阅读说明：本技术 Ebv brlf1及其功能性小肽在抑制免疫炎症中的应用 (Application of EBV BRLF1 and functional small peptide thereof in inhibiting immune inflammation ) 是由 况二胜 龙徐兵 李晓娟 于 2019-07-23 设计创作，主要内容包括：本发明公开了BRLF1在制备疱疹病毒5’ppp RNA及其下游干扰素相关免疫基因合成抑制剂中的应用。本发明中还公开了BRLF1功能性小肽在制备疱疹病毒5’ppp RNA及其下游干扰素相关免疫基因合成抑制剂中的应用,通过在小肽偶联穿透信号肽后,具有很好的穿透性,可以直接进入细胞内部,更好发挥抑制抑制疱疹病毒激活的免疫反应活性的作用。(The invention discloses application of BRLF1 in preparation of herpes virus 5' ppp RNA and a downstream interferon related immune gene synthesis inhibitor thereof. The invention also discloses application of the BRLF1 functional small peptide in preparation of herpes virus 5' ppp RNA and a downstream interferon related immune gene synthesis inhibitor thereof, and the small peptide has good penetrability after being coupled and penetrated through a signal peptide, can directly enter cells, and better plays a role in inhibiting the immune response activity activated by herpes virus.)

EBV BRLF1及其功能性小肽在抑制免疫炎症中的应用

技术领域

本发明涉及EBV BRLF1及其功能性小肽的应用，具体地，涉及EBV BRLF1及其功能性小肽在抑制免疫炎症中的应用。

背景技术

疱疹病毒(Herpesviruses)是一类中等大小的双股DNA病毒，有100种以上成员，其在自然界广泛分布，可感染两栖类(蛙)、禽类(鸡)、哺乳类(兔、马、牛、猪、猫)，也能感染灵长类(猴)和人类。根据其理化性质分α、β、γ三个亚科。α疱疹病毒(如单纯疱疹病毒、水痘-带状疱疹病毒)增殖速度快，引起细胞病变。β疱疹病毒(如巨细胞病毒)，生长周期长，感染细胞形成巨细胞。γ疱疹病毒(如EB病毒)，感染的靶细胞是淋巴样细胞，可引起淋巴增生。疱疹病毒感染的宿主范围广泛，可感染人类和其他脊椎动物。

EB病毒(Epstein-barr virus，EBV)是疱疹病毒家族中的一员，EBV可通过唾液传播，而近年来的一些研究显示这一病毒也能通过性行为传播。目前EBV感染全世界5岁以上人群中95％以上的个体，感染之后，EBV终生存在于携带者体内，呈潜伏感染状态，并可引发多种人类疾病，包括传染性单核细胞增多症(IM)、毛状白斑症、以及实质器官移植后多发的淋巴组织增生性疾病。此外，EBV是最早发现的能导致癌症的病毒，与多种恶性肿瘤相关，如Burkitt淋巴瘤、Hodgkin氏淋巴瘤、非Hodgkin氏淋巴瘤及一些上皮组织癌症(如鼻咽癌、某些形式的胃癌等)，广东省作为鼻咽癌的高发地带引发了人们对于EBV的高度关注。

EBV作为γ-疱疹病毒，生活周期都分为潜伏期和裂解期，细胞被感染后经过短暂的急性反应后迅速在免疫系统B淋巴细胞内进入潜伏期。在宿主细胞中，EBV的感染能够通过病毒5’ppp RNA的合成诱导宿主产生干扰素以及下游相关免疫基因；同时EBV的感染激活宿主的免疫系统，使相关功能的免疫细胞进入活化状态。HSV-1作为另一类人类疱疹病毒，主要进行裂解期感染复制，在感染细胞之后能够迅速的通过病毒5’ppp RNA的合成诱导宿主产生干扰素以及下游相关免疫基因。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供BRLF1在制备疱疹病毒5’ppp RNA及其下游干扰素相关免疫基因合成抑制剂中的应用。

