一种分离纯化***黄素的方法
阅读说明：本技术 一种分离纯化***黄素的方法 (Method for separating and purifying ephedrine ) 是由 王钲霖 刘胜贵 蒋永昌 付彬彬 李智高 孔令羽 于 2019-11-15 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种分离纯化大麻黄素的方法,属于植物活性成分提取技术领域。本发明针对现有提取方法中大麻黄素提取率低、纯度低及易失活等问题,将大麻花叶粉碎,然后依次经纤维素酶酶解、低温提取、过滤、浓缩回收、萃取、粗滤、膜过滤、层析、浓缩、结晶、干燥等工艺流程分离纯化获得高纯度的大麻黄素。本发明工艺简单,制备得的大麻黄素不含四氢大麻酚,适合工业化大规模生产。(The invention discloses a method for separating and purifying ephedrine, and belongs to the technical field of extraction of plant active ingredients. The invention aims at the problems of low extraction rate, low purity, easy deactivation and the like of cannabixanthin in the existing extraction method, and high-purity ephedrine is obtained by crushing hemp leaves, and then sequentially carrying out enzymolysis with cellulase, low-temperature extraction, filtration, concentration and recovery, extraction, rough filtration, membrane filtration, chromatography, concentration, crystallization, drying and other technological processes for separation and purification. The method has simple process, and the prepared cannabixanthin does not contain tetrahydrocannabinol, thereby being suitable for industrial large-scale production.)
技术领域
本发明涉及植物活性成分提取技术领域，具体涉及一种分离纯化***黄素的方法。
背景技术
工业***(Stevia rebaudiana Bertoni)为***科***属一年生雌雄异株的草本植物，广泛分布于世界各地。世界上***属植物主要有野生***(CannabisruderalisJanisch)、印度***(Cannabis indica Lam)和栽培***(Cannabis sativaL)3个种，在长期的生物进化过程中又产生了许多***变种和亚种。由于***中含有一种致幻成瘾的次生代谢产物—四氢***酚(tetrahydrocannabinol，THC)，因而成为公众熟知的毒品原植物之一。为了方便监管和合理使用，国际上将***中THC含量<0 .3％的***品种定义不具备毒品利用价值的工业***。目前世界上种植工业***的国家已达27个，培育出的符合THC含量<0 .3％的工业***品种26个。
工业***又称汉麻，汉麻全身都是宝主要有纺织、食用和药用三大功能。汉麻皮富含纤维，可用于服装及各种饰品加工; 汉麻杆芯是极佳的木材替代品，还可用来生产超微粉; 汉麻籽富含优质蛋白以及人体必需脂肪酸，可应用于食品、保健品等领域。从***的叶、花及花粉中分离得到的已知黄酮类化合物有20多种，它们可以被糖基化、异戊烯基化或甲基化。2002年，McPartland等分离得到了共轭O-糖苷化合物：芹菜素(apigenin)、木犀草素(luteolin)、槲皮素(quercetin)和山奈酚(kaempferol)；同年，Vanhoenacker等分离得到了C-糖苷化合物：荭草苷(orientin)、紫杉醇(vitexin)、木犀草素-7-O-葡萄糖苷(luteolin-7-O-glucoside)和芹菜素-7-O-葡糖苷(apigenin-7-O-glucoside)。