一种液体发酵冬虫夏草菌产分生孢子的方法
阅读说明：本技术 一种液体发酵冬虫夏草菌产分生孢子的方法 (Method for producing conidia by liquid fermentation of cordyceps sinensis ) 是由 邢康康 陈仕江 贺元川 张德利 贺宗毅 游华建 罗昌树 鲁增辉 涂永勤 石萍 谭 于 2021-07-22 设计创作，主要内容包括：本发明申请属于微生物发酵技术领域,具体公开了一种液体发酵冬虫夏草菌产分生孢子的方法,包括冬虫夏草菌活化,液体种子培养和分生孢子培养的步骤,使用一种液体种子培养基和一种液体分生孢子培养基；发酵浓度高,产生的分生孢子最高可达3.5×10～(6)cfu/mL,且原材料廉价易得,成本低,产出的分生孢子培养周期短,解决了液体发酵冬虫夏草菌时分生孢子浓度低的问题。(The invention belongs to the technical field of microbial fermentation, and particularly discloses a method for producing conidia by liquid fermentation of cordyceps sinensis, which comprises the steps of cordyceps sinensis activation, liquid seed culture and conidia culture, wherein a liquid seed culture medium and a liquid conidia culture medium are used; the fermentation concentration is high, and the produced conidia can reach 3.5 multiplied by 10 at most 6 cfu/mL, cheap and easily-obtained raw materials, low cost and short culture period of produced conidia, and solves the problem of low concentration of the conidia during liquid fermentation of the cordyceps sinensis.)
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体公开了一种液体发酵冬虫夏草菌产分生孢子的方法。
背景技术
冬虫夏草是我国青藏高原特有的名贵中药材，有镇静、止血、降压、改善心肌缺血、抗血小板凝集、抗衰老、抗肿瘤及双向调节人体免疫的功能。但是，天然冬虫夏草有其严格的寄生性及特殊的生长环境，产量低，价格昂贵。天然冬虫夏草的生长条件极其特殊，加之全球气候变化、生态环境破坏，以及掠夺式的采挖，导致冬虫夏草的野生资源日趋减少，药源紧缺，价格昂贵。为改变这一局面，可用冬虫夏草深层发酵的方法生产菌粉。因发酵菌粉在化学成份、药理作用及临床效果上与天然冬虫夏草基本一致，因此可作为代用品。但目前的冬虫夏草菌粉生产多用蚕蛹粉培养基进行培养，产量低且生产成本高，难以获得理想效果。
冬虫夏草人工繁育技术主要通过收集冬虫夏草菌分生孢子，人工接种以提高蝙蝠蛾幼虫感菌率，再将感菌幼虫在低海拔室内模拟高原环境条件培育或在高海拔冬虫夏草适生地培育，长出子座形成冬虫夏草。因此，冬虫夏草菌分生孢子和人工接种技术对于规模化生产冬虫夏草具有非常重要的意义。冬虫夏草菌分生孢子存在的主要困难是分生孢子产生周期长、分生孢子产量低等。和其它常见真菌相比，冬虫夏草菌的产孢量低。如何改良培养条件获得较大浓度的分生孢子，是冬虫夏草顺利实现产业化亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种液体发酵冬虫夏草菌产分生孢子的方法，以解决冬虫夏草菌的液体发酵时分生孢子浓度低的问题。