本发明的另一个目的在于提供一种BRLF1功能性小肽在制备疱疹病毒5’ppp RNA及其下游干扰素相关免疫基因合成抑制剂中的应用。

本发明所采取的技术方案是：

BRLF1在制备疱疹病毒5’ppp RNA及其下游干扰素相关免疫基因合成抑制剂中的应用。

进一步地，疱疹病毒包括但不限于EB病毒(Epstein-barr virus，EBV)、1型单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus，HSV-1)。

BRLF1功能性小肽在制备疱疹病毒5’ppp RNA及其下游干扰素相关免疫基因合成抑制剂中的应用，BRLF1功能性小肽序列为：PELNEILDTFL(SEQ ID NO：1)或该序列的保守修饰肽；进一步地，保守修饰肽的个数为1个或2个。

进一步地，BRLF1功能性小肽的一端偶联有穿透信号肽；进一步地，穿透信号肽的序列为：GRKKRRQRRRPQ-G-KRKK(SEQ ID NO：2)。

进一步地，疱疹病毒包括但不限于EB病毒(Epstein-barr virus，EBV)、1型单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus，HSV-1)。

一种疱疹病毒5’ppp RNA及其下游干扰素相关免疫基因合成抑制剂，其活性成分包括BRLF1或BRLF1功能性小肽，BRLF1功能性小肽序列为：PELNEILDTFL或该序列的保守修饰肽，优选地，保守修饰肽的个数为1个或2个。

进一步地，BRLF1功能性小肽的一端偶联有穿透信号肽，优选地，穿透信号肽的序列为：GRKKRRQRRRPQ-G-KRKK。

进一步地，疱疹病毒包括但不限于EB病毒(Epstein-barr virus，EBV)、1型单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus，HSV-1)。

一种免疫炎症的抑制剂，其活性成分包括BRLF1或BRLF1功能性小肽，BRLF1功能性小肽序列为：PELNEILDTFL或该序列的保守修饰肽；免疫炎症活性是由人类或动物疱疹病毒激活的；优选地，疱疹病毒包括但不限于EB病毒(Epstein-barr virus，EBV)、1型单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus，HSV-1)。

进一步地，保守修饰肽的个数为1个或2个；进一步地，BRLF1功能性小肽的一端偶联有穿透信号肽，优选地，穿透信号肽的序列为：GRKKRRQRRRPQ-G-KRKK。

本发明的有益效果是：

本发明中提供了BRLF1在制备疱疹病毒5’ppp RNA及其下游干扰素相关免疫基因合成抑制剂中的应用。

本发明提供了BRLF1功能性小肽制备疱疹病毒5’ppp RNA及其下游干扰素相关免疫基因合成抑制剂中的应用。通过在小肽偶联穿透信号肽后，具有很好的穿透性，可以直接进入细胞内部，更好发挥抑制抑制疱疹病毒激活的免疫反应活性的作用。

