精确大片段基因删除结合终止密码子***的基因敲除法
阅读说明：本技术 精确大片段基因删除结合终止密码子***的基因敲除法 (Gene knock-out method combining precise large-fragment gene deletion with stop codon insertion ) 是由 赵培 康雅虹 罗莹 于 2019-09-20 设计创作，主要内容包括：本发明属于基因工程的基因编辑技术领域,更具体地涉及一种高效的基因敲除法,即精确大片段基因删除结合终止密码子插入的基因敲除法。本发明旨在解决目前基因精确敲除中长片段敲除的难度大、周期长的问题。首先确定5’sgRNA靶位点位于起始密码子附近(100bp以内),3’端sgRNA靶位点位于5’端sgRNA靶位点与终止密码子之间任何位置,sgRNA靶位点的编辑效率分数高并且脱靶效应接近于0；其次确定被删除序列的5’和3’端点位于5’sgRNA靶序列和3’sgRNA靶序列中,修复模板带有终止密码子。最后将5’端上游sgRNA质粒和3’端下游sgRNA质粒与所述Cas9质粒、共编辑标记质粒、报告基因质粒和修复模板制得显微注射DNA混合液体系一起注入雌雄同体线虫体内,统计其基因编辑效率并验证筛选功能与全基因敲除法的一致性,发现本发明提供的技术方案基因编辑效率高、性价比好和成功率高的优点。(The invention belongs to the technical field of gene editing of genetic engineering, and particularly relates to a high-efficiency gene knock-out method, namely a gene knock-out method combining precise large-fragment gene deletion with stop codon insertion. The invention aims to solve the problems of high difficulty and long period of knockout of long fragments in the current gene precise knockout. Firstly, determining that a 5 ' sgRNA target site is positioned near a start codon (within 100 bp), a 3 ' sgRNA target site is positioned at any position between a 5 ' sgRNA target site and a stop codon, the editing efficiency score of the sgRNA target site is high, and the off-target effect is close to 0; secondly, the 5 'and 3' end points of the deleted sequence are determined to be positioned in the 5 'sgRNA target sequence and the 3' sgRNA target sequence, and the repair template is provided with a stop codon. And finally, preparing a microinjection DNA mixed solution system by the upstream sgRNA plasmid at the 5 'end, the downstream sgRNA plasmid at the 3' end, the Cas9 plasmid, the co-editing marker plasmid, the reporter gene plasmid and the repair template, injecting the microinjection DNA mixed solution system into the hermaphrodite nematode, counting the gene editing efficiency of the hermaphrodite nematode, and verifying the consistency of the screening function and the whole gene knock-out method.)
技术领域
本发明属于基因工程的基因编辑技术领域，更具体地涉及一种高效的基因敲除法，即精确大片段基因删除结合终止密码子***的基因敲除法。
背景技术
CRISPR/Cas9基因编辑是目前非常高效的基因靶向操作技术之一，具有周期短、安全可靠、成本低等优势，非常适用于构建各种动物模型。
通过CRISPR/Cas9系统获得基因敲除效率非常高，目前有以下两种方式：第一种编辑方式是：删除从起始密码子(“ATG”)到终止密码子(“TAG”)之间的完整基因序列，获得全基因删除突变体；第二种编辑方式是：在比较靠近起始密码子的区域用一个sgRNA做基因编辑，随机产生敲入删除突变，从而获得移码突变体。
第一种编辑方式的优点是可以保证获得的突变体是完整的敲除突变体，因为全基因序列都被彻底删除(见图1中全基因删除)。缺点是对于基因编码序列(从起始密码子到终止密码子)比较长的基因，比如序列长度是6kb以上的基因，删除大片段的效率比较低，而且筛选难度也比较大。很多情况下在被删除基因的5’端和3’端不一定有合适的sgRNA靶位点可供编辑，这样需要用距离起始密码子和终止密码子较远位置的sgRNA靶位点，效率很低。
第二种编辑方式的优点在于用一个sgRNA很容易产生随机基因基因***缺失突变体(见图2中随机基因删除)。缺点有：(1)单个sgRNA编辑产生的随机基因***缺失突变长度很短(几个核苷酸碱基对)，当没有表型变化时，不容易通过PCR片段长度的变化筛选到；(2)因为产生的***缺失突变是随机的，所以无法***对cDNA序列的影响，是否会引起移码表达，或者提前产生终止密码子，导致基因表达提前终止；(3)移码表达是否破坏蛋白的功能仍是未知的，不确定是不是敲除突变体。
