一种提高修正的人三原核受精卵体外培养囊胚发育率的方法
阅读说明：本技术 一种提高修正的人三原核受精卵体外培养囊胚发育率的方法 (Method for improving development rate of corrected human triprogenic fertilized egg in vitro culture blastocyst ) 是由 范勇 朱海瑛 于 2019-09-19 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种提高修正的人三原核受精卵体外培养囊胚发育率的方法,其特征在于,包括以下步骤：(1)提供修正的人三原核受精卵；(2)显微注射KDM4A mRNA到所述修正的人三原核受精卵胞质中；(3)体外培养经所述步骤(2)得到的修正的人三原核受精卵。本发明的方法操作简单,可显著提高修正的人三原核受精卵体外培养囊胚发育率。(The invention discloses a method for improving the development rate of a corrected blastocyst cultured in vitro of a human trinuclear fertilized egg, which is characterized by comprising the following steps of: (1) providing a modified human tri-pronuclear fertilized egg; (2) microinjecting KDM4A mRNA into the modified human tri-nuclear zygote cytoplasm; (3) culturing the corrected human tri-pronucleus fertilized egg obtained in the step (2) in vitro. The method is simple to operate, and can obviously improve the development rate of the corrected human trinuclear fertilized eggs in vitro culture blastocysts.)
技术领域
本发明涉及一种提高修正的人三原核受精卵体外培养囊胚发育率的方法。
背景技术
修正的人三原核受精卵(corrected human three-pronuclear zygote，ch3PN)是指去除三原核合子(three-pronuclear zygote，3PN)中一个雄原核使其恢复为二倍体的受精卵。3PN合子是临床上常见的异常受精类型(约10％左右)，因其染色体倍性发生紊乱导致早期胚胎发育阻滞/死亡、流产，故不能作为妊娠用的移植胚胎而常被临床上废弃。
组蛋白去甲基化酶KDM4家族可以通过去除组蛋白H3/H4上的赖氨酸残基调节基因的转录抑制或活化。Zhang Y研究团队发现在人的体细胞核移植胚胎中过表达组蛋白去甲基化酶KDM4A，可以显著降低ZGA时期的H3K9me3修饰，将体外囊胚率从4.2％提高至26.8％。Sun Q团队通过过表达KDM4D优化了猕猴的核移植体系，在国际上首次实现了非人灵长类动物的克隆。
虽然修正的人三原核受精卵在一定程度上解决了染色体非整倍性问题，但较低的囊胚发育率使其仍未被用于妊娠移植。
发明内容
基于此，本发明的目的是为了解决修正的人三原核受精卵体外培养囊胚发育率低的问题而提供了一种能够提高修正的人三原核受精卵体外培养囊胚发育率的方法。
为实现上述目的，本发明具体技术方案如下：
一种提高修正的人三原核受精卵体外培养囊胚发育率的方法，其包括以下步骤：
(2)提供修正的人三原核受精卵；
(2)显微注射KDM4A mRNA到所述修正的人三原核受精卵胞质中；
(3)体外培养经所述步骤(2)得到的修正的人三原核受精卵。
在其中一个实施例中，所述步骤(1)具体为：显微操作去除人三原核受精卵中远离第二极体且直径较大的原核形成修正的人三原核受精卵。
在其中一个实施例中，所述步骤(1)中，去除人三原核受精卵中原核的体外操作液为添加8～12μg/ml Cytochalasin的G-mops液。
在其中一个实施例中，所述步骤(1)中，去除人三原核受精卵中原核的体外操作液为添加10μg/ml Cytochalasin的G-mops液。
在其中一个实施例中，所述步骤(2)中，所述KDM4A mRNA的注射浓度为800～1200ng/μL。
在其中一个实施例中，所述步骤(2)中，所述KDM4A mRNA的注射浓度为1000ng/μL。
在其中一个实施例中，所述步骤(2)中，对于每个修正的人三原核受精卵，所述KDM4A mRNA的注射量为1～2pL。
在其中一个实施例中，所述体外培养为分段式体外培养。
