阅读说明：本技术 一种dpy19l1l基因缺失型斑马鱼的构建方法 (Construction method of dpy19l1l gene-deleted zebra fish ) 是由 陆辉强 徐朝鹏 黄勇 廖信军 曹子岗 于 2020-07-09 设计创作，主要内容包括：本发明涉及基因敲除及斑马鱼模型技术领域,具体涉及一种dpy19l1l基因缺失型斑马鱼的构建方法。在斑马鱼的dpy19l1l基因上设计合适的打靶位点,在体外合成的特异性gRNA和Cas9蛋白,显微共注射进入斑马鱼一细胞内,将胚胎培养48h后,通过选取胚胎进行基因型分析,从而证实了所选位点的有效性,经培养获得稳定遗传dpy19l1l纯合突变斑马鱼品系。本发明能更高效且更精确地在生物体基因组中沉默特定基因,且制作简单、成本低,且可同时对靶基因上多个位点进行切,沉默任意数目的单个基因,且敲除dpy19l1l基因斑马鱼胚胎出现未出现的发育畸形,构建成功dpy19l1l突变体先天性脊柱弯曲,为脊柱弯曲模型提供了一个很好的斑马鱼模型,有助于研究骨骼相关疾病。(The invention relates to the technical field of gene knockout and zebra fish models, in particular to a construction method of a dpy19l1l gene-deleted zebra fish. Designing a proper targeting site on a ppy 19l1l gene of zebra fish, injecting a specific gRNA and a Cas9 protein synthesized in vitro into a zebra fish cell by microinjection, culturing an embryo for 48h, and then selecting the embryo to perform genotype analysis, thereby confirming the effectiveness of the selected site, and obtaining a stable genetic ppy 19l1l homozygous mutant zebra fish strain by culture. The invention can silence specific gene in organism genome more efficiently and more accurately, has simple manufacture and low cost, can simultaneously cut a plurality of sites on the target gene to silence any number of single genes, knocks out the development deformity of the dpy19l1l gene zebra fish embryo, successfully constructs the congenital spinal curvature of the dpy19l1l mutant, provides a good zebra fish model for the spinal curvature model, and is beneficial to researching bone related diseases.)

一种dpy19l1l基因缺失型斑马鱼的构建方法

技术领域

本发明涉及基因敲除及斑马鱼模型技术领域，具体涉及一种dpy19l1l基因缺失型斑马鱼的构建方法。

背景技术

DPY19L1L基因位于斑马鱼16号染色体上，该基因为DPY19基因家族中的一员，该基因家族编码DPY19(dumpy-19,DPY-19)蛋白家族，包含DPY19L1(DPY-19–like 1)，DPY19L2，DPY19L3和DPY19L4，该蛋白家族经典功能具甘露糖转移酶活性。DPY19L1蛋白为多-跨膜蛋白，主要参与神经系统发育，在大脑皮层发育过程中调控谷氨酸能神经元的径向迁移，同时该蛋白为轴突生长所需。DPY19L2基因在***发生过程中起重要作用，该基因缺失是***圆头症的重要致病因素。有研究指出，圆头症***不育与染色体断点处的DPY19L2基因的迁移和基因缺失之间是否平衡相关。综上所述，DPY19基因主要在神经发育、***发生过程中起作用，在骨骼发育和疾病相关领域未见报道，DPY19L1L基因的研究更是匮乏。

基于此，提供一种dpy19l1l基因缺失型斑马鱼，挖掘DPY19L1L基因在斑马鱼发育中的新功能及其遗传机制显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种dpy19l1l基因缺失型斑马鱼的构建方法，本发明中，dpy19l1l基因与斑马鱼骨骼发育相关，可用于研究斑马鱼骨骼发育的深层分子机制。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种dpy19l1l基因缺失型斑马鱼的构建方法，包括如下步骤：

S1、在NCBI上查询斑马鱼dpy19l1l基因的基因组DNA序列，并分析其功能结构域，根据CRISPR/Cas9敲除原理，在dpy19l1l基因第1号外显子找到dpy19l1l基因的靶位点，序列为5’-GGAATAACAGTGCTGATTCT-3’，并设计靶位点长引物和gDNA接头引物，所述dpy19l1l靶位点长引物序列为5’-Taatacgactcactatag GGAATAACAGTGCTGATTCTgttttagagctagaaatagc-3’，gDNA接头引物序列为5’-AGCACCGACTCGGTGCCACTT-3’；