鉴于第二种编辑方式的局限性，通过移码突变的方法产生基因敲除的做法很难得到广泛推广。因此，通过全基因删除做精确敲除的编辑方式仍是目前最常用的基因删除方法，通过上述分析可知，全基因长片段敲除的难度大、周期长限制了完整基因敲除的使用范围。
发明内容
鉴于背景技术存在的上述问题，本发明的目的在于提供一种精确大片段基因删除结合终止密码子***的基因敲除法，以解决基因精确敲除中长片段敲除的难度大、周期长的问题。
为实现上述目的，发明人提供了一种精确大片段基因删除结合终止密码子***的基因敲除法(见图3中大片段删除终止法)，包括以下步骤：
准备Cas9质粒、共编辑标记质粒、报告基因质粒和雌雄同体线虫；
确定5’和3’端sgRNA靶位点序列：5’sgRNA靶位点位于起始密码子附近(100bp以内)，3’端sgRNA靶位点位于5’端sgRNA靶位点与终止密码子之间任何位置，sgRNA靶位点的编辑效率特异性分数高并且脱靶效应接近于0；
确定和构建修复模板；
构建5’端上游sgRNA质粒和3’端下游sgRNA质粒；
配制显微注射DNA混合液：将所述5’端上游sgRNA质粒和3’端下游sgRNA质粒、所述Cas9质粒、共编辑标记质粒、报告基因质粒和修复模板混合得到所述显微注射DNA混合液；
显微注射：将所述显微注射DNA混合液注射入雌雄同体线虫的性腺，得到P0代线虫，培养得到F1代线虫；以及筛选、验证目的突变。
区别于现有技术，上述技术方案至少具有以下有益效果：
1)在选择5’端和3’端sgRNA靶位点时，优先考虑sgRNA靶位点编辑效率高的位点，而不一定需要选择非常靠近起始密码子和终止密码子的sgRNA靶位点，避免了非常靠近起始密码子或终止密码子(30bp以内)的sgRNA靶位点效率低下的问题，此外也避免了产生非移码突变，而得不到敲除突变体的风险；
2)对于编码序列很长的基因，不需要删除所有编码序列，而仅需删除6kb以下即可，这样基因删除的编辑效率比较高；
3)由于选择了编辑效率特异性分数高并且脱靶效应低的sgRNA靶位点，被删除序列的5’和3’端点位于5’sgRNA靶序列和3’sgRNA靶序列中，所以可以用寡核苷酸链为模板，不需要构建质粒作为模板，大大降低了成本；
4)在删除较大片段的基因编码序列的同时在删除后的位置***终止密码子，造成基因提前终止或者mRNA的降解，达到敲除基因的目的。
附图说明
图1为背景技术所述利用全基因删除法敲除基因的方法示意图；
图2为背景技术所述利用随机基因删除法敲除基因的方法示意图；
图3为
具体实施方式
所述精确大片段基因删除结合终止密码子***的基因敲除法示意图；
图4为背景技术所述wah-1基因全基因敲除法编辑示意图；
图5为本发明具体实施方式所述wah-1基因删除结合终止密码子***的基因敲除法示意图；
图6为背景技术所述gsk-3基因全基因敲除法编辑示意图；
图7为本发明具体实施方式所述gsk-3基因基因删除结合终止密码子***的基因敲除法示意图；
图8为背景技术所述tat-5基因全基因敲除法编辑示意图；
图9为本发明具体实施方式所述tat-5基因基因删除结合终止密码子***的基因敲除法示意图。
具体实施方式
下面详细说明本发明提供的精确大片段基因删除结合终止密码子***的基因敲除法。
一种精确大片段基因删除结合终止密码子***的基因敲除法，包括以下步骤：
准备Cas9质粒、共编辑标记质粒、报告基因质粒和雌雄同体线虫；
确定5’和3’端sgRNA靶位点序列；
确定和构建修复模板；
构建5’端上游sgRNA质粒和3’端下游sgRNA质粒；
配制显微注射DNA混合液：将所述5’端上游sgRNA质粒和3’端下游sgRNA质粒、所述Cas9质粒、共编辑标记质粒、报告基因质粒和修复模板混合得到所述显微注射DNA混合液；
显微注射：将所述显微注射DNA混合液注射入雌雄同体线虫的性腺，得到P0代线虫，培养得到F1代线虫；以及筛选、验证目的突变。
本发明所述的精确大片段基因删除结合终止密码子***的基因敲除法，本质是在一个基因编辑中同时涉及到大片段基因删除和终止密码子***两个基因编辑行为。
本发明所述的Cas9质粒，是表达Streptococcus pyogenes Cas9(简称Cas9)的质粒；共编辑标记质粒是指识别共编辑sgRNA位点的sgRNA质粒；报告基因质粒是指Psur-5::sur-5::NLS::GFP质粒；识别5’端sgRNA靶位点序列和3’端sgRNA靶位点序列以及共编辑靶位点序列的sgRNA质粒骨架以及基因编辑常用的雌雄同体线虫，线虫裂解液是线虫研究实验室公开的常用普通缓冲液，以上物料均可直接购得。
在起始密码子附近的5’端选择编辑效率特异性分数最高并且脱靶效应为0或接近于0的sgRNA靶位点，即为5’端sgRNA靶位点序列；3’端sgRNA靶位点位于5’端sgRNA靶位点与终止密码子之间任何位置，编辑效率特异性分数高并且脱靶效应接近于0。编辑效率特异性分数的高低是相对而言的，目的编辑基因不同，预测得到的编辑效率特异性分数可能不同，但在同一组数据中，选择最高的编辑效率特异性分数对应的靶位点即为相应的sgRNA靶位点。
目前已有很多基于大数据算法的程序用于预测基因编辑中sgRNA的效率和适用性，本发明的具体实施方式中采用网站(http://crispr.mit.edu/或http://crispor.tefor.net)来获得5’端和3’端sgRNA靶位点序列。但基于对预测软件的预测效率与实际效率之间可能出现的误差，本发明中还结合PCR和测序公司测序结果进行验证。将基因编辑线虫用结合位置在距离被删除序列300-500bp的上下游引物进行PCR，然后送测序公司进行测序。
在本发明中，由于优先考虑选择编辑效率分数高并且脱靶效应低的sgRNA靶位点，被删除序列的5’和3’端点位于5’sgRNA靶序列和3’sgRNA靶序列中，所以可以不需要构建质粒作为模板，直接采用寡核苷酸链为模板大大降低基因编辑成本。作为本发明进一步优选的方案，所述修复模板为寡核苷酸链。
