一种纳米花及其检测葡萄糖浓度的应用
阅读说明：本技术 一种纳米花及其检测葡萄糖浓度的应用 (Nanometer flower and application thereof in detecting glucose concentration ) 是由 赵肃清 杨慧怡 何绮怡 崔锡平 卢明磊 于 2019-08-31 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种纳米花及其检测葡萄糖浓度的应用,该纳米花是由血红蛋白、葡萄糖氧化酶以及金属离子反应得到。本发明基于血红蛋白和葡萄糖氧化酶制备的纳米花,稳定性高,耐高温,耐强酸强碱,可在室温条件下储存长达一个月,制备方法简单,操作方便,绿色无污染,得到的纳米花可以直接用于葡萄糖浓度的检测,降低检测的成本。(The invention provides a nanoflower and application thereof in detecting glucose concentration. The nanoflower prepared based on hemoglobin and glucose oxidase has the advantages of high stability, high temperature resistance, strong acid and strong alkali resistance, capability of being stored for up to one month at room temperature, simple preparation method, convenience in operation, greenness and no pollution, and the obtained nanoflower can be directly used for detecting the concentration of glucose, so that the detection cost is reduced.)
技术领域
本发明涉及医药化学技术领域，更具体地，涉及一种纳米花及其检测葡萄糖浓度的应用。
背景技术
血清葡萄糖(GLU)，即人们常说的血糖，是指血液中葡萄糖浓度，是诊断糖尿病和观察疗效的最可靠指标。在正常情况下，在胰岛素等激素参与下，血清葡萄糖的分解与合成处于动态平衡，血糖保持相对稳定。正常人在空腹血糖浓度为3.61～6.11mM。空腹血糖浓度超过7.0mM称为高血糖。血糖浓度低于3.61mM称为低血糖。
现有检测血糖的方法基本为葡萄糖氧化酶法，但是该方法中所用到的游离葡萄糖氧化酶容易受到高温、强酸强碱等影响而失去活性，从而影响对血清葡萄糖的检测效果和准确性，亟待解决。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有葡萄糖浓度测定方法的缺陷和不足，提供一种可用于检测葡萄糖浓度的纳米花，该纳米花稳定性高，制备方法简单，使用方便，绿色无污染，可以直接用于葡萄糖浓度的检测，降低检测的成本。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明第一方面提供一种用于葡萄糖浓度检测的纳米花，所述纳米花是由血红蛋白、葡萄糖氧化酶以及金属离子反应得到。
可选地，所述金属离子选自Cu2+、Ga2+中的至少一种。
可选地，所述金属离子来自含有金属离子的盐，所述盐选自硫酸铜、氯化铜、硫酸钙、氯化钙中的至少一种。
本发明将纳米花用于检测葡萄糖的浓度，稳定性高，耐高温，耐强酸强碱，可在室温条件下储存长达一个月，检测过程简单方便，灵敏度高、检测限低，可实现实际样品中葡萄糖的快速检测。