S2、primer star PCR获得gRNA的体外转录模板；

S3、根据S2获得的gRNA体外转录模板进行体外转录，并提取纯化，获得纯化的gRNA；

S4、将纯化的gRNA和Cas9蛋白显微注射至斑马鱼一细胞期的受精卵，培养获得稳定遗传dpy-19l1l纯合突变斑马鱼品系，即dpy19l1l基因缺失型斑马鱼。

进一步的，S2反应体系为：gDNA Vector Template 1μl，靶位点长引物1μl，gDNA接头引物，dNTP Mix 1μl，5×Primer star buffer 10μl，Primer star DNApolymerase 1μl，ddH₂O 32μl；所述gDNA Vector Template是将具有双NLS的Cas9cDNAs克隆到pXT7载体中，用XbaI内切酶进行线性化获得。

进一步的，S2的扩增程序为：98℃2min；重复35个循环以下步骤：98℃15s，58℃15s，72℃20s；72℃5min；72℃30min。

进一步的，S3的转录体系为：模板DNA10ul，10×RNA polymerase Reactionbuffer2ul，25mM rNTP Mix0.8ul，RNase Inhibitor0.5ul，T7 RNA polymerase2ul，RNasefree H₂O4.7ul。

更进一步的，转录体系为：37℃，3h。

进一步的，S4的培养具体包括以下步骤：

S1、将显微注射的受精卵培养孵化，Sanger测序检测靶位点的有效性，筛选出有基因突变的，记作F0代，饲养至成鱼；

S2、将F0代成鱼与WT侧交得到F1代；

S3、利用基因型鉴定的方法确定dpy19l1l基因敲除的F1代；

S4、从F1代突变体中挑选相同突变类型的F1代进行交配得到F2代；

S5、基因型鉴定F2代中dpy19l1l基因敲除的纯合子即为能稳定遗传dpy-19l1l纯合突变斑马鱼品系，即dpy19l1l基因缺失型斑马鱼。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明能更高效且更精确地在生物体基因组中沉默特定基因，且制作简单、成本低，且可同时对靶基因上多个位点进行切，沉默任意数目的单个基因，且敲除dpy19l1l基因斑马鱼胚胎出现未出现的发育畸形。

(2)本发明构建成功的dpy19l1基因缺失型斑马鱼先天性脊柱弯曲，为脊柱弯曲模型提供了一个很好的斑马鱼模型，有助于研究骨骼相关疾病和用于筛选治疗或缓解骨骼疾病的药物。。

附图说明

图1为实施例1野生型和Dpy19l1l杂合子py19l1l基因序列峰图，图中，A为野生型，B为一种杂合子，C为另一种杂合子。

图2为实施例1野生型和Dpy19l1l杂合子py19l1l基因序列比对及碱基突变，图中，A为野生型，B为一种杂合子，C为另一种杂合子。

图3为实施例1野生型和dpy19l1基因缺失型斑马鱼表型比较，图中，A为野生型，B为dpy19l1基因缺失型斑马鱼。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

一种dpy19l1l基因缺失型斑马鱼的构建方法

S1、在NCBI上查询斑马鱼dpy19l1l基因的基因组DNA序列，并分析其功能结构域，根据CRISPR/Cas9敲除原理，在dpy19l1l基因第1号外显子找到dpy19l1l基因的靶位点，序列为5’-GGAATAACAGTGCTGATTCT-3’，如SEQID NO.1所示，并设计靶位点长引物，所述dpy19l1l靶位点长引物序列为5’-Taatacgactcactatag GGAATAACAGTGCTGATTCTgttttagagctagaaatagc-3’，如SEQ ID NO.2所示；

S2、primer star PCR获得gRNA的体外转录模板，反应总体积50μl，体系如表1：

表1 primer star PCR体系

所述gDNA Vector Template是将具有双NLS的Cas9 cDNAs克隆到pXT7载体中，用XbaI内切酶进行线性化获得；

所述gDNA adaptor Primer的序列为5’-AGCACCGACTCGGTGCCACTT-3’；如SEQ IDNO.3所示。

通过PCR方式体外扩增，将长引物上所带的T7启动子和靶位点连接至gDNA Vector上，再通过DNA纯化技术方式进行回收DNA片段，测定DNA片段浓度，该片段则为体外转录模板。