本发明与现有技术的一大区别即在删除较大片段的基因编码序列的同时，且在删除后的位置***终止密码子，造成基因提前终止或mRNA的降解，以达到敲除基因的目的。要实现上述目的，采用的修复模板与传统的修复模板相比，也就有具体的不同，作为本发明进一步优选的方案，所述修复模板包含终止密码子。
作为本发明进一步优选的方案，所述修复模板上的终止密码子两侧分别包含被删除序列外5’上游和3’下游35-50bp的序列。被删除序列外两侧35-50bp的模板序列又称为重组臂，即本发明提供的方案中修复模板的终止密码子及两侧各含有35-50bp的重组臂，重组臂的序列必须与被删除序列外5’上游和3’下游的序列相同。
作为本发明进一步优选的方案，所述显微注射DNA混合液体系包括以下：
Cas9质粒，50ng/μL；
共编辑标记质粒，50ng/μL；
5’端上游sgRNA质粒，50ng/μL；
3’端下游sgRNA质粒，50ng/μL；
报告基因质粒，20ng/μL；和
修复模板，20ng/μL。
此外，本发明所述的显微注射DNA混合液体系中还含有与共编辑标记质粒匹配的模板20ng/μL。
本发明所述筛选目的突变用到的共编辑系统为ben-164sgRNA共编辑系统，进行常规基因编辑实验，筛选杂合或纯合的目的编辑基因突变线虫。
测序验证纯合目的基因突变线虫是否正确。
为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例并配合附图详予说明。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。
实施例1：wah-1基因全基因敲除法
本实施例提供一种用雌雄同体秀丽隐杆线虫敲除wah-1基因的全基因删除方法，请参阅图4。采用精确的全基因删除(敲除)法，通过共编辑系统来筛选wah-1基因进行全基因敲除编辑线虫，进一步地，得到该方法的编辑效率。wah-1基因的序列可从wormbase网站(http://www.wormbase.org/)下载得到。
(1)选出起始密码子(“ATG”)附近5’端高效的sgRNA靶位点并确定sgRNA靶位点序列。在sgRNA效率预测网站(如http://crispor.tefor.net/或http://crispr.mit.edu/)查找起始密码子(“ATG”)附近5’端的sgRNA，选择编辑效率分数高而且脱靶效应低的sgRNA靶位点(附表一)，分数高者表示其sg预测编辑效率高，在本实施例中，我们得到起始密码子(“ATG”)附近5’端高效的sgRNA靶序列如下：
wah-1-Sg1:(如SEQ ID NO.1所示)
(2)选出终止密码子附近高效的sgRNA靶位点并确定sgRNA靶位点序列。在sgRNA效率预测网站(如http://crispor.tefor.net/或http://crispr.mit.edu/)里查找终止密码子附近的sgRNA，选择编辑效率分数高而且脱靶效应低的sgRNA靶位点(附表一)，得到终止密码子附近高效的sgRNA靶序列，即：
wah-1-Sg2：(如SEQ ID NO.2所示)
其中上述靶位点PAM序列加粗并双下划线标记。
(3)确定全基因敲除修复模板序列
全基因删除法修复模板序列中无编码序列，只有启动子和3’UTR，修复模板因包含删除序列外5’上游和3’下游35-50bp的模板序列，因此确定wah-1全基因删除修复模板序列为(-表示删除部分)如下，并在合成公司合成。
wah-1-oligo1:ataatccttcatttcaggtagaatagacggaaatcatcagaaggacaaaa-agatttagatttttagggttaatatatttaatttttttatttttttattt(如SEQ ID NO.3所示)
(4)构建sgRNA质粒：通过常规分子生物学的方法将PAM序列5’上游长度为20bp的sgRNA靶DNA序列构建到pU6::sgRNA质粒里，分别得到pU6::wah-1-sg1质粒pU6::wah-1-sg2质粒。sgRNA质粒的构建步骤参见中国发明专利申请201811491730.0所提供的技术方案。
(5)显微注射
将上述靶基因编辑的5’端上游pU6::wah-1-sg1质粒50ng/μL、3’端下游pU6::wah-1-sg2质粒50ng/μL、修复模板wah-1-oligo120 ng/μL、共编辑系统所需的共编辑标记质粒50ng/μL、报告基因质粒20ng/μL和Cas9质粒50ng/μL，将它们混合成显微注射DNA混合液体系，注射入雌雄同体线虫的性腺，得到P0代线虫，培养产卵，得到F1代线虫。
(6)筛选目的突变
利用ben-164sgRNA共编辑系统开始常规基因编辑实验，筛选杂合或纯合的目的编辑基因突变线虫。具体操作步骤为：
a)备料：准备Cas9质粒、特异识别ben-164sgRNA靶位点序列(5’-TCAAATCGGAGCCAAGTTCTGGG-3’)的sgRNA共编辑系统质粒、特异识别目的编辑位点的sgRNA质粒、报告基因质粒、得到目的基因编辑所需的修复模板、雌雄同体线虫、普通线虫培养平板和浓度为14μM benomyl的线虫培养平板，备用；
b)配制DNA混合液：将所述Cas9质粒、特异识别ben-164sgRNA靶位点的sgRNA质粒、特异识别目的编辑位点的sgRNA质粒、报告基因质粒和得到目的基因编辑所需的修复模板混合，得到DNA混合液；
c)显微注射：将所述DNA混合液注射入雌雄同体线虫的性腺，得到P0代线虫，然后将所述P0代线虫置于浓度为14μM benomyl的线虫培养平板中培养，得到F1代线虫；
d)挑选共编辑的F1代线虫：从所述F1代线虫中挑选出ben-164sgRNA靶位点被编辑的线虫，其表型为生长良好、运动自如、运动轨迹如正弦曲线。将从表型看是被编辑过的F1线虫，单只一板，分别置于普通琼脂培养平板中进行培养产卵，至少分至200板，培养得到F2代线虫；
e)筛选具有目的基因突变的F1代共编辑线虫的平板：将生长到L4及以上时期的所述F2代线虫用线虫裂解液裂解，得到F2代线虫模板DNA，然后采用PCR扩增或酶切方法筛选出具有目的基因突变的线虫，找到具有目的基因编辑和ben-164sgRNA靶位点共编辑的F1代线虫平板；