作为可选的实施方案，所述含金属离子的盐选自硫酸铜、氯化铜、硫酸钙、氯化钙中的至少一种。
作为可选的实施方案，所述血红蛋白可替换为辣根过氧化物酶。
作为可选的实施方案，所述血红蛋白、葡萄糖氧化酶、金属离子的用量比为1.0-1.5mg：0.5-1.0mg：2.0-3.0×10-3mmol。
作为可选的实施方案，所述反应是在磷酸盐缓冲液存在的条件下进行。更优选地，所述反应是将含有血红蛋白的磷酸盐缓冲液和含有葡萄糖氧化酶的磷酸盐缓冲液混合，加入金属离子，静置，沉淀即为纳米花。优选地静置时间为2-5天。
作为可选的实施方案，所述葡萄糖氧化酶与所述磷酸盐缓冲溶液的用量比为0.5-1.0mg：3-4ml。
本发明第二方面提供一种铺制有上述纳米花的载体，所述载体上设有疏水区和亲水区，所述疏水区将所述亲水区隔离，所述亲水区铺制有所述纳米花。该载体用于承载纳米花等物质，便于后续葡萄糖浓度检测。该载体可以在前期大量制备，储存，在需要时取用即可。
作为可选的实施方案，所述疏水区的疏水基质选自石蜡。
作为可选的实施方案，所述载体的亲水区呈圆孔阵列，被疏水区隔离。
作为可选的实施方案，所述亲水区依次铺制有3,3',5,5'-四甲基联苯胺、所述纳米花。
作为可选的实施方案，所述载体选自滤纸。
当然，本发明也可以采用酶标板等器材作为载体，但是其成本较高，优选采用上述纸芯片载体。
本发明第三方面提供上述纳米花或载体在葡萄糖浓度检测中的应用。
本发明第四方面提供基于纳米花载体检测葡萄糖浓度的方法，包括如下步骤：
1)提供血红蛋白、葡萄糖氧化酶以及金属离子，混合反应，后处理得到纳米花，将所得纳米花储存于磷酸盐缓冲液中，备用；
2)提供载体，在所述载体的亲水区依次铺制3,3',5,5'-四甲基联苯胺、步骤1)制得的纳米花，制得铺制有所述3,3',5,5'-四甲基联苯胺、纳米花的载体；
3)配制不同浓度的葡萄糖标准溶液，加入所述步骤2)制得的所述载体，绘制标准曲线；
4)利用所述步骤2)制得的载体，对待检测葡萄糖溶液进行检测，得到检测结果。
该检测方法稳定性高，制得的纳米花在pH为1-14的条件下均可以保持较高酶活性，尤其是在pH≤3以及pH为11-14时，纳米花的酶活性高于游离酶，纳米花的热稳定性也高于游离酶，尤其是在30-70℃时，或者在30-60℃时，纳米花的酶活力高于游离酶，具有优异的热稳定性，灵敏度高、检测限底，检测过程简单方便，能够实现实际样品中葡萄糖浓度的快速检测，市场前景广阔，具有极大的应用价值。
作为可选的实施方案，所述步骤1)中，所述血红蛋白、葡萄糖氧化酶、金属离子的用量比为1.0-1.5mg：0.5-1.0mg：2.0-3.0×10-3mmol。
作为可选的实施方案，所述步骤1)中，所述金属离子选自Cu2+、Ga2+中的至少一种。
作为可选的实施方案，所述步骤1)中，所述金属离子来自含有金属离子的盐，所述盐选自硫酸铜、氯化铜、硫酸钙、氯化钙中的至少一种。
作为可选的实施方案，所述步骤1)中，所述反应是在磷酸盐缓冲溶液存在的条件下进行。
作为可选的实施方案，所述步骤1)中，所述血红蛋白可替换为辣根过氧化物酶。
作为可选的实施方案，所述步骤1)中，所述磷酸盐缓冲溶液的pH为7.0-7.4；
作为可选的实施方案，所述步骤1)中，所述反应是在20-25℃下进行，优选为室温，即23℃±2℃。
作为可选的实施方案，所述步骤1)中，反应时间为48-72h。
作为可选的实施方案，所述步骤1)中，反应结束后，固液分离，所得固体即为所述纳米花。
作为可选的实施方案，所述步骤1)中，将所得固体溶于磷酸盐缓冲溶液中，备用。
作为可选的实施方案，所述步骤1)中，溶解所得固体的所述磷酸盐缓冲溶液的pH为7-7.5，优选为7.4。
作为可选的实施方案，所述步骤1)中，所得固体与所述磷酸盐缓冲溶液的用量之比为1-1.5g：4-5mL。