附图说明

图1：co-IP检测BRLF1与RNA聚合酶III亚基的相互作用；

图2：Q-PCR检测BRLF1在HNE-1-ΔBRLF1细胞中对EBV病毒和宿主细胞5’ppp RNA合成的抑制作用；

图3：Q-PCR检测BRLF1在HNE-1-ΔBRLF1细胞中对EBV病毒和宿主细胞5’ppp RNA下游干扰素相关免疫基因合成的抑制作用；

图4：Q-PCR检测BRLF1在HSV-1感染的A549细胞中对HSV-1病毒和宿主细胞5’pppRNA合成的抑制作用；

图5：Q-PCR检测BRLF1在HSV-1感染的A549细胞中对HSV-1病毒和宿主细胞5’pppRNA下游干扰素相关免疫基因合成的抑制作用；

图6：流式细胞术检测BRLF1和BRLF1功能性小肽N572在PBMC细胞中对EBV感染诱导的免疫细胞活化的抑制作用。

具体实施方式

下面结合实验，进一步说明本发明的技术方案。

除非特别说明，本发明采用的试剂、设备和方法为本技术领域常规市购的试剂、设备和常规使用的方法。

本发明中BRLF1的蛋白序列如下所示：

MRPKKDGLEDFLRLTPEIKKQLGSLVSDYCNVLNKEFTAGSVEITLRSYKICKAFINEAKAHGREWGGLMATLNICNFWAILRNNRVRRRAENAGNDACSIACPIVMRYVLDHLIVVTDRFFIQAPSNRVMIPATIGTAMYKLLKHSRVRAYTYSKVLGVDRAAIMASGKQVVEHLNRMEKEGLLSSKFKAFCKWVFTYPVLEEMFQTMVSSKTGHLTDDVKDVRALIKTLPRASYSSHAGQRSYVSGVLPACLLSTKSKAVETPILVSGADRMDEELMGNDGGASHTEARYSESGQFHAFTDELESLPSPTMPLKPGAQSADCGDSSSSSSDSGNSDTEQSEREEARAEAPRLRAPKSRRTSRPNRGQTPCPSNAAEPEQPWIAAVHQESDERPIFPHPSKPTFLPPVKRKKGLRDSREGMFLPKPEAGSAISDVFEGREVCQPKRIRPFHPPGSPWANRPLPASLAPTPTGPVHEPVGSLTPAPVPQPLDPAPAVTPEASHLLEDPDEETSQAVKALREMADTVIPQKEEAAICGQMDLSHPPPRGHLDELTTTLESMTEDLNLDSPLTPELNEILDTFLNDECLLHAMHISTGLSIFDTSLF(SEQ ID NO：3)；

偶联穿透信号肽的BRLF1功能性小肽N572的蛋白序列如下所示：

GRKKRRQRRRPQ-G-KRKKPELNEILDTFL(SEQ ID NO：4)。

BRLF1与RNA聚合酶III亚基的相互作用

1)取生长良好的HEK-293T细胞，接种于100mm透明平底皿中，每皿细胞密度达到75％。使用的培养基是完全培养基：DMEM，5％胎牛血清以及1％双抗，培养条件是5％二氧化碳、37℃；

2)贴壁完全后使用磷酸钙转染RNA聚合酶III亚基POLR3F或POLR3G和BRLF1或BRLF1L578A(每种质粒10μg)；

3)转染8h后换液新鲜DMEM完全培养基；

4)换液36h后，取出培养皿，收集细胞进行co-IP实验。

结果如图1显示：EBV即早期蛋白BRLF1与RNA聚合酶III亚基POLR3F和POLR3G相互作用，而基于功能结构进行突变的BRLF1L578A则失去相互作用的功能。

BRLF1在HNE-1-ΔBRLF1细胞中对EBV病毒和宿主细胞5’ppp RNA及其下游干扰素相关免疫基因合成的抑制作用

1)取生长良好的HNE-1-ΔBRLF1细胞，接种于6孔透明平底板中，每孔细胞密度达到75％。使用的培养基是完全培养基：RPMI1640，10％胎牛血清以及1％双抗，培养条件是5％二氧化碳、37℃；