f)去除ben-164sgRNA靶位点被编辑的线虫：从所述具有目的基因突变的F1代共编辑线虫的平板中挑选出8-16只F2代线虫，单只一盘分盘至浓度为14μM benomyl的线虫培养平板，待F3代长至L4时期，PCR筛选出不带共编辑突变的线虫平板，即整盘线虫表型都为身体瘫痪、短小、运动不协调；
g)筛选纯合目的编辑的线虫：将所述不带共编辑突变的线虫平板中的线虫制成DNA模板，通过分子生物学方法筛选出带有纯合目的基因突变的线虫平板。
(7)测序验证目的突变
测序验证目的编辑线虫是否正确：将上述编辑线虫用结合位置在距离被删除序列300-500bp的上下游引物进行常规PCR操作，送测序公司测序。
(8)基因编辑效率
发明人通过PCR筛选和测序验证等鉴定方式来验证是否得到精确基因编辑的秀丽隐杆线虫。wah-1基因全基因删除法(共敲除9253bp)编辑实验中，发明人筛选了146个F1线虫，通过PCR方法筛选得到13个F1具有潜在的基因编辑，经过测序验证，发现均为非精确编辑，得到1个精确敲除的编辑线虫，得到其编辑效率为8.90％，而其精确编辑效率为0.7％。同时发明人发现该基因全敲除后，线虫株具有不育的表型，即不产生后代。
实施例2：wah-1基因的精确大片段基因删除结合终止密码子***的基因敲除法
本实施例提供一种用秀丽隐杆线虫敲除wah-1基因的精确大片段基因删除结合终止密码子***的基因敲除法，请参阅图5。
采用精确大片段基因删除结合终止密码子***的基因敲除法，通过共编辑系统来筛选wah-1基因精确大片段删除终止的基因编辑线虫，进一步地，得到该方法的编辑效率。wah-1基因的序列可从wormbase网站(http://www.wormbase.org/)下载得到。
(1)选出5’端附近高效的sgRNA靶位点并确定sgRNA靶位点序列
本发明所述的精确大片段基因删除结合终止密码子***的基因敲除法，5’端和3’的sgRNA靶序列不一定必须包括或者非常靠近起始密码子或终止密码子，在sgRNA效率预测网站(如http://crispor.tefor.net/或http://crispr.mit.edu/)里查找5’端附近的sgRNA，选择编辑效率分数高而且脱靶效应低的sgRNA靶位点(附表一)，得到5’端附近高效的sgRNA靶序列，为了减少变量更好与实施例1做对照，选用的5’端sgRNA与实施例1中起始密码子(“ATG”)附近5’端高效的sgRNA靶序列相同即：
wah-1-Sg1:(如SEQ ID NO.1所示)
其中上述靶位点PAM序列加粗并双下划线标记。
(2)选出3’端附近高效的sgRNA靶位点并确定sgRNA靶位点序列
利用sgRNA效率预测网站(如http://crispor.tefor.net/或http://crispr.mit.edu/)在5’端sgRNA靶位点与终止密码子之间选出编辑效率分数高而且脱靶效应低的3’端sgRNA靶位点并确定sgRNA靶位点序列。为了减少变量更好与实施例5做对照，选用的3’端sgRNA与实施例1中终止密码子附近3’端高效的sgRNA靶序列预测效率分数相同，得到3’端高效的sgRNA靶序列(附表一)，此时3’端的sgRNA靶序列没有非常靠近终止密码子，而是控制敲除范围在1.5kb左右，以达到节约成本的目的，得到sgRNA靶序列，即：
wah-1-Sg3:(如SEQ ID NO.4所示)
其中，上述靶位点PAM序列加粗并双下划线标记。
(3)确定带有终止密码子的修复模板序列根据sgRNA靶序列的位置选定合适的删除序列，确定精确删除序列的位置，被删除序列的5’和3’端点位于5’sgRNA靶序列和3’sgRNA靶序列中。同时由于3’端的sgRNA靶序列并没有非常靠近终止密码子在删除序列的位置，所以在删除序列的位置移码将“CCG”突变成终止密码子“TAG”，同时产生移码突变，使得在终止密码子3’端下游也产生多个终止密码子，达到提前终止蛋白表达的目的。修复模板因包含删除序列外5’上游和3’下游35-50bp的模板序列，得到的wah-1精确大片段基因删除结合终止密码子***的修复模板序列如下(-表示敲除部分)：
wah-1-oligo2: (如SEQ ID NO.5所示)
其中上述修复模板的起始密码子和终止密码子加粗并单下划线标记。
(4)构建sgRNA质粒：通过常规分子生物学的方法将PAM序列3’上游长度为20bp的sgRNA靶序列构建到pU6::sgRNA质粒里，再次得到pU6::wah-1-sg3质粒。sgRNA质粒的构建步骤参见中国发明专利申请201811491730.0所提供的技术方案。
(5)显微注射
将实施例1中上述靶基因编辑的5’端上游pU6::wah-1-sg1质粒50ng/μL、本实施例中3’端下游pU6::wah-1-sg3质粒50ng/μL、修复模板wah-1-oligo220ng/μL、共编辑系统所需的共编辑标记质粒50ng/μL、报告基因质粒20ng/μL以及Cas9质粒50ng/μL混合成显微注射DNA混合液体系，注射入雌雄同体线虫的性腺，得到P0代线虫，培养产卵，得到F1代线虫。
(6)筛选目的突变
利用ben-164sgRNA共编辑系统开始常规基因编辑实验，筛选杂合或纯合的目的编辑基因突变线虫。ben-164sgRNA共编辑系统基因编辑具体步骤与实施例1相同。
(7)测序验证目的突变
测序验证目的编辑线虫是否正确：将上述编辑线虫用结合位置在距离被删除序列300-500bp的上下游引物进行常规PCR操作，送测序公司测序。
(8)基因编辑效率
发明人通过同样的PCR筛选和测序验证等鉴定方式来验证是否得到精确基因编辑线虫。wah-1基因敲除终止法中，由于3’端的sgRNA靶序列并没有非常靠近终止密码子在删除序列的位置，且为了达到节约成本的效果将删除序列控制在1.5kb左右，所以本实施例在删除序列的位置移码将“CCG”突变成终止密码子“TAG”，使得在终止密码子3’端下游也有产生多个终止密码子，使基因彻底被敲除，提前终止蛋白表达。本实施例仅敲除了1593bp，比全基因敲除的9253bp少敲了7660bp，残留的碱基只表达寡氨基酸肽，或因为mRNA降解不表达任何蛋白。我们对131个F1线虫的后代进行筛选，通过PCR验证，得到32个F1有潜在的基因编辑，将其中7个阳性号进行测序验证，全部都为精确编辑。其编辑效率为24.43％，按已测序得到的精确编辑比例，可得到精确编辑效率约为24.43％。
