一种利用注射遗传转化杜仲的方法
阅读说明：本技术 一种利用注射遗传转化杜仲的方法 (Method for genetic transformation of eucommia ulmoides by injection ) 是由 赵懿琛 王超 赵德刚 于 2020-12-21 设计创作，主要内容包括：本发明涉及了一种利用注射遗传转化杜仲的方法。本方法以萌发三天的杜仲幼苗,通过拔除两片子叶之间第一片真叶作为遗传转化受体,对杜仲幼苗两片子叶间注射不同浓度的农杆菌重悬液,具体操作步骤如下：(1)遗传转化受体的准备(2)农杆菌的培养(3)农杆菌重悬液的制备(4)杜仲的遗传转化(5)转基因植株的管理(6)转基因植株鉴定。本发明不经过组织培养技术,除培养农杆菌外,无需无菌操作,使用本方法具有操作简单、成本较低、能够转化大片段DNA、遗传稳定、拷贝数低等优点,已经成为目前应用最广泛的遗传转化方法。(The invention relates to a method for transforming eucommia ulmoides by utilizing injection genetic transformation. The method comprises the following specific operation steps of taking eucommia seedlings germinating for three days, pulling out a first true leaf between two cotyledons to serve as a genetic transformation receptor, and injecting agrobacterium tumefaciens resuspension with different concentrations between the two cotyledons of the eucommia seedlings: (1) preparation of genetic transformation receptor (2) culture of agrobacterium (3) preparation of agrobacterium resuspension (4) genetic transformation of eucommia (5) management of transgenic plant (6) transgenic plant identification. The invention does not need tissue culture technology, does not need aseptic operation except for culturing agrobacterium, has the advantages of simple operation, lower cost, capability of transforming large-fragment DNA, stable heredity, low copy number and the like, and becomes the most widely applied genetic transformation method at present.)
技术领域
本发明所属的技术领域为植物生物技术，具体涉及到一种利用注射遗传转化杜仲的方法。
背景技术
杜仲(Eucommia ulmoides Oliver)为杜仲科杜仲属落叶乔木，是我国一种名贵的中药材，具有重要的药用价值和经济价值。近年来，在农杆菌介导杜仲的遗传转化技术中，以组织培养技术为主，但存在愈伤组织诱导分化效率低、抗性芽生根以及转基因植株移栽成活率较低等因素，导致杜仲这一类研究相对滞后，很难得到较大的成活植株。
农杆菌注射法是在开放的环境下对遗传转化受体注射农杆菌重悬液进行的一种非组培遗传转化方法。可以直接在植株上进行整株遗传转化，不存在诱导分化以及抗性芽生根和后期移栽等问题，可以较好的保证阳性幼苗的存活。本发明以萌发三天的杜仲幼苗，经过拔除两片子叶间第一片真叶为材料进行遗传转化，农杆菌注射法具有操作简单、成本较低、能够转化大片段DNA、遗传稳定、拷贝数低等优点。目前农杆菌注射法的遗传转化体系在大豆、荔枝等双子叶植物中已经得到广泛的应用，而杜仲中的应用还未见明确报道，制约着杜仲基因组学和基因功能的研究。
发明内容
本发明利用农杆菌注射杜仲幼苗的遗传转化技术，得到转基因植株，为杜仲基因组学和基因功能的研究提供技术支持。
一种利用注射遗传转化杜仲的方法，包括下列步骤：
