca 6060

aattacaaaa ttcaaaattt tatcgatgcc tccccgtcac cacccccccc aacccgcccc 6120

gaccggagct gagagtaatt catacaaaag gactcgcccc tgccttgggg aatcccaggg 6180

accgtcgtta aactcccact aacgtagaac ccagagatcg ctgcgttccc gccccctcac 6240

ccgcccgctc tcgtcatcac tgaggtggag aagagcatgc gtgaggctcc ggtgcccgtc 6300

agtgggcaga gcgcacatcg cccacagtcc ccgagaagtt ggggggaggg gtcggcaatt 6360

gaaccggtgc ctagagaagg tggcgcgggg taaactggga aagtgatgtc gtgtactggc 6420

tccgcctttt tcccgagggt gggggagaac cgtatataag tgcagtagtc gccgtgaacg 6480

ttctttttcg caacgggttt gccgccagaa cacaggtaag tgccgtgtgt ggttcccgcg 6540

ggcctggcct ctttacgggt tatggccctt gcgtgccttg aattacttcc acgcccctgg 6600

ctgcagtacg tgattcttga tcccgagctt cgggttggaa gtgggtggga gagttcgagg 6660

ccttgcgctt aaggagcccc ttcgcctcgt gcttgagttg aggcctggcc tgggcgctgg 6720

ggccgccgcg tgcgaatctg gtggcacctt cgcgcctgtc tcgctgcttt cgataagtct 6780

ctagccattt aaaatttttg atgatatcct gcgacgcttt ttttctggca agatagtctt 6840

gtaaatgcgg gccaagatct gcacactggt atttcggttt ttggggccgc gggcggcgac 6900

ggggcccgtg cgtcccagcg cacatgttcg gcgaggcggg gcctgcgagc gcggccaccg 6960

agaatcggac gggggtagtc tcaagctggc cggcctgctc tggtgcctgg cctcgcgccg 7020

ccgtgtatcg ccccgccctg ggcggcaagg ctggcccggt cggcaccagt tgcgtgagcg 7080

gaaagatggc cgcttcccgg ccctgctgca gggagctcaa aatggaggac gcggcgctcg 7140

ggagagcggg cgggtgagtc acccacacaa aggaaaaggg cctttccgtc ctcagccgtc 7200

gcttcatgtg actccacgga gtaccgggcg ccgtccaggc acctcgatta gttctcgagc 7260

ttttggagta cgtcgtcttt aggttggggg gaggggtttt atgcgatgga gtttccccac 7320

actgagtggg tggagactga agttaggcca gcttggcact tgatgtaatt ctccttggaa 7380

tttgcccttt ttgagtttgg atcttggttc attctcaagc ctcagacagt ggttcaaagt 7440

ttttttcttc catttcaggt gtcgtgaaaa ctacccctct agagccacc 7489

<210> 18

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic construct

<400> 18

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser

<210> 19

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic construct

<400> 19

Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Pro Asp Ile Asn Ser Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Gly Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Tyr

65 70 75 80

Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Met Lys

100 105

<210> 20

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic construct

<400> 20

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Pro Asp Ile Asn Ser Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Arg Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala

65 70 75 80

Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 21

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic construct

<400> 21

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Pro Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Asn Ile Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Ala Ala Tyr Tyr Phe Cys Gln Gln His Asp Glu Ser Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Glu Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 22

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic construct

<400> 22

Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr

1 5 10 15

Lys Gly

<210> 23

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic construct

<400> 23

Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr

1 5 10 15

Lys Gly

<210> 24

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic construct

<400> 24

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gly Gly Gly Gly Ser

20 25

<210> 25

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic construct

<400> 25

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Glu Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ile Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Arg Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Val Arg Asn Ile Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Gly

85 90 95

Arg Tyr Asp Tyr Asp Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 26

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic construct

<400> 26

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Ser Ile Ser Arg Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly

85 90 95

Arg Tyr Asp Tyr Asp Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

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<211> 116

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic construct

<400> 27

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Ala Tyr

20 25 30

Asn Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ser Phe Asp Arg Tyr Asp Gly Gly Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val

65 70 75 80

Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Trp Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly His Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 28

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic construct

<400> 28

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10

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<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic construct