为了达到上述目的，本发明的技术方案为：一种液体发酵冬虫夏草菌产分生孢子的方法，其特征在于，包括冬虫夏草菌活化，液体种子培养和分生孢子培养的步骤，其中所述液体种子培养步骤中使用一种液体种子培养基；所述分生孢子培养的步骤中使用一种液体分生孢子培养基。
本技术方案的工作原理在于：
提供了一种液体发酵冬虫夏草菌产分生孢子的方法，经过冬虫夏草菌菌种活化、液体种子培养、分生孢子培养的步骤，在液体环境下发酵冬虫夏草菌产分生孢子，使用到一种液体种子培养基和一种液体分生孢子培养基。
本技术方案的有益效果在于：
采用本发明提供的液体发酵冬虫夏草菌产分生孢子的方法，可以产生大量的分生孢子，发酵浓度高，且原材料廉价易得，成本低，可进一步利用该方法进行放大生产。产出的分生孢子具有培养周期短、侵染力稳定等显著优点，便于菌种制剂制备。
进一步，冬虫夏草菌菌种活化步骤为：将冬虫夏草菌接种在马铃薯斜面培养基上，在黑暗环境下培养5d，培养温度为12℃。
进一步，液体种子培养步骤为：将培养好的斜面菌种切取蚕豆大小，接于液体种子培养基中，将100mL接种液装入250mL三角瓶，置于恒温摇床培养25-40d，摇床转速为150r/min，培养温度为12℃。
进一步，液体种子培养基配方为：马铃薯浸粉25-35g，葡萄糖5-15g，麦芽糖35-45g，蛋白胨5-15g，酵母粉5-15g，硫酸镁1-2g，磷酸二氢钾2-4g，柠檬酸三胺0.5-1g，水1000mL。
进一步，分生孢子培养步骤为：将培养好的冬虫夏草菌液体种子按10％的接种量接种至液体分生孢子培养基，接入液体分生孢子培养基，将100mL接种液装入250mL三角瓶，置于恒温摇床培养25-40d，摇床转速为150r/min，培养温度为12℃。
进一步，液体分生孢子培养基配方为：马铃薯浸粉25-35g，葡萄糖5-15g，麦芽糖35-45g，蛋白胨5-15g，酵母粉5-15g，硫酸镁1-2g，磷酸二氢钾2-4g，柠檬酸三胺0.5-1g，环磷酸腺苷10-20mmol，水1000mL。
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步详细说明：
一种液体发酵冬虫夏草菌产分生孢子的方法，包括冬虫夏草菌活化，液体种子培养和分生孢子培养的步骤，液体种子培养步骤使用一种液体种子培养基；所述分生孢子培养步骤使用一种液体分生孢子培养基。
具体实施过程如下：
实施例1液体发酵冬虫夏草菌产分生孢子步骤如下：
1冬虫夏草菌菌种活化：
将冬虫夏草菌接种在马铃薯斜面培养基上，在黑暗环境下培养5d，培养温度为12℃。
2液体种子培养：
将培养好的斜面菌种切取蚕豆大小，接于液体种子培养基中，将100mL接种液装入250mL三角瓶，置于恒温摇床培养30d，摇床转速为150r/min，培养温度为12℃。液体种子培养基的制备配方为：马铃薯浸粉30g，葡萄糖10g，麦芽糖40g，蛋白胨10g，酵母粉10g，硫酸镁1.5g，磷酸二氢钾3g，柠檬酸三胺0.5g，水1000mL。
3分生孢子培养
将培养好的冬虫夏草菌液体种子按10％的接种量接种至液体分生孢子培养基，将100mL接种液装入250mL三角瓶，置于恒温摇床培养30d，摇床转速为150r/min，培养温度为12℃。液体分生孢子培养基制备配方为：马铃薯浸粉30g，葡萄糖10g，麦芽糖40g，蛋白胨10g，酵母粉10g，硫酸镁1.5g，磷酸二氢钾3g，柠檬酸三胺0.5g，环磷酸腺苷15mmol，水1000mL。
4后处理
将发酵结束后的发酵液采用无菌纱布过滤，去除冬虫夏草菌菌丝体，滤液采用平板梯度稀释涂布法检测孢子量，检测培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基，最终孢子量为3.5×106cfu/mL。