2)贴壁完全后使用Lipo2000转染BRLF1或BRLF1L578A或BZLF1；

3)6h后换液新鲜RPMI1640完全培养基；

4)培养36h后，收细胞，提取细胞内RNA并进行逆转录产生cDNA；

5)以cDNA为模板，进行Q-PCR实验检测细胞内EBV病毒和宿主细胞5’ppp RNA及其下游干扰素相关免疫基因的合成。

实验结果如图2和3所示：在HNE-1-ΔBRLF1细胞中，BRLF1对EBV病毒和宿主细胞5’ppp RNA及其下游干扰素相关免疫基因的合成有明显的抑制作用。

BRLF1在HSV-1感染的A549细胞中对HSV-1病毒和宿主细胞5’ppp RNA及其下游干扰素相关免疫基因合成的抑制作用

1)取生长良好的A549细胞，接种于6孔透明平底板中。使用的培养基是完全培养基：RPMI1640，10％胎牛血清以及1％双抗，培养条件是5％二氧化碳、37℃；

2)贴壁完全后使用Lipo2000转染BRLF1或BRLF1L578A；

3)6h后换液新鲜RPMI1640完全培养基；

4)加入HSV-1感染(MOI＝1)；

5)培养16h后，收细胞，提取细胞内RNA并进行逆转录产生cDNA；

6)以cDNA为模板，进行Q-PCR实验检测细胞内HSV-1病毒和宿主细胞5’ppp RNA及其下游干扰素相关免疫基因的合成。

实验结果如图4和5所示：在HSV-1感染的A549细胞中，BRLF1对HSV-1病毒和宿主细胞5’ppp RNA及其下游干扰素相关免疫基因的合成有明显的抑制作用。

流式细胞术检测BRLF1和BRLF1功能性小肽N572在PBMC细胞中对EBV感染诱导的免疫细胞活化的抑制作用

1)取生长良好的PBMC细胞，接种于6孔透明平底板中。使用的培养基是完全培养基：RPMI1640，10％胎牛血清以及1％双抗，培养条件是5％二氧化碳、37℃；

2)使用EBV-WT病毒或者EBV-ΔBRLF1病毒感染PBMC细胞；

3)感染6h后，换液新鲜的完全RPMI1640培养基；

4)在EBV-ΔBRLF1感染的PBMC中加入功能性小肽N572；

5)24h后，300g 5min收集细胞，使用PE-CD3和APC-CD25抗体标记T细胞，或PE-CD56和APC-CD69标记NK细胞；

6)流式细胞术检测被EBV感染的PBMC细胞中活化的T细胞百分比和NK细胞百分比。

实验结果如图6显示：在PBMC细胞内，BRLF1和BRLF1功能性小肽N572对EBV感染诱导的免疫细胞活化有明显的抑制作用。

实验发现BRLF1转染处理后的细胞内宿主和病毒的5’ppp RNA合成被抑制，其下游干扰素相关免疫基因的合成也明显下降；同时，BRLF1和N572处理了的EBV感染PBMC细胞中活化的T细胞和NK细胞的含量也明显下降。BRLF1和N572的这些免疫抑制作用为进一步的抗免疫活化药物研发提供的强有力的理论基础和实践基础，具有重要的研发价值和开发意义。

SEQUENCE LISTING

<110> 中山大学

<120> EBV BRLF1及其功能性小肽在抑制免疫炎症中的应用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Pro Glu Leu Asn Glu Ile Leu Asp Thr Phe Leu