<400> 29

Val Asp Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10

<210> 30

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic construct

<400> 30

Val Asp Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10

<210> 31

<211> 218

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic construct

<400> 31

Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

85 90 95

Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

100 105 110

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met

115 120 125

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

130 135 140

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

145 150 155 160

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

165 170 175

Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val

180 185 190

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

195 200 205

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Met

210 215

<210> 32

<211> 68

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic construct

<400> 32

Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu

1 5 10 15

Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser

20 25 30

Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly

35 40 45

Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala

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Ala Tyr Arg Ser

65

<210> 33

<211> 42

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic construct

<400> 33

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 34

<211> 112

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 34

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 35

<211> 2148

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic construct

<400> 35

atgggatggt catgtatcat cctttttcta gtagcaactg caaccggtgt acattccgac 60

atcaagatga cccagtctcc atcttccatg tatgcatctc taggagagag agtcactatc 120

acttgcaagg cgagtccgga cattaatagc tatttaagct ggttccagca gaaaccaggg 180

aaatctccta agaccctgat ctatcgtgca aacagattgg ttgatggggt cccatcaagg 240

ttcagtggcg gtggatctgg gcaagattat tctctcacca tcaacagcct ggagtatgaa 300

gatatgggaa tttattattg tctacagtat gatgaatttc cgtacacgtt cggagggggg 360

accaagctgg aaatgaaagg ctccacctct ggatccggca agcccggatc tggcgaggga 420

tccaccaagg gcgaagtgaa actagtggag tctgggggag gcttagtgaa gcctggaggg 480

tccctgaaac tctcctgtgc agcctctgga ttcactttca gtagctatgc catgtcttgg 540

gttcgccaga ttccagagaa gaggctggag tgggtcgcat ccattagtcg tggtggtacc 600

acctactatc cagacagtgt gaagggccga ttcaccatct ccagagataa tgtcaggaac 660

atcctgtacc tgcaaatgag cagtctgagg tctgaggaca cggccatgta ttactgtgga 720

agatatgatt acgacgggta ctatgcaatg gactactggg gtcaaggaac ctcagtcacc 780

gtctcctcag agtccaaata tggtccccca tgcccaccat gcccagcacc tgagttcctg 840

gggggaccat cagtcttcct gttcccccca aaacccaagg acactctcat gatctcccgg 900

acccctgagg tcacgtgcgt ggtggtggac gtgagccagg aagaccccga ggtccagttc 960

aactggtacg tggatggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 1020

ttcaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaac 1080

ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaaggcctcc cgtcctccat cgagaaaacc 1140

atctccaaag ccaaagggca gccccgagag ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccag 1200

gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctaccccagc 1260

gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1320

cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca ggctaaccgt ggacaagagc 1380

aggtggcagg aggggaatgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1440

tacacacaga agagcctctc cctgtcccta ggtaaaatgt tttgggtgct ggtggtggtt 1500

ggtggagtcc tggcttgcta tagcttgcta gtaacagtgg cctttattat tttctgggtg 1560

aggagtaaga ggagcagggg cggacacagt gactacatga acatgactcc ccgccgccct 1620

gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 1680

tccaaacggg gcagaaagaa actcctgtat atattcaaac aaccatttat gagaccagta 1740

caaactactc aagaggaaga tggctgtagc tgccgatttc cagaagaaga agaaggagga 1800

tgtgaactga gagtgaagtt cagcaggagc gcagacgccc ccgcgtacca gcagggccag 1860

aaccagctct ataacgagct caatctagga cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag 1920

agacgtggcc gggaccctga gatgggggga aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc 1980

ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa 2040

ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat ggcctttacc agggtctcag tacagccacc 2100

aaggacacct acgacgccct tcacatgcag gccctgcccc ctcgctga 2148

<210> 36

<211> 2154

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic construct

<400> 36

atgggatggt catgtatcat cctttttcta gtagcaactg caaccggtgt acattccgac 60

atccagatga cccagtctcc atcctccctg tctgcatctg taggagacag agtcaccatc 120

acttgcaagg cgagtccgga cattaatagc tatttaagct ggtttcagca gaggccaggc 180

caatctccaa ggcgcctaat ttatcgtgca aacagattgg ttgatggggt cccagacagg 240

ttcagtggca gtgggtcagg cactgatttc acactgaaaa tcagcagggt ggaggctgag 300

gatgttggag tttattactg tctacagtat gatgaatttc cgtacacgtt cggccaaggg 360

accaaggtgg aaatcaaagg ctccacctct ggatccggca agcccggatc tggcgaggga 420

tccaccaagg gcgaagtgca gctggtgcag tctggagcag aggtgaaaaa gcccggggag 480

tctctgagga tctcctgtaa gggttctgga ttcactttca gtagctatgc catgtcttgg 540

atcaggcagt ccccatcgag aggccttgag tggctgggtt ccattagtcg tggtggtacc 600

acctactatc cagacagtgt gaagggcaga ttcaccatct ccagagacaa cgccaagaac 660

tcactgtatc tgcaaatgaa cagcctgaga gccgaggaca cggctgtgta ttactgtgga 720

agatatgatt acgacgggta ctatgcaatg gactactggg gccagggaac gctggtcacc 780

gtcagctcag tcgacgagtc caaatatggt cccccatgcc caccatgccc agcacctgag 840

ttcctggggg gaccatcagt cttcctgttc cccccaaaac ccaaggacac tctcatgatc 900

tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg gtggacgtga gccaggaaga ccccgaggtc 960

cagttcaact ggtacgtgga tggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag 1020

gagcagttca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg 1080

ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag gcctcccgtc ctccatcgag 1140

aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagagccac aggtgtacac cctgccccca 1200