(1)遗传转化受体的准备：选取萌发2-4天的杜仲幼苗，去除两片子叶之间的第一片真叶作为遗传转化受体，以待备用；
(2)农杆菌的培养：将有目标基因的载体转化根瘤农杆菌菌株LBA4404后，接种到固体YEP培养基上，28℃培养箱中培养2d；挑取单菌落至5ml液体YEP培养基中，28℃、180rpm振荡培养12小时后，取100ul加入到100ml液体YEP培养基中，28℃、180rpm振荡培养至适宜，以待备用；所述YEP培养基上含有100mg/L卡那霉素(Kan)和100mg/L利福平(Rif)；
(3)农杆菌重悬液的制备：将培养好的农杆菌菌液分装于50ml离心管中，5000rpm离心10min，弃去上清，用重悬液重悬菌体沉淀，以待备用；
(4)杜仲的遗传转化：在农杆菌重悬菌液中加入乙酰丁香酮(AS)和表面活性剂Silwet-L77，用注射器将100μL农杆菌重悬菌液注射到杜仲两片子叶之间，28℃，黑暗培养3d；
(5)转基因植株的管理
对黑暗培养的植株取消暗培，一周后将成活植株移至转基因植物示范基地温室中，常规肥水管理。
所述杜仲幼苗为萌发3天的杜仲幼苗。
所述步骤(1)杜仲幼苗获得方法：选取生长活力好的种子，用水清洗种子三次，然后将种子浸泡于水中放入37℃恒温培养箱中过夜，之后用400mg/L的赤霉素浸泡5-6小时，取出后用清水洗净，播种于湿润的营养土中，10-15天萌发出芽。
所述去除是采用手术镊拔除。
所述重悬液配方：MS 4.43g/L，蔗糖30g/L，6-BA 3μM，2-iP 3μM，调pH至5.8-6.0。
所述YEP培养基配方：酵母提取物10g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，PH 7.2，固体YEP培养基中加入有琼脂15g/L。
所述步骤(4)的农杆菌重悬菌液中加入浓度为20mg/ml的乙酰丁香酮100ul，表面活性剂Silwet-L77的浓度为500ul/L。
所述农杆菌重悬液的浓度OD600为0.8。
所述载体中连接有GUS基因。
所述步骤(5)后包括转基因植株鉴定步骤，所述鉴定包括抗性植株的GUS化学组织染色检测和GUS基因的PCR检测。
抗性植株的GUS化学组织染色检测：按步骤(5)管理一个月后，剪取杜仲幼苗新长出的叶片放入PCR管中，加入GUS染色液；将其放入37℃的培养箱中孵育，加入75％乙醇洗脱至叶绿素完全脱尽，拍照观察。
为取转基因杜仲叶片切成1cm-2cm左右长后置于PCR管中，向PCR管中加入GUS染液200ul，于15Kpa真空处理10min，置于37℃恒温培养箱过夜反应。吸取染液，75％的乙醇脱色，直至叶绿素消失。
转基因植株PCR检测：取GUS染液检测叶片呈阳性的植株，采用CTAB法提取DNA，进行进一步的PCR检测。
所述GUS基因的PCR：检测10μL的PCR体系含DNA1.0μL，引物各0.2μL，rTaq 5.0ul，ddH2O 3.6μL。反应条件：94℃，3min；94℃，30s；54℃，30s；72℃，1min；35个循环；72℃延伸5min；12℃保存。PCR反应完毕，取5ul扩增产物在1％的琼脂糖凝胶电泳中电泳，凝胶成像系统仪下观察并照相。
本发明以萌发三天的杜仲幼苗，通过拔除两片子叶之间的第一片真叶作为遗传转化受体，在杜仲幼苗两片子叶之间注射农杆菌重悬菌液、乙酰丁香酮和表面活性剂Silwet-L77，在不同菌液浓度下进行浸染后，黑暗培养3d，待长出新叶后进行GUS化学组织染色和PCR鉴定转基因植株，其过程研究了不同的菌液浓度对杜仲幼苗的影响，最终得到农杆菌注射杜仲幼苗的遗传转化方法和转化最优条件。本发明的方法不需要组培过程，且遗传转化效率高。
本发明利用农杆菌注射杜仲幼苗的遗传转化方法，得到转基因植株，为杜仲的基因组学和基因功能的研究提供技术支持。
附图说明
图1杜仲幼苗受体的准备及注射。
其中，A：萌发三天的杜仲幼苗；B：拔除第一片真叶的杜仲幼苗；C：对杜仲幼苗注射农杆菌重悬液。
图2遗传转化后的植株。
其中，A：遗传转化15天后的植株；B：移栽一个月后的转基因植株。
图3GUS染色杜仲叶片。
其中，A：GUS染色并未出现蓝色野生型的杜仲植株叶片；B、C、D：GUS染色呈蓝色的转基因杜仲植株叶片。
图4GUS基因PCR结果。
其中，M：DL2000 marker；WT:野生杜仲植株；1-7为转基因杜仲植株
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。
下述所用的生物材料均为市售，且在本申请人的实验室均有保存，可以对外公开发放。
所述重悬液配方：MS 4.43g/L，蔗糖30g/L，6-BA 3μM，2-iP 3μM，调pH至5.8-6.0。