在其中一个实施例中，所述分段式体外培养具体为：将经所述步骤(2)得到的修正的人三原核受精卵体外培养的前72h培养于G-1微滴培养液中，72h后培养于G-2微滴培养液中。
基于上述技术方案，本发明具有以下有益效果：
本发明的提高修正的人三原核受精卵体外培养囊胚发育率的方法操作简单，可显著提高修正的人三原核受精卵体外培养囊胚发育率，体外培养修正的人三原核受精卵，其囊胚发育率由7.88％可提高到22.47％。
附图说明
图1为人KDM4A mRNA载体示意图；
图2为修正的人三原核受精卵(ch3PN)显微操作体系图；
图3为修正的人三原核受精卵(ch3PN)发育过程图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例1
一种提高修正的人三原核受精卵体外培养囊胚发育率的方法，其包括以下步骤：
1.三原核受精卵(3PN)的收集
受精后16-18h，在恒温倒置显微镜下观察受精情况，正常受精标准：有两个原核、两个极体、规则的形态、完整的透明带。三原核受精标准：胞浆中可见三个原核、两个极体的受精卵。卵胞浆内有空泡的、透明带不完整的三原核受精卵不纳与该研究。
2.去除3PN受精卵多余原核
2.1去核操作液的准备
在G-mops液中加入10ug/ml Cytochalasin作为去除原核的体外操作液。
2.2去核微滴的准备
在直径3.5cm的培养皿中用去核操作液做7个20ul左右的微滴，覆盖矿物油。在显微操作皿中准备如下滴液：左侧3个5ul大小的10％PVP，右侧3条10ul左右条形去核操作液，覆盖矿物油。使用直径3.5cm的培养皿做7个20ul左右G-1、G-2微滴，覆盖矿物油。
2.3去核针的制备
使用Sutter微电极拉制仪拉针仪P-97，Sutter B100-75-10毛细玻璃管拉制显微去核针，程序为Heat 753、Pull 60、Vel 120、Time 200，断针仪煅制针尖，去核针直径为10-15um。
2.4显微去核操作
在显微操作仪上调试好固定针，去核针内加入2cm长度重油，连接到PIEZO显微操作系统，将重油推至针尖前端，将3PN受精卵放入培养皿中在37°培养箱放置10min后移入操作皿的操作液中，放置在显微操作仪的温台上，固定针和去核针在PVP微滴中润洗，移入操作液微滴中，选取远离第二极体且直径较大的原核，将去核针置于透明带边缘，脉冲穿透透明带，去核针进入卵膜，缓慢操作，吸出一个原核，剩余两个原核，将操作后的受精卵(为r2PN受精卵)放入G-1微滴中洗3次，放入G-1培养液中培养。
3.受精卵KDM 4A mRNA注射
3.1注射微滴的制备
在显微操作皿中准备如下滴液：左侧3个5ul大小的10％PVP，右侧3条10ul左右条形G-mops液，覆盖矿物油。
3.2显微注射针的制备
Sutter微电极拉制仪拉针仪P-97，Sutter BF100-78-10毛细玻璃管拉制显微去核针，程序为Heat756、Pull80、Ve120、Time200。
3.3KDM4A mRNA显微注射操作
以RNA-free water稀释组蛋白去甲基化酶KDM4A mRNA浓度为1000ng/μL，混合均匀后用12000g离心1min。将ch3PN受精卵在G-1微滴中恢复30min后转移到显微注射微滴中，进行RNA显微注射。将RNA注射到胞质中，每个胚胎注射约1-2pL。注射后用胚胎培养液G-1洗涤胚胎3遍，转移至G-1微滴中培养。human Kdm4A mRNA质粒示意图如图1所示，三原核受精卵去掉多余雄原核后注射KDM 4A mRNA/water的显微操作过程如图2所示。
4.胚胎培养
对ch3PN受精卵进行体外培养，ch3PN受精卵体外培养的前72h培养于G-1微滴培养液中，72h后培养于G-2微滴培养液中，受精后27-28h观察ch3PN受精卵的第一次卵裂，若***≥2细胞为早期卵裂胚胎，48h(D2)、72h(D3)、120h(D5)、144h(D6)胚胎及囊胚的发育情况。D3将胚胎移入到培养箱平衡过夜的G-2囊胚培养液中继续培养。
实施例2
与实施例1的区别在于步骤3.3中Kdm4A mRNA浓度为0ng/μL。
实施例1-2修正的人三原核受精卵体外培养囊胚发育率如表1所示。
表1：显微注射Kdm4AmRNA对人二倍体化胚胎发育的影响
实验结果表明本发明可以显著提高修正的人三原核受精卵体外培养囊胚发育率。过表达KDM 4A和未注射组各时期胚胎示意图如图3所示。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广州医科大学附属第三医院(广州重症孕产妇救治中心、广州柔济医院)
<120> 专利申请的名称 一种提高修正的人三原核受精卵体外培养囊胚发育率的方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3195
<212> DNA