tcccaggagg agatgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctac 1260

cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc 1320

acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaggct aaccgtggac 1380

aagagcaggt ggcaggaggg gaatgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac 1440

aaccactaca cacagaagag cctctccctg tccctaggta aaatgttttg ggtgctggtg 1500

gtggttggtg gagtcctggc ttgctatagc ttgctagtaa cagtggcctt tattattttc 1560

tgggtgagga gtaagaggag caggggcgga cacagtgact acatgaacat gactccccgc 1620

cgccctgggc ccacccgcaa gcattaccag ccctatgccc caccacgcga cttcgcagcc 1680

tatcgctcca aacggggcag aaagaaactc ctgtatatat tcaaacaacc atttatgaga 1740

ccagtacaaa ctactcaaga ggaagatggc tgtagctgcc gatttccaga agaagaagaa 1800

ggaggatgtg aactgagagt gaagttcagc aggagcgcag acgcccccgc gtaccagcag 1860

ggccagaacc agctctataa cgagctcaat ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg 1920

gacaagagac gtggccggga ccctgagatg gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag 1980

gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat aagatggcgg aggcctacag tgagattggg 2040

atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca 2100

gccaccaagg acacctacga cgcccttcac atgcaggccc tgccccctcg ctga 2154

<210> 37

<211> 2175

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic construct

<400> 37

atgggatggt catgtatcat cctttttcta gtagcaactg caaccggtgt acattccgat 60

attgtgatga cccagactcc actctccctg cccgtcaccc ctggagagcc ggcctccatc 120

tcctgcaggg caagtaagag cattagcaaa tatttagcct ggtaccagca gaaacctggc 180

caggctccca ggctcctcat ctattctgga tccactttgc aatctgggat cccacctcga 240

ttcagtggca gcgggtatgg aacagatttt accctcacaa ttaataacat agaatctgag 300

gatgctgcat attacttctg tcaacagcat gatgaatccc cgtacacgtt cggcgagggg 360

accaaggtgg aaatcaaagg tggtggtggt agcggctcca cctctggatc cggcaagccc 420

ggatctggcg agggatccac caagggcgga ggaggaggaa gtcaggtgca gctgcaggag 480

tcgggcccag gactggtgaa gccttcacag accctgtccc tcacctgcac tgtctctggt 540

tatgcattca ctgcctacaa catacactgg gtgcgacagg cccctggaca agggcttgag 600

tggatgggtt cttttgatcc ttacgatggt ggtagtagtt acaaccagaa gttcaaggac 660

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465 470 475 480

Glu Cys Ala Phe Gly Lys Ile Tyr Lys Gly His Leu Tyr Leu Pro Gly

485 490 495

Met Asp His Ala Gln Leu Val Ala Ile Lys Thr Leu Lys Asp Tyr Asn

500 505 510

Asn Pro Gln Gln Trp Met Glu Phe Gln Gln Glu Ala Ser Leu Met Ala

515 520 525

Glu Leu His His Pro Asn Ile Val Cys Leu Leu Gly Ala Val Thr Gln

530 535 540

Glu Gln Pro Val Cys Met Leu Phe Glu Tyr Ile Asn Gln Gly Asp Leu

545 550 555 560

His Glu Phe Leu Ile Met Arg Ser Pro His Ser Asp Val Gly Cys Ser

565 570 575

Ser Asp Glu Asp Gly Thr Val Lys Ser Ser Leu Asp His Gly Asp Phe

580 585 590

Leu His Ile Ala Ile Gln Ile Ala Ala Gly Met Glu Tyr Leu Ser Ser

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His Phe Phe Val His Lys Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile Leu Ile Gly

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Glu Gln Leu His Val Lys Ile Ser Asp Leu Gly Leu Ser Arg Glu Ile

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Tyr Ser Ala Asp Tyr Tyr Arg Val Gln Ser Lys Ser Leu Leu Pro Ile

645 650 655

Arg Trp Met Pro Pro Glu Ala Ile Met Tyr Gly Lys Phe Ser Ser Asp

660 665 670

Ser Asp Ile Trp Ser Phe Gly Val Val Leu Trp Glu Ile Phe Ser Phe

675 680 685

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Val Arg Lys Arg Gln Leu Leu Pro Cys Ser Glu Asp Cys Pro Pro Arg

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Met Tyr Ser Leu Met Thr Glu Cys Trp Asn Glu Ile Pro Ser Arg Arg

725 730 735

Pro Arg Phe Lys Asp Ile His Val Arg Leu Arg Ser Trp Glu Gly Leu

740 745 750

Ser Ser His Thr Ser Ser Thr Thr Pro Ser Gly Gly Asn Ala Thr Thr

755 760 765

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770 775 780

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Pro Pro Pro Lys Ser Arg Ser Pro Ser Ser Ala Ser Gly Ser Thr Ser

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Asn Ile Pro Leu Leu Pro His Met Ser Ile Pro Asn His Pro Gly Gly

885 890 895

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