本发明的实现过程中也发现使用精确大片段基因删除结合终止子***的基因敲除法筛选得到的纯合突变体也为不育表型(即无法产生后代)，与实施例1得到的全基因敲除编辑线虫株表型一致，在功能上证明了精确大片段基因删除结合终止子***的基因敲除法能达到和全基因敲除一致的效果。然而，精确大片段删除结合终止子***的敲除法相较于全基因敲除法具有速度快、性价比高和成功率高的优点。
实施例3：gsk-3基因全基因敲除法
本实施例提供一种用雌雄同体秀丽隐杆线虫敲除gsk-3基因的全基因删除方法，请参阅图6。采用精确的全基因删除(敲除)法，通过共编辑系统来筛选gsk-3基因进行全基因敲除编辑线虫，进一步地，得到该方法的编辑效率。gsk-3基因的序列可从wormbase网站(http://www.wormbase.org/)下载得到。
(1)选出起始密码子(“ATG”)附近5’端高效的sgRNA靶位点并确定sgRNA靶位点序列。在sgRNA效率预测网站(如http://crispor.tefor.net/或http://crispr.mit.edu/)查找起始密码子(“ATG”)附近5’端的sgRNA，选择编辑效率分数高而且脱靶效应低的sgRNA靶位点(附表一)，分数高者表示其sg预测效率高，在本实施例中，我们得到起始密码子(“ATG”)附近5’端高效的sgRNA靶序列如下：
gsk-3-Sg1:(如SEQ ID NO.6所示)
其中上述靶位点PAM序列加粗并双下划线标记。
(2)选出终止密码子附近高效的sgRNA靶位点并确定sgRNA靶位点序列。在sgRNA效率预测网站(如http://crispor.tefor.net/或http://crispr.mit.edu/)里查找终止密码子附近的sgRNA，选择编辑效率分数高而且脱靶效应低的sgRNA靶位点(附表一)，得到终止密码子附近高效的sgRNA靶序列，即：
gsk-3-Sg2:(如SEQ ID NO.7所示)
其中上述靶位点PAM序列加粗并双下划线标记。
(3)确定全基因敲除修复模板序列
全基因删除法修复模板序列中无编码序列，只有启动子和3’UTR，修复模板因包含删除序列外5’端上游和3’端下游35-50bp的模板序列，因此确定gsk-3全基因删除修复模板序列为(-表示删除部分)如下，并在合成公司合成。
gsk-3-oligo1:tacacacacacacacaagaatcaaatcaatcagtagtgtggtgtg-acttcttttttttattttaatattggttctgaattttctctcgaat(如SEQ ID NO.8所示)
(4)构建sgRNA质粒：通过常规分子生物学的方法将PAM序列5’上游长度为20bp的sgRNA靶序列构建到pU6::sgRNA质粒里，分别得到pU6::gsk-3-sg1质粒pU6::gsk-3-sg2质粒。sgRNA质粒的构建步骤参见中国发明专利申请201811491730.0所提供的技术方案。
(5)显微注射
将上述靶基因编辑的5’端上游pU6::gsk-3-sg1质粒50ng/μL、3’端下游pU6::gsk-3-sg2质粒50ng/μL、修复模板gsk-3-oligo120ng/μL、共编辑系统所需的共编辑标记质粒50ng/μL、报告基因质粒20ng/μL和Cas9质粒50ng/μL，将它们混合成显微注射DNA混合液体系，注射入雌雄同体线虫的性腺，得到P0代线虫，培养产卵，得到F1代线虫。
(6)筛选目的突变
利用ben-164sgRNA共编辑系统开始常规基因编辑实验，筛选杂合或纯合目的编辑基因突变线虫。ben-164sgRNA共编辑系统基因编辑具体步骤与实施例1相同。
(7)测序验证目的突变
测序验证目的编辑线虫是否正确：将上述编辑线虫用结合位置在距离被删除序列300-500bp的上下游引物进行常规PCR操作，送测序公司测序。
(8)基因编辑效率
发明人通过PCR筛选和测序验证等鉴定方式来验证是否得到精确基因编辑的秀丽隐杆线虫。gsk-3基因全基因删除法(共敲除5304bp)编辑，我们一共筛选了288个F1线虫，通过PCR筛选和测序验证统计结果显示，仅得到2个阳性号，经过测序验证，发现1个为精确编辑，1个为非精确编辑。该实施例得到的编辑效率为0.69％，而其精确编辑效率为0.35％。同时我们发现该基因全敲除后，线虫株具有不育的表型，即不产生后代。
实施例4：gsk-3基因的精确大片段基因删除结合终止密码子***的基因敲除法
本实施例提供一种用秀丽隐杆线虫敲除gsk-3基因的精确大片段基因删除结合终止密码子***的基因敲除法，请参阅图7。
采用精确大片段基因删除结合终止密码子***的基因敲除法，通过共编辑系统来筛选gsk-3基因精确大片段删除终止的基因编辑线虫，进一步地，得到该方法的编辑效率。gsk-3基因的序列可从wormbase网站(http://www.wormbase.org/)下载得到。
(1)选出5’端附近高效的sgRNA靶位点并确定sgRNA靶位点序列
本发明所述的精确大片段基因删除结合终止密码子***的基因敲除法，5’端和3’的sgRNA靶序列不一定必须包括或者非常靠近起始密码子或终止密码子，在sgRNA效率预测网站(如http://crispor.tefor.net/或http://crispr.mit.edu/)里查找5’端附近的sgRNA，选择编辑效率分数高而且脱靶效应低的sgRNA靶位点(附表一)，得到5’端附近高效的sgRNA靶序列，为了减少变量更好与实施例3做对照，选用的5’端sgRNA与实施例3中起始密码子(“ATG”)附近5’端高效的sgRNA靶序列相同，即：
gsk-3-Sg1:(如SEQ ID NO.6所示)
其中上述靶位点PAM序列加粗并双下划线标记。
(2)选出3’端附近高效的sgRNA靶位点并确定sgRNA靶位点序列
利用sgRNA效率预测网站(如http://crispor.tefor.net/或http://crispr.mit.edu/)在5’端sgRNA靶位点与终止密码子之间选出编辑效率分数高而且脱靶效应低的3’端sgRNA靶位点并确定sgRNA靶位点序列。为了减少变量更好与实施例3做对照，选用的3’端sgRNA与实施例3中终止密码子附近3’端高效的sgRNA靶序列预测效率分数相同，得到3’端高效的sgRNA靶序列(附表一)，此时3’端的sgRNA靶序列没有非常靠近终止密码子，而是控制敲除范围在1.5kb左右，以达到节约成本、提高编辑效率和减少编辑时间的目的，得到sgRNA靶序列，即：