实施例2液体发酵冬虫夏草菌产分生孢子步骤如下：
步骤1同实施例1。
2液体种子培养：
将培养好的斜面菌种切取蚕豆大小，接于液体种子培养基中，将100mL接种液装入250mL三角瓶，置于恒温摇床培养30d，摇床转速为150r/min，培养温度为12℃。液体种子培养基的制备配方为：马铃薯浸粉15g，葡萄糖5g，麦芽糖20g，蛋白胨5g，酵母粉5g，硫酸镁1g，磷酸二氢钾1.5g，柠檬酸三胺0.3g，水1000mL。
3分生孢子培养
将培养好的冬虫夏草菌液体种子按10％的接种量接种至液体分生孢子培养基，将100mL接种液装入250mL三角瓶，置于恒温摇床培养30d，摇床转速为150r/min，培养温度为12℃。液体分生孢子培养基制备配方为：马铃薯浸粉30g，葡萄糖10g，麦芽糖40g，蛋白胨10g，酵母粉10g，硫酸镁1.5g，磷酸二氢钾3g，柠檬酸三胺0.5g，环磷酸腺苷15mmol，水1000mL。
4后处理
将发酵结束后的发酵液采用无菌纱布过滤，去除冬虫夏草菌菌丝体，滤液采用平板梯度稀释涂布法检测孢子量，检测培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基，最终孢子量为2.8×106cfu/mL。
实施例3液体发酵冬虫夏草菌产分生孢子步骤如下：
步骤1同实施例1。
2液体种子培养：
将培养好的斜面菌种切取蚕豆大小，接于液体种子培养基中，将100mL接种液装入250mL三角瓶，置于恒温摇床培养30d，摇床转速为150r/min，培养温度为12℃。液体种子培养基的制备配方为：马铃薯浸粉30g，葡萄糖10g，麦芽糖40g，蛋白胨10g，酵母粉10g，硫酸镁1.5g，磷酸二氢钾3g，水1000mL。
3分生孢子培养
将培养好的冬虫夏草菌液体种子按10％的接种量接种至液体分生孢子培养基，将100mL接种液装入250mL三角瓶，置于恒温摇床培养30d，摇床转速为150r/min，培养温度为12℃。液体分生孢子培养基制备配方为：马铃薯浸粉30g，葡萄糖10g，麦芽糖40g，蛋白胨10g，酵母粉10g，硫酸镁1.5g，磷酸二氢钾3g，柠檬酸三胺0.5g，环磷酸腺苷15mmol，水1000mL。
4后处理
将发酵结束后的发酵液采用无菌纱布过滤，去除冬虫夏草菌菌丝体，滤液采用平板梯度稀释涂布法检测孢子量，检测培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基，最终孢子量为7.7×105cfu/mL。
实施例4液体发酵冬虫夏草菌产分生孢子步骤如下：
步骤1同实施例1。
2液体种子培养：
将培养好的斜面菌种切取蚕豆大小，接于液体种子培养基中，将100mL接种液装入250mL三角瓶，置于恒温摇床培养30d，摇床转速为150r/min，培养温度为12℃。液体种子培养基的制备配方为：马铃薯浸粉30g，葡萄糖10g，麦芽糖40g，蛋白胨10g，酵母粉10g，硫酸镁1.5g，磷酸二氢钾3g，柠檬酸三胺0.5g，水1000mL。
3分生孢子培养
将培养好的冬虫夏草菌液体种子按10％的接种量接种至液体分生孢子培养基，将100mL接种液装入250mL三角瓶，置于恒温摇床培养30d，摇床转速为150r/min，培养温度为12℃。液体分生孢子培养基制备配方为：马铃薯浸粉15g，葡萄糖5g，麦芽糖20g，蛋白胨5g，酵母粉5g，硫酸镁1g，磷酸二氢钾1.5g，柠檬酸三胺0.3g，环磷酸腺苷10mmol，水1000mL。
4后处理
将发酵结束后的发酵液采用无菌纱布过滤，去除冬虫夏草菌菌丝体，滤液采用平板梯度稀释涂布法检测孢子量，检测培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基，最终孢子量为1.8×106cfu/mL。