作为可选的实施方案，所述步骤2)中，所述载体选自滤纸，具体可以为3MM滤纸等。
作为可选的实施方案，所述步骤2)中，预先用无水乙醇溶解3,3',5,5'-四甲基联苯胺，得到3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液，再进行铺制，也可以采用无水乙醇以外的其他溶剂，目的是使得3,3',5,5'-四甲基联苯胺均匀铺制在载体上。
作为可选的实施方案，所述步骤2)中，预先采用磷酸盐缓冲液稀释所述步骤1)制得的所述纳米花，稀释时，温育温度为30-80℃，优选为30-70℃，更优选为30-60℃。
作为可选的实施方案，所述步骤2)制得的所述载体的储存时间≥20天，优选为≥30天，更优选为≥34天。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、本发明基于过氧化物酶和葡萄糖氧化酶制备的纳米花，稳定性好，耐高温，耐强酸强碱，可在室温条件下储存长达一个月，制备方法简单，操作方便，绿色无污染。本发明所得到的纳米花可以直接用于葡萄糖浓度的检测，有效降低检测的复杂性及成本。
2、本发明提供的检测方法，灵敏度高、检测限底，检测过程简单方便，能够实现实际样品中葡萄糖浓度的快速检测，市场前景广阔，具有极大的应用价值。
附图说明
图1显示为本发明实施例中的纸芯片。
图2显示为本发明实施例中纸芯片用于检测葡萄糖的标准曲线图。
图3显示为本发明实施例中纸芯片对检测葡萄糖的特异性图。
图4显示为本发明实施例中PBS缓冲液pH对酶活性的影响图。
图5显示为本发明实施例中温度对酶活性的影响图。
图6显示为本发明实施例中纸芯片储存时间对酶活性的影响图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
本发明开发出一种检测过程简单方便、检测成本低、特异性强的检测葡萄糖浓度的方法，通过合成纳米花以及铺制纸芯片，成功制备得到。
以下实施例中，葡萄糖氧化酶、血红蛋白均购自sigma公司。磷酸盐缓冲溶液配制方法如下：准确称取0.2g磷酸二氢钠、8.0g氯化钠、2.9g磷酸氢二钠，用蒸馏水定容至1000ml。磷酸盐缓冲溶液pH为7.4。
以下实施例中涉及的试剂浓度，如无特别说明，均为混合前的浓度。
以下实施例中，TMB溶液是指溶解有3,3',5,5'-四甲基联苯胺的无水乙醇溶液。
实施例1制备血红蛋白和葡萄糖氧化酶纳米花
制备血红蛋白和葡萄糖氧化酶纳米花，方法如下：
取1.5ml 0.5mg/ml葡萄糖氧化酶的磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4)和1mg/ml血红蛋白的磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4)，混合均匀，得到混合液，向混合液中加入20μl 120mM硫酸铜水溶液，在室温下静置3天，反应得到的沉淀的量不再增加，然后在8000rpm，25℃条件下离心10分钟后去除上清液，将沉淀用去离子水清洗3次，得到的沉淀即为纳米花，呈现为暗灰色固体。最后将沉淀加入磷酸盐缓冲溶液复溶，形成混悬液，在4℃保存待用，复溶时，采用的磷酸盐缓冲液pH为7.4，纳米花：磷酸盐缓冲液＝1g：4.5ml。
实施例2制备血红蛋白和葡萄糖氧化酶纳米花
制备血红蛋白和葡萄糖氧化酶纳米花，方法如下：
取1ml 0.5mg/ml葡萄糖氧化酶的磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4)和1mg/ml血红蛋白的磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4)，混合均匀，得到混合液，向混合液中加入17μl 120mM硫酸铜水溶液，在室温下静置3天，反应得到的沉淀的量不再增加，然后在8000rpm，25℃条件下离心10分钟后去除上清液，将沉淀用去离子水清洗3次，得到的沉淀即为纳米花，呈现为暗灰色固体。最后将沉淀加入磷酸盐缓冲溶液复溶，形成混悬液，在4℃保存待用，复溶时，采用的磷酸盐缓冲液pH为7.4，纳米花：磷酸盐缓冲液＝1g：4.5ml。