gsk-3-Sg3:(如SEQ ID NO.9所示)
其中上述靶位点PAM序列加粗并双下划线标记。
(3)确定带有终止密码子的修复模板序列
根据sgRNA靶序列的位置选定合适的删除序列，确定精确删除序列的位置，被删除序列的5’和3’端点位于5’sgRNA靶序列和3’sgRNA靶序列中。同时由于3’端的sgRNA靶序列并没有非常靠近终止密码子在删除序列的位置，所以在删除序列的位置将密码子“TGG”突变成“TGA”，形成终止密码子，提前终止蛋白表达，修复模板因包含删除序列外5’上游和3’下游35-50bp的模板序列，得到的gsk-3精确大片段基因删除结合终止密码子***的修复模板序列如下(-表示敲除部分)：
gsk-3-oligo2: (如SEQ ID NO.10所示)
其中上述修复模板的起始密码子和终止密码子加粗并单下划线标记。
(4)构建sgRNA质粒：通过常规分子生物学的方法将PAM序列5’上游长度为20bp的sgRNA靶序列构建到pU6::sgRNA质粒里，再次得到pU6::gsk-3-sg3质粒。sgRNA质粒的构建步骤参见中国发明专利申请201811491730.0所提供的技术方案。
(5)显微注射
将实施例3中上述靶基因编辑的5’端上游pU6::gsk-3-sg1质粒50ng/μL、本实施例中3’端下游pU6::gsk-3-sg3质粒50ng/μL、修复模板gsk-3-oligo220ng/μL、共编辑系统所需的共编辑标记质粒50ng/μL、报告基因质粒20ng/μL以及Cas9质粒50ng/μL混合成显微注射DNA混合液体系，注射入雌雄同体线虫的性腺，得到P0代线虫，培养产卵，得到F1代线虫。
(6)筛选目的突变
利用ben-164sgRNA共编辑系统开始常规基因编辑实验，筛选杂合或纯合的目的编辑基因突变线虫。ben-164sgRNA共编辑系统基因编辑具体步骤与实施例1相同。
(7)测序验证目的突变
测序验证目的编辑线虫是否正确：将上述编辑线虫用结合位置在距离被删除序列300-500bp的上下游引物进行常规PCR操作，送测序公司测序。
(8)基因编辑效率
发明人通过同样的PCR筛选和测序验证等鉴定方式来验证是否得到精确基因编辑线虫。gsk-3基因敲除终止法中，由于3’的sgRNA靶序列并没有非常靠近终止密码子在删除序列的位置，且为了达到节约成本的效果将删除序列控制在1.5kb左右，所以本实施例在删除序列3’下游的第一个密码子由“TGG”突变成终止密码子“TGA”，生成终止密码子，导致移码突变，提前终止了蛋白表达，或使mRNA降解。
本实施例仅敲除了1175bp，比全基因敲除的5304bp少敲了4129bp，残留的碱基只表达寡氨基酸肽，或者因为mRNA降解不表达任何蛋白。我们对151个F1线虫的后代进行筛选，通过PCR验证，得到3个F1有潜在的基因编辑，对两个突变体都进行测序验证，1个为非精确编辑，2个为精确编辑。其编辑效率为2％，精确编辑效率约为1.3％。
本发明的实现过程中也发现使用精确大片段基因删除结合终止子***的基因敲除法筛选得到的纯合突变体也为不育表型(即无法产生后代)，与实施例1得到的全基因敲除编辑线虫株表型一致，在筛选功能上证明了精确大片段基因删除结合终止子***的基因敲除法能达到和全基因敲除一致的效果。然而，精确大片段删除结合终止子***的敲除法相较于全基因敲除法具有速度快、性价比高和成功率高的优点。
实施例5：tat-5基因全基因敲除法
本实施例提供一种用雌雄同体秀丽隐杆线虫敲除tat-5基因的全基因删除方法，请参阅图8。采用精确全基因删除法，通过共编辑系统来筛选tat-5基因全基因敲除编辑线虫，进一步地，得到该方法的编辑效率。tat-5基因的序列可从wormbase网站(http://www.wormbase.org/)下载得到。
(1)选出起始密码子(“ATG”)附近5’端高效的sgRNA靶位点并确定sgRNA靶位点序列。在sgRNA效率预测网站(如http://crispor.tefor.net/或http://crispr.mit.edu/)查找起始密码子(“ATG”)附近5’端的sgRNA，选择编辑效率分数高而且脱靶效应低的sgRNA靶位点(附表一)，分数高者表示其offtarget(脱靶效应)低，在本实施例中，我们得到起始密码子(“ATG”)附近5’端高效的sgRNA靶序列如下：
tat-5-Sg1:(如SEQ ID NO.11所示)
其中上述靶位点PAM序列加粗并双下划线标记。
(2)选出终止密码子附近高效的sgRNA靶位点并确定sgRNA靶位点序列。在sgRNA效率预测网站(如http://crispor.tefor.net/或http://crispr.mit.edu/)里查找终止密码子附近的sgRNA，选择编辑效率分数高而且脱靶效应低的sgRNA靶位点(附表一)，得到终止密码子附近高效的sgRNA靶序列，即：
tat-5-Sg2:(如SEQ ID NO.12所示)
其中上述靶位点PAM序列加粗并双下划线标记。
(3)确定全基因敲除修复模板序列
全基因删除法修复模板序列中无编码序列，只有启动子和3’UTR，修复模板因包含删除序列外5’上游和3’下游35-50bp的模板序列，因此确定tat-5全基因删除修复模板序列为(-表示删除部分)如下，并在合成公司合成。
tat-5-oligo1:gggctcattttgaaaattttaatggttgactgatacctggatcac-gaattaatttattcgaaatgagggaaattatgatttaaaaaaaaa(如SEQ ID NO.13所示)
(4)构建sgRNA质粒：通过常规分子生物学的方法将PAM序列5’上游长度为20bp的sgRNA靶序列构建到pU6::sgRNA质粒里，分别得到pU6::tat-5-sg1质粒pU6::tat-5-sg2质粒。sgRNA质粒的构建步骤参见中国发明专利申请201811491730.0所提供的技术方案。
(5)显微注射