1 5 10

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 2

Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Gln Gly Lys Arg Lys

1 5 10 15

Lys

<210> 3

<211> 605

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 3

Met Arg Pro Lys Lys Asp Gly Leu Glu Asp Phe Leu Arg Leu Thr Pro

1 5 10 15

Glu Ile Lys Lys Gln Leu Gly Ser Leu Val Ser Asp Tyr Cys Asn Val

20 25 30

Leu Asn Lys Glu Phe Thr Ala Gly Ser Val Glu Ile Thr Leu Arg Ser

35 40 45

Tyr Lys Ile Cys Lys Ala Phe Ile Asn Glu Ala Lys Ala His Gly Arg

50 55 60

Glu Trp Gly Gly Leu Met Ala Thr Leu Asn Ile Cys Asn Phe Trp Ala

65 70 75 80

Ile Leu Arg Asn Asn Arg Val Arg Arg Arg Ala Glu Asn Ala Gly Asn

85 90 95

Asp Ala Cys Ser Ile Ala Cys Pro Ile Val Met Arg Tyr Val Leu Asp

100 105 110

His Leu Ile Val Val Thr Asp Arg Phe Phe Ile Gln Ala Pro Ser Asn

115 120 125

Arg Val Met Ile Pro Ala Thr Ile Gly Thr Ala Met Tyr Lys Leu Leu

130 135 140

Lys His Ser Arg Val Arg Ala Tyr Thr Tyr Ser Lys Val Leu Gly Val

145 150 155 160

Asp Arg Ala Ala Ile Met Ala Ser Gly Lys Gln Val Val Glu His Leu

165 170 175

Asn Arg Met Glu Lys Glu Gly Leu Leu Ser Ser Lys Phe Lys Ala Phe

180 185 190

Cys Lys Trp Val Phe Thr Tyr Pro Val Leu Glu Glu Met Phe Gln Thr

195 200 205

Met Val Ser Ser Lys Thr Gly His Leu Thr Asp Asp Val Lys Asp Val

210 215 220

Arg Ala Leu Ile Lys Thr Leu Pro Arg Ala Ser Tyr Ser Ser His Ala

225 230 235 240

Gly Gln Arg Ser Tyr Val Ser Gly Val Leu Pro Ala Cys Leu Leu Ser

245 250 255

Thr Lys Ser Lys Ala Val Glu Thr Pro Ile Leu Val Ser Gly Ala Asp

260 265 270

Arg Met Asp Glu Glu Leu Met Gly Asn Asp Gly Gly Ala Ser His Thr

275 280 285

Glu Ala Arg Tyr Ser Glu Ser Gly Gln Phe His Ala Phe Thr Asp Glu

290 295 300

Leu Glu Ser Leu Pro Ser Pro Thr Met Pro Leu Lys Pro Gly Ala Gln

305 310 315 320

Ser Ala Asp Cys Gly Asp Ser Ser Ser Ser Ser Ser Asp Ser Gly Asn

325 330 335

Ser Asp Thr Glu Gln Ser Glu Arg Glu Glu Ala Arg Ala Glu Ala Pro

340 345 350

Arg Leu Arg Ala Pro Lys Ser Arg Arg Thr Ser Arg Pro Asn Arg Gly

355 360 365

Gln Thr Pro Cys Pro Ser Asn Ala Ala Glu Pro Glu Gln Pro Trp Ile

370 375 380

Ala Ala Val His Gln Glu Ser Asp Glu Arg Pro Ile Phe Pro His Pro

385 390 395 400

Ser Lys Pro Thr Phe Leu Pro Pro Val Lys Arg Lys Lys Gly Leu Arg

405 410 415

Asp Ser Arg Glu Gly Met Phe Leu Pro Lys Pro Glu Ala Gly Ser Ala

420 425 430

Ile Ser Asp Val Phe Glu Gly Arg Glu Val Cys Gln Pro Lys Arg Ile

435 440 445

Arg Pro Phe His Pro Pro Gly Ser Pro Trp Ala Asn Arg Pro Leu Pro

450 455 460

Ala Ser Leu Ala Pro Thr Pro Thr Gly Pro Val His Glu Pro Val Gly

465 470 475 480

Ser Leu Thr Pro Ala Pro Val Pro Gln Pro Leu Asp Pro Ala Pro Ala

485 490 495

Val Thr Pro Glu Ala Ser His Leu Leu Glu Asp Pro Asp Glu Glu Thr

500 505 510

Ser Gln Ala Val Lys Ala Leu Arg Glu Met Ala Asp Thr Val Ile Pro

515 520 525

Gln Lys Glu Glu Ala Ala Ile Cys Gly Gln Met Asp Leu Ser His Pro

530 535 540

Pro Pro Arg Gly His Leu Asp Glu Leu Thr Thr Thr Leu Glu Ser Met

545 550 555 560

Thr Glu Asp Leu Asn Leu Asp Ser Pro Leu Thr Pro Glu Leu Asn Glu

565 570 575

Ile Leu Asp Thr Phe Leu Asn Asp Glu Cys Leu Leu His Ala Met His

580 585 590

Ile Ser Thr Gly Leu Ser Ile Phe Asp Thr Ser Leu Phe

595 600 605

<210> 4

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 4

Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Gln Gly Lys Arg Lys

1 5 10 15

Lys Pro Glu Leu Asn Glu Ile Leu Asp Thr Phe Leu

20 25