实施例3制备血红蛋白和葡萄糖氧化酶纳米花
制备血红蛋白和葡萄糖氧化酶纳米花，方法如下：
取2.0ml 0.5mg/ml葡萄糖氧化酶的磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4)和0.75mg/ml血红蛋白的磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4)，混合均匀，得到混合液，向混合液中加入25μl 120mM硫酸铜水溶液，在室温下静置3天，反应得到的沉淀的量不再增加，然后在8000rpm，25℃条件下离心10分钟后去除上清液，将沉淀用去离子水清洗3次，得到的沉淀即为纳米花，呈现为暗灰色固体。最后将沉淀加入磷酸盐缓冲溶液复溶，形成混悬液，在4℃保存待用，复溶时，采用的磷酸盐缓冲液pH为7.4，纳米花：磷酸盐缓冲液＝1g：4.5ml。
实施例4利用纳米花检测葡萄糖浓度的方法
1、一种基于纳米花纸芯片检测葡萄糖浓度的方法，包括如下步骤：
(1)制作纸芯片：
在Microsoft word上设计尼龙筛的样式，设计圆孔直径5mm，孔间距10mm，一共8行12列，在印刷店打印成版。在木制框尼龙筛下垫一张3MM滤纸，尼龙筛上刷红色的固体石蜡，使石蜡渗透到3MM滤纸上，随后将3MM滤纸撕下来，在微波炉加热2分钟，随后置室温冷却10秒。
图1所示为本实施例制得的纸芯片。
(2)铺制纸芯片：
取实施例1复溶得到的纳米花溶液，采用pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液再次稀释，纳米花溶液与磷酸盐缓冲溶液的体积比为1：1，得到1:2稀释比的纳米花溶液。
在圆孔内依次加入5μL 8mM的TMB溶液、5μL 1:2稀释比的纳米花溶液，具体地，先加入5μL 8mM的TMB溶液，干燥后再加入下一溶液，最后完成纸芯片的铺制。
TMB溶液即为3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液，购买自sigma公司。
(3)利用纸芯片检测葡萄糖，建立标准曲线：
3.1)配制葡萄糖标准溶液：将36mg的葡萄糖溶于1mL的去离子水中，作为贮存液(200mM)使用。然后将贮存液用去离子水按照一定的稀释度将其配制成不同浓度的葡萄糖标准溶液(0，0.19，0.39，0.78，1.56，3.13，6.25，12.50，25.00，50.00，100.00mM)。
3.2)在步骤3)铺制的纸芯片上，加入5μL葡萄糖标准溶液到纸芯片上，每个浓度三个平行，25min后观察颜色，并用手机拍下记录，用image J软件进行数据灰度分析，以葡萄糖浓度为横坐标，以灰度值为纵坐标，用origin8.5作图。灰度值与葡萄糖浓度的浓度的线性关系如图5所示，线性方程为：Y＝8.42X+10.53，R2＝0.99，最低检测线为0.20mM。
(4)在标准曲线的基础上，对检测葡萄糖的特异性进行检测：
4.1)配制浓度为400mM的maltose、L-rhamnose monohydrate、sucrose、galactose、L-Arabinose、fructose、fucose、glucose，前述各种糖均购于上海aladdin公司。
4.2)在步骤3)铺制的纸芯片上，每孔加入5μL上述溶液，每个样品三个平行，25min后观察颜色，并用手机拍下记录，用image J软件进行数据灰度分析，以葡萄糖浓度为横坐标，以灰度值为纵坐标，用origin8.5作图。