<213> 人工序列（2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum）
<400> 1
atggcttctg agtctgaaac tctgaatccc agtgctagga taatgacctt ttatccaact 60
atggaagagt tccgaaactt cagtagatac attgcctaca ttgaatccca aggagctcat 120
cgggcagggc tagccaaggt tgttcctcca aaagagtgga agccacgagc atcctatgat 180
gacattgatg atttggtcat tcctgccccc attcaacagc tggtgacggg gcagtctggc 240
ctctttactc agtacaacat acagaagaaa gccatgactg ttcgagagtt ccgcaagata 300
gccaatagcg ataagtactg taccccacgc tatagtgagt ttgaagagct cgagcggaaa 360
tactggaaaa atcttacatt caatcctcca atctatggtg cagatgtgaa tggtaccctc 420
tatgaaaagc atgttgatga gtggaatatt ggccggctga gaacaatcct ggacttggtg 480
gaaaaggaga gtgggatcac cattgagggt gtgaacaccc catacctgta ctttggcatg 540
tggaagacat cctttgcttg gcacactgaa gacatggacc tctacagcat caactacctg 600
cactttggag aaccaaagtc ctggtactct gttccacctg agcatggaaa gcggttggaa 660
cgcctcgcca aaggcttttt cccaggaagt gctcaaagct gtgaggcatt tctccgccac 720
aagatgaccc tgatttcccc gttaatgctg aagaaatatg gaattccctt tgacaaggtg 780
actcaagagg ctggagagtt tatgatcact ttcccttatg gttaccatgc cggctttaac 840
catggtttta actgtgcgga gtctaccaat tttgctaccc gtcggtggat tgagtacggc 900
aagcaagctg tgctgtgctc ctgtagaaag gacatggtga agatctccat ggatgtgttt 960
gtgagaaagt tccagccaga aaggtacaaa ctttggaaag ctgggaagga caacacagtt 1020
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ccaagagctg gcaacgagga ggagtgccca gaggaggaca tggaaggggt ggaggatgga 1140
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tgctttcggc acaagattcc taatttggag cgtgccaagg gggccttgca aagcatcact 2700
gcaggccaga aagtcattag caagcataag aacgggcgct tctaccagtg tgaagtggtc 2760
aggctcacca ccgagacctt ctatgaagtc aactttgatg atggctcctt cagcgacaat 2820
ctttatcctg aggacatagt gagccaggac tgtctccagt ttggtcctcc tgctgaaggg 2880
gaagtggtcc aagtgagatg gacagacggc caagtctatg gagccaagtt tgtggcctcc 2940
caccctatcc aaatgtacca ggtggagttt gaggatggct cacaacttgt ggttaagaga 3000
gatgatgtat acacactgga tgaagagctt cccaagagag tcaaatctag actgtcagta 3060
gcctcagaca tgcgcttcaa tgagattttc acagagaaag aggttaagca agaaaagaaa 3120
cggcaacgag ttatcaactc aagataccgg gaagattata ttgagcctgc actataccgg 3180
gccatcatgg agtaa 3195