将反应体系混合均匀后，primer star PCR，在PCR仪上进行扩增反应，反应程序如表2：

表2 primer star PCR扩增程序

最终的PCR产物浓度为31.8ng/ul，OD值为1.85。

S3、根据S2获得的体外转录模板进行体外转录，反应总体积10ul，体系如下：

表3 体外转录反应体系

加完体系后，在37℃烘箱内合成3小时后，立刻电泳跑胶检测，看结果。加1ulDNase I，1h后进行gRNA提取。

trizol法提取纯化S3转录成功的gRNA，按试剂盒protocol进行操作，最后均加10ul RNase free H₂O。

Protocol如下：

a、trizol加500ul，氯仿100ul，剧烈震荡混匀，静置分层5min。

b、4℃15000xg最大转速，15min.

c、取中上清液至新的EP管中，加入等体积-20℃预冷的异丙醇，震荡15s，-20℃沉淀半小时。

d、4℃15000xg最大转速，10min.

e、除去上清，取75％乙醇1ml，洗涤2次沉淀；震荡15s，4℃15000xg最大转速，5min.

f、冰上晾干，加10ul RNase free H2O溶解。

纯化后的gRNA浓度为583.1ng/ul，OD值为2.08，保存在-80℃。

S5、在斑马鱼受精后30min之内，用吸管吸取胚胎转移至用琼脂糖制作的显微注射专用培养皿中，在进行显微注射之前，将Cas9蛋白和gRNA配成混合液，使Cas9蛋白的终浓度为5μg/ul，gRNA的终浓度为100ng/ul，注射3μL Cas9蛋白和gRNA混合液于一细胞期的受精卵内；注射过的受精卵放置于鱼液水中，28.5℃孵化；

显微注射体系如下：

表4 显微注射体系

本步骤的培养具体包括以下步骤：

(1)将显微注射的受精卵培养孵化，Sanger测序检测靶位点的有效性，筛选出有基因突变的，记作F0代，饲养至成鱼；

Sanger测序检测具体步骤如下：

a，提取斑马鱼基因组

斑马鱼胚胎受精48小时后(48hpf)，分别收集野生型胚胎(作为对照)和注射后胚胎于1.5ml Ep管中，每管10颗胚胎，按照下述方法提取基因组DNA，具体步骤如下：向装有胚胎的Ep管中加入20μl 50mm NaOH溶液，放置于金属浴中95℃裂解15min；4℃冷却后加入2ulTris-HCl(ph 8.0)中和，获得粗提的基因组DNA。

b，PCR扩增目的序列

提取基因组DNA后，设计引物序列以扩增出目的DNA片段；

PCR反应体系如下：dpy19l1l测序引物：上引物(forward primer 5’-GTCTGCGAGAGCCAAACTAC-3’，如SEQ ID NO.4所示)，下引物(reverse primer 5’-TTGTTTACAATCCGAGCTCC-3’，如SEQ ID NO.5所示)。

c，PCR产物送到英俊生物公司测序以分析突变位点碱基的***和缺失，将测序之后给出的峰图和序列，在NCBI上与标准目的序列进行对比，根据比对结果，分析出每个单克隆的突变类型，结果如图1和图2所示，dpy19l1l杂合子突变体序列，突变方式为两种，均由移码产生了无义突变。

(2)将F0代成鱼与WT侧交得到F1代；

(3)利用基因型鉴定的方法确定dpy19l1l基因敲除的F1代；

(4)从F1代突变体中挑选相同突变类型的F1代进行交配得到F2代；

(5)基因型鉴定F2代中dpy19l1l基因敲除的纯合子即为能稳定遗传dpy-19l1l纯合突变斑马鱼品系，即dpy19l1l基因缺失型斑马鱼，如图3所示，筛选后获得dpy19l1l缺失型斑马鱼有脊柱弯曲表型。

实施例2

实施例1构建的dpy19l1l基因缺失型斑马鱼的应用

在本实施例中，计划通过实施例1构建的dpy19l1l基因缺失型斑马鱼进行骨骼相关疾病的研究，筛选治疗或缓解骨骼疾病的药物，能够缓解斑马鱼脊柱弯曲程度的药物即为目的药物。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110> 井冈山大学

<120> 一种dpy19l1l基因缺失型斑马鱼的构建方法

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 斑马鱼

<400> 1

ggaataacag tgctgattct 20

<210> 2

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

taatacgact cactataggg aataacagtg ctgattctgt tttagagcta gaaatagc 58

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agcaccgact cggtgccact t 21

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gtctgcgaga gccaaactac 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ttgtttacaa tccgagctcc 20