图2显示为纸芯片用于检测葡萄糖的标准曲线图。
图3显示为纸芯片对检测葡萄糖的特异性图。
实施例5pH稳定性实验
在实施例4制得的纸芯片圆孔内依次加入5μL 8mM TMB溶液、5μL 1:2稀释比的纳米花溶液(30℃温育30分钟)，具体地，先加入5μL 8mM的TMB溶液、5μL pH 7.0的PBS，待加入的溶液在纸芯片上干燥后再加入下一溶液，最后完成纸芯片的铺制。加入5μL 25mM葡萄糖溶液到纸芯片上，以5μL PBS溶液作为阴性对照，每组4个平行，25min后观察颜色，并用手机拍下记录，用image J软件进行数据灰度分析。以pH为横坐标，以酶活力的百分比为纵坐标，用origin8.5作图。以同样的操作进行PBS溶液的pH为1-14的稳定性测试。
此处所用到的PBS溶液(即磷酸盐缓冲溶液)与制备纳米花所用到的PBS溶液用途是不一样的，这里加入PBS溶液的目的是使铺制形成的纸芯片(已经铺制有纳米花或游离酶)带有不同的pH，以用来探讨pH对纳米花或游离酶检测葡萄糖的影响。
对照组将纳米花替换为游离酶，其它实验步骤参照本实施例。
实验结果如图4所示，与游离酶检测系统相比，在强酸、强碱条件下，形成纳米材料的纳米花依旧能保持一定的酶活性。
实施例6热稳定性实验：
在纸芯片的圆孔内依次加入5μL 8mM的TMB溶液、5μL 1:2稀释比的在30℃温育30分钟的纳米花溶液，先加入5μL 8mM的TMB溶液，待加入的溶液在纸芯片上干燥后再加入下一溶液，最后完成纸芯片的铺制。完全干燥后，加入5μL 25mM葡萄糖溶液到纸芯片上，以5μLPBS溶液(pH为7)作为阴性对照，每组4个平行，25min后观察颜色，并用手机拍下记录，用image J软件进行数据灰度分析。以温度为横坐标，以酶活力的百分比为纵坐标，用origin8.5作图。以同样的操作进行40℃、50℃、60℃、70℃和80℃的稳定性测试。
实验结果如图5所示，通过与游离酶检测系统比较，在70℃下，纳米花检测系统的酶活力保持在65％，而游离酶系统酶活力仅有28％。而在80℃下，纳米花溶液和游离酶几乎失活。
实施例7储存稳定性实验：
在纸芯片的圆孔内依次加入5μL 8mM的TMB溶液、5μL 1:2稀释比的纳米花溶液(30℃温育30分钟)，先加入5μL 8mM的TMB溶液，待加入的溶液在纸芯片上干燥后才能加入下一溶液，待加入的下一溶液也干燥后，完成纸芯片的铺制。完全干燥后，在室温下储存。加入5μL 25mM葡萄糖溶液到纸芯片上，以5μL PBS溶液(pH为7)作为阴性对照，每组4个平行，25min后观察颜色，并用手机拍下记录，用image J软件进行数据灰度分析。每两天检测一次。以储存天数为横坐标，以酶活力的百分比为纵坐标，用origin8.5作图。
实验结果如图6所示，通过与游离酶检测系统比较，在第34天，纳米花检测系统的酶活力保持在98％左右，而游离酶系统酶活力仅有10％。
综上所述，本发明通过制备具有类辣根过氧化酶活性和催化葡萄糖氧化产生过氧化氢的血红蛋白和葡萄糖氧化酶纳米花，用蜡打印技术形成疏水和亲水圈纸芯片，利用3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)和过氧化氢的作用产生显色反应，葡萄糖的浓度与显色程度呈线性关系，从而建立纸芯片检测葡萄糖的方法。本发明将纳米花纸芯片用于检测葡萄糖浓度，检测过程简单方便，可以满足葡萄糖的临床检测。该检测方法特异性好，具有极大的应用价值，市场前景广阔。另外，基于血红蛋白和葡萄糖氧化酶制得的纳米花稳定性好，制备方法简单，操作方便。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。