将上述靶基因编辑的5’端上游pU6::tat-5-sg1质粒50ng/μL、3’端下游pU6::tat-5-sg2质粒50ng/μL、修复模板tat-5-oligo120ng/μL、共编辑系统所需的共编辑标记质粒50ng/μL、报告基因质粒20ng/μL和Cas9质粒50ng/μL，将它们混合成显微注射DNA混合液体系，注射入雌雄同体线虫的性腺，得到P0代线虫，培养产卵，得到F1代线虫；
(6)筛选目的突变
利用ben-164sgRNA共编辑系统开始常规基因编辑实验，筛选杂合或纯合的目的编辑基因突变线虫。ben-164sgRNA共编辑系统基因编辑具体步骤与实施例1相同。
(7)测序验证目的突变
测序验证目的编辑线虫是否正确：将上述编辑线虫用结合位置在距离被删除序列300-500bp的上下游引物进行常规PCR操作，送测序公司测序。
(8)基因编辑效率
发明人通过PCR筛选和测序验证等鉴定方式来验证是否得到精确基因编辑的秀丽隐杆线虫。tat-5基因全基因删除法(共敲除7370bp)编辑的子代中，通过PCR方法筛选了240个F1线虫，通过PCR方法筛选得到2个F1具有潜在的基因编辑，经过测序验证，发现1个为非精确编辑，还有1个为精确敲除的编辑，得到其编辑效率为0.83％，而其精确编辑效率为0.42％。在筛选过程中，发明人发现该基因全敲除后，线虫株具有不育的表型，即不产生后代。
实施例6：tat-5基因的精确大片段基因删除结合终止密码子***的基因敲除法
本实施例提供一种用秀丽隐杆线虫敲除tat-5基因的精确大片段基因删除结合终止密码子***的基因敲除法，请参阅图9。
采用精确大片段基因删除结合终止密码子***的基因敲除法，通过共编辑系统来筛选tat-5基因精确大片段删除终止的基因编辑线虫，进一步地，得到该方法的编辑效率。tat-5基因的序列可从wormbase网站(http://www.wormbase.org/)下载得到。
(1)选出5’端附近高效的sgRNA靶位点并确定sgRNA靶位点序列
本发明所述的精确大片段基因删除结合终止密码子***的基因敲除法，5’端和3’端的sgRNA靶序列不一定必须包括或者非常靠近起始密码子或终止密码子，在sgRNA效率预测网站(如http://crispor.tefor.net/或http://crispr.mit.edu/)里查找5’端附近的sgRNA，选择编辑效率分数高而且脱靶效应低的sgRNA靶位点(附表一)，得到5’端附近高效的sgRNA靶序列，为了减少变量更好与实施例5做对照，选用的5’端sgRNA与实施例5中起始密码子(“ATG”)附近5’端高效的sgRNA靶序列相同即：
tat-5-Sg1:(如SEQ ID NO.11所示)
其中上述靶位点PAM序列加粗并双下划线标记。
(2)选出3’端附近高效的sgRNA靶位点并确定sgRNA靶位点序列
利用sgRNA效率预测网站(如http://crispor.tefor.net/或http://crispr.mit.edu/)在5’端sgRNA靶位点与终止密码子之间选出编辑效率分数高而且脱靶效应低的3’端sgRNA靶位点并确定sgRNA靶位点序列。为了减少变量更好与实施例5做对照，选用的3’端sgRNA与实施例5中终止密码子附近3’端高效的sgRNA靶序列预测效率分数相同，得到3’端高效的sgRNA靶序列(附表一)，此时3’的sgRNA靶序列没有非常靠近终止密码子，而是控制敲除范围在1.5kb左右，以达到节约成本的目的，得到sgRNA靶序列，即：
tat-5-Sg3:(SEQ ID NO.14)
其中上述靶位点PAM序列加粗并双下划线标记。
(3)确定带有终止密码子的修复模板序列
根据sgRNA靶序列的位置选定合适的删除序列，确定精确删除序列的位置，被删除序列的5’和3’端点位于5’sgRNA靶序列和3’sgRNA靶序列中。由于3’的sgRNA靶序列并没有非常靠近终止密码子在删除序列的位置，所以在删除序列的位置移码，将被删除序列后的第一个密码子“TGG”突变成终止密码子“TGA”，使得在终止密码子3’下游也有产生多个终止密码子，使基因彻底被敲除，提前终止蛋白表达。修复模板因包含删除序列外5’上游和3’下游35-50bp的模板序列，得到的tat-5精确大片段基因删除结合终止密码子***的修复模板序列如下(-表示敲除部分)：
tat-5-oligo2: (如SEQ ID NO.15所示)
其中上述修复模板的起始密码子和终止密码子加粗并单下划线标记。
(4)构建sgRNA质粒：通过常规分子生物学的方法将PAM序列5’端上游长度为20bp的sgRNA靶序列构建到pU6::sgRNA质粒里，再次得到pU6::tat-5-sg3质粒。sgRNA质粒的构建步骤参见中国发明专利申请201811491730.0所提供的技术方案。
(5)显微注射
将本实施例中上述靶基因编辑的5’端上游pU6::tat-5-sg1质粒50ng/μL、3’端下游pU6::tat-5-sg3质粒50ng/μL、修复模板tat-5-oligo220ng/μL、共编辑系统所需的共编辑标记质粒50ng/μL、报告基因质粒20ng/μL以及Cas9质粒50ng/μL混合成显微注射DNA混合液体系，注射入雌雄同体线虫的性腺，得到P0代线虫，培养产卵，得到F1代线虫。
(6)筛选目的突变
利用ben-164sgRNA共编辑系统开始常规基因编辑实验，筛选杂合或纯合的目的编辑基因突变线虫。ben-164sgRNA共编辑系统基因编辑具体步骤与实施例1相同。
(7)测序验证目的突变
测序验证纯合目的编辑线虫是否正确：将上述编辑线虫用结合位置在距离被删除序列300-500bp的上下游引物进行常规PCR操作，送测序公司测序。
(8)基因编辑效率
发明人通过同样的PCR筛选和测序验证等鉴定方式来验证是否得到精确基因编辑线虫，tat-5基因精确大片段敲除终止法中，由于3’的sgRNA靶序列并没有非常靠近终止密码子在删除序列的位置，所以本实施例将被删除序列3’端下游的第一个密码子由“TGG”突变成“TGA”，形成终止密码子，并产生移码突变，使tat-5基因彻底被敲除，提前终止蛋白表达。仅敲除了1657bp，比全基因敲除的7370bp少敲了5713bp，残留的碱基只表达寡氨基酸肽，或者因为mRNA被降解而不表达蛋白。我们对144个F1线虫的后代进行筛选，通过PCR验证，得到25个F1有潜在的基因编辑，将所有潜在编辑线虫进行测序验证，得到完全正确的编辑有8个，其编辑效率为17.36％，其精确编辑效率约为5.56％。