所述YEP培养基配方：酵母提取物10g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，PH 7.2，固体YEP培养基中加入有琼脂15g/L。
实施例1一种利用农杆菌注射杜仲幼苗的遗传转化技术
1.1 遗传受体准备：以萌发三天的杜仲幼苗，通过手术镊拔除两片子叶之间的第一片真叶作为遗传转化受体，以待备用。见图1所示。
1.2 农杆菌的培养：根瘤农杆菌菌株LBA4404,携带潮霉素抗性基因Hyg和GUS基因的载体pCAMBIA1300载体接种到含100mg/mL卡那霉素(Kan)和100mg/mL利福平(Rif)的YEP固体培养基上，28℃培养箱中培养2d；挑取单菌落至5ml YEP(含100mg/mL Kan和100mg/mLRif)液体培养基中，28℃、180rpm振荡培养12小时后,取100ul加入到100mlYEP(含100mg/mLKan和100mg/mL Rif)液体培养基中，28℃、180rpm振荡培养至适宜，以待备用。
1.3 农杆菌重悬液的制备：将培养好的农杆菌菌液分装于50ml离心管中，5000rpm离心10min，弃去上清，用重悬液重悬菌体沉淀，以待备用。
1.4 杜仲的遗传转化：在农杆菌重悬液中加入乙酰丁香酮(AS)和表面活性剂Silwet-L77，用1mL注射器将100μL农杆菌菌液注射到杜仲两片子叶之间，28℃，黑暗培养3d。
表1 不同菌液浓度下对杜仲幼苗的浸染
1.5 转基因植株的管理：对黑暗培养的植株取消暗培，每隔两天浇水一次，一周后将成活植株移至转基因植物示范基地温室中，常规肥水管理。见图2所示。
1.6 转基因植株鉴定
1.6.1 抗性植株的GUS化学组织染色检测：取转基因杜仲叶片切成1cm-2cm左右长后置于PCR管中，向PCR管中加入GUS染液200ul，，于15Kpa下真空处理10min置于37℃恒温培养箱孵育过夜。吸取染液，加入1ml 75％的乙醇脱色，直至叶绿素消失，拍照观察。结果显示,对表1中，共处理2400株杜仲,经GUS染色鉴定出140株阳性植株。具体为：农杆菌菌液OD600值分别为0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0；存活率和GUS染色率分别为77.33％、77.67％、66.00％、58.33％、54.33％、67.33％、53.00％、62.00％和1.33％、10.00％、2.67％、3.33％、7.00％、1.70％、11.00％、9.60％；由表可知，最佳转化条件OD600值为0.8时，植株存活率为77.67％，GUS染色率为6.67％。见图3所示。
1.6.2 转基因植株PCR检测
1.6.2.1 CTAB法提取DNA：
1、向2ml离心管中加入1ml 1.2％的CTAB提取缓冲液，并加入20ul β-巯基乙醇，混匀后65℃预热。
2、取0.1-0.2g新鲜叶片，研磨至细胞破碎，于65℃水浴保温1h，期间每隔10min颠倒混匀一次。
3、13200rpm，离心5min，吸取800ul上清液于新的离心管中，加入等体积氯仿/苯酚(1:1)，轻轻颠倒混匀3-4次。
4、13200rpm,离心10min.，转移上清液700ul于新的离心管中，加入等体积氯仿(预冷)，轻轻颠倒混匀。
5、13200rpm,离心5min，转移上清液600ul于新的离心管中，加入等体积氯仿(预冷)，轻轻颠倒混匀。
6、13200rpm,离心5min，转移上清液500ul于新的离心管中，加入0.6-0.8倍异丙醇，轻轻颠倒混匀，-20℃放置10min后，13200rpm,离心10min，去上清液。
7、加入700ul 75％的酒精，13200rpm,离心1min，重复2次。
8、去上清液后，自然干燥后溶于30-50ul ddH2O中备用。
1.6.2.2 GUS基因的PCR检测
取GUS染液检测呈阳性的植株,对GUS基因进行PCR检测。10μL的PCR体系含DNA1.0μL，引物各0.2μL，rTaq 5.0ul，ddH2O3.6μL。反应条件：94℃，3min；94℃，30s；54℃，30s；72℃，1min；35个循环；72℃延伸5min；12℃保存。PCR反应完毕，取5ul扩增产物在1％的琼脂糖凝胶电泳中电泳，凝胶成像系统仪下观察并照相。结果显示,对GUS染液检测呈阳性的140株杜仲植株进行GUS基因的PCR检测，共有81株检测为GUS基因整合到杜仲基因组中，鉴定出转基因植株占阳性植株的57.86％。见图4所示。
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