实施例5液体发酵冬虫夏草菌产分生孢子步骤如下：
步骤1同实施例1。
2液体种子培养：
将培养好的斜面菌种切取蚕豆大小，接于液体种子培养基中，将100mL接种液装入250mL三角瓶，置于恒温摇床培养30d，摇床转速为150r/min，培养温度为12℃。液体种子培养基的制备配方为：马铃薯浸粉30g，葡萄糖10g，麦芽糖40g，蛋白胨10g，酵母粉10g，硫酸镁1.5g，磷酸二氢钾3g，柠檬酸三胺0.5g，水1000mL。
3分生孢子培养
将培养好的冬虫夏草菌液体种子按10％的接种量接种至液体分生孢子培养基，将100mL接种液装入250mL三角瓶，置于恒温摇床培养30d，摇床转速为150r/min，培养温度为12℃。液体分生孢子培养基制备配方为：马铃薯浸粉30g，葡萄糖10g，麦芽糖40g，蛋白胨10g，酵母粉10g，硫酸镁1.5g，磷酸二氢钾3g，柠檬酸三胺0.5g，水1000mL。
4后处理
将发酵结束后的发酵液采用无菌纱布过滤，去除冬虫夏草菌菌丝体，滤液采用平板梯度稀释涂布法检测孢子量，检测培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基，最终孢子量为1.1×105cfu/mL。
实施例6液体发酵冬虫夏草菌产分生孢子步骤如下：
步骤1同实施例1。
2液体种子培养：
将培养好的斜面菌种切取蚕豆大小，接于液体种子培养基中，将100mL接种液装入250mL三角瓶，置于恒温摇床培养20d，摇床转速为150r/min，培养温度为12℃。液体种子培养基的制备配方为：马铃薯浸粉30g，葡萄糖10g，麦芽糖40g，蛋白胨10g，酵母粉10g，硫酸镁1.5g，磷酸二氢钾3g，柠檬酸三胺0.5g，水1000mL。
3分生孢子培养
将培养好的冬虫夏草菌液体种子按10％的接种量接种至液体分生孢子培养基，将100mL接种液装入250mL三角瓶，置于恒温摇床培养30d，摇床转速为150r/min，培养温度为12℃。液体分生孢子培养基制备配方为：马铃薯浸粉30g，葡萄糖10g，麦芽糖40g，蛋白胨10g，酵母粉10g，硫酸镁1.5g，磷酸二氢钾3g，柠檬酸三胺0.5g，环磷酸腺苷15mmol，水1000mL。
4后处理
将发酵结束后的发酵液采用无菌纱布过滤，去除冬虫夏草菌菌丝体，滤液采用平板梯度稀释涂布法检测孢子量，检测培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基，最终孢子量为3.1×106cfu/mL。
实施例7液体发酵冬虫夏草菌产分生孢子步骤如下：
步骤1同实施例1。
2液体种子培养：
将培养好的斜面菌种切取蚕豆大小，接于液体种子培养基中，将100mL接种液装入250mL三角瓶，置于恒温摇床培养30d，摇床转速为150r/min，培养温度为12℃。液体种子培养基的制备配方为：马铃薯浸粉30g，葡萄糖10g，麦芽糖40g，蛋白胨10g，酵母粉10g，硫酸镁1.5g，磷酸二氢钾3g，柠檬酸三胺0.5g，水1000mL。
3分生孢子培养
将培养好的冬虫夏草菌液体种子按10％的接种量接种至液体分生孢子培养基，将100mL接种液装入250mL三角瓶，置于恒温摇床培养20d，摇床转速为150r/min，培养温度为12℃。液体分生孢子培养基制备配方为：马铃薯浸粉30g，葡萄糖10g，麦芽糖40g，蛋白胨10g，酵母粉10g，硫酸镁1.5g，磷酸二氢钾3g，柠檬酸三胺0.5g，环磷酸腺苷15mmol，水1000mL。
4后处理
将发酵结束后的发酵液采用无菌纱布过滤，去除冬虫夏草菌菌丝体，滤液采用平板梯度稀释涂布法检测孢子量，检测培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基，最终孢子量为9.5×105cfu/mL。
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。