本发明的实现过程中也发现使用精确大片段基因删除结合终止子***的基因敲除法筛选得到的纯合突变体也为不育表型(即无法产生后代)，与实施例5得到的全基因敲除编辑线虫株表型一致，在筛选功能上证明了精确大片段基因删除结合终止子***的基因敲除法能达到和全基因敲除一致的效果，然而，精确大片段删除结合终止子***的敲除法相较于全基因敲除法具有速度快、性价比高和成功率高的优点。
本发明以wah-1、gsk-3、tat-5三个基因敲除为例，分别采用全基因敲除和精确大片段删除结合终止子***的敲除法进行基因敲除编辑，得到的基因编辑效率数据见附表二，由此可得出“精确基因删除结合终止密码子***的编辑方法”也即敲除终止法，相较于全基因敲除法来说，确实有编辑效率高、成功率高、快速而且编辑后的突变体只表达寡氨基酸肽，或因为mRNA降解不表达蛋白，敲除效果好的优点。
附表一：sgRNA靶位点序列
附表二：全基因敲除和大片段删除终止法进行基因敲除的基因编辑效率对比
需要说明的是，尽管在本文中已经对上述各实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。
本发明中涉及的生物序列表如下：
序列表
<110> 福建上源生物科技有限公司
<120> 精确大片段基因删除结合终止密码子***的基因敲除法
<130> 2019
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans，C. elegans)
<400> 1
aaaatgctgt tgcgagctgt tgg 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans，C. elegans)
<400> 2
cccactttat gatccagtga aaa 23
<210> 3
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 3
ataatccttc atttcaggta gaatagacgg aaatcatcag aaggacaaaa agatttagat 60
ttttagggtt aatatattta atttttttat ttttttattt 100
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans，C. elegans)
<400> 4
ccacaccagt atacattcca aaa 23
<210> 5
<211> 106
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 5
ggtagaatag acggaaatca tcagaaggac aaaaatgctg ttgcgagctg tttagggctc 60
ccttgactgg acattcttca gccgatcgca cacaaaatct gctcac 106
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans，C. elegans)
<400> 6
ctatcgtgct cgctgaaaag cgg 23
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans，C. elegans)
<400> 7
cggtgatgtg gctggcccat cgg 23
<210> 8
<211> 91
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 8
tacacacaca cacacaagaa tcaaatcaat cagtagtgtg gtgtgacttc ttttttttat 60
tttaatattg gttctgaatt ttctctcgaa t 91
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans，C. elegans)
<400> 9
gatcagaaag tgattggaaa tgg 23
<210> 10
<211> 93
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 10
tgtggtgtga tgaataagca gttactatcg tgctcgctga aaagctgaat cattcggagt 60
ggtattcctt gccaaactct ctacaacaaa tga 93
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans，C. elegans)
<400> 11
gactgatacc tggatcacat ggg 23
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans，C. elegans)
<400> 12
ccaagctacg cgaaagtcaa ctg 23
<210> 13
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 13
gggctcattt tgaaaatttt aatggttgac tgatacctgg atcacgaatt aatttattcg 60
aaatgaggga aattatgatt taaaaaaaaa 90
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans，C. elegans)
<400> 14
aatcacttac tggggaccac tgg 23
<210> 15
<211> 93
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 15
ctcattttga aaattttaat ggttgactga tacctggatc acatgtgaga tttgtgctca 60
caataactct tattcgagaa gctttcgatg act 93