此外，***中特有的化合物***黄素A、***黄素B、***黄素C。***黄素，是***中的一类化合物，在化学上属于丙烯基黄酮类，与THC或CBD等***素没有关系。***黄素A和B属于黄酮类化合物，在1985年被发现，***黄素C在2008年被发现。当时已经确认其具有消炎作用，同等质量下比乙酰水杨酸（阿司匹林）的药效强近30倍。***黄素A和***黄素 B具有抑制类风湿的功效；***黄素A和B在体外对***素E有抑制作用，因此很多研究探讨了其在消炎方面的潜力。目前从汉麻叶和汉麻果胶中提取总黄酮工艺已见报道，但实现工业化提取的并不多见。本发明采用甲醇水溶液提取配合柱层析分离纯化，对汉麻叶总黄酮的提取工艺进行优化，以探寻汉麻叶总黄酮的最适提取条件，目的在于研发一个适合工业化大规模生产的工艺，旨在为充分利用汉麻叶中的生物活性成分，实现汉麻资源的综合利用和效益最大化提供指导。
发明内容
针对现有提取方法中***黄素提取率低、纯度低，易失活等问题，本发明提供了一种分离纯化***黄素的方法，包括如下步骤：
1、将***花叶粉碎制成颗粒，加入纤维素酶进行酶解，获得纤维素酶酶解***花叶。
2、向步骤1获得的酶解***花叶中加入乙醇水溶液，进行低温提取，获得提取液；所述的乙醇水溶液为（20-50%），低温提取温度为45-58℃，时间为30-60min。
3、过滤步骤2获得的提取液，过滤后低温减压浓缩至1/5体积，获得浓缩液；所述的低温减压浓缩温度为45-60℃，真空度为0.05-0.078MPa。
4、向步骤3中获得的浓缩液加入NaOH水溶液，调节PH值至5-6；调至碱性后加入正己烷萃取，合并萃取液，浓缩抽干；所述的NaOH水溶液为2-4%，每次加入正己烷的量为浓缩液的1.6-2.4倍，萃取次数为2-3次。
5、加压过滤步骤4得到的水相液，获得粗滤液。
6、将步骤5得到的粗滤液用膜过滤，得到的滤液低温减压浓缩至1/5体积，获得***黄酮浓缩液。
7、步骤6获得的***黄酮浓缩液，通过柱层析分离得到***黄素。
8、将步骤7分离得到的***黄素低温减压浓缩抽干，获得***黄素晶体；所述的低温减压浓缩温度为45-60℃，真空度为0.05-0.078MPa。
9、将步骤8得到的***黄素晶体，用分析纯级乙醇水溶液溶解，低温减压回收溶剂，结晶，获得***黄素结晶液。
10、过滤步骤9得到的结晶液，得到高纯度***黄素晶体，将所得晶体真空低温干燥，获得***黄素纯品。
进一步地限定，步骤1)所述***花叶粉碎制成的颗粒为30-50目。
更进一步地限定，步骤1)所述的加入纤维素酶进行酶解，所用纤维素酶的酶解活力单位1000U/g，加入量为：0 .1-0 .2g/kg果浆；酶解pH：4 .5-6 .5，酶解温度45-55℃，时间为40-50min。
进一步地限定，步骤2)所述***花叶与乙醇的料液比为1g:(4-6)mL。
进一步地限定，步骤5)所述加压过滤压力为0.2MPa，滤网为1000目。
进一步地限定，步骤6)所述过滤是指将粗滤液经过分子量为1000D的中空纤维膜过滤。
进一步地限定，步骤7)所述层析是指通过大孔树脂柱洗脱的方法进行纯化。
更进一步地限定，步骤7)所述大孔树脂为AB-8、HDX-5、X-5或DX101。
进一步地限定，步骤10)所述干燥为真空冻干干燥，真空度0 .07-0 .08MPa ,真空冻干温度-65--50℃，冻干时间24-28h。
本发明采用酶解配合低温醇提的方法提取***黄素，解决了***黄素提取率低、失活、色价与纯度不高等问题，取得的有益效果如下所述：
1 .以往***黄素提取之前仅仅进行粉碎处理，很难保证在提取过程中，***黄素从花叶纤维素中能充分释放，本发明在提取前采用纤维素酶解的方法，通过纤维素酶使花叶纤维素解链，将***黄素释放，进而通过提取使***黄素充分释放。
2 .以往***黄素提取均采用溶剂提取法，提取得到的提取液往往含有较多***素，本发明采用低温低醇的提取方法，解决了提取液中***素过多的问题。
3 .本发明与常规方法相比纯度由25％提高至60％，纯度增加35％。
附图说明
图1本发明与常规方法***黄素提取率的比较。
图2本发明与常规方法***黄素纯度比较。
图3本发明与常规方法提取液中***素的比较。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
本具体实施方式采用以下技术方案：
实施例1
***黄素分离纯化方法
1、取***花叶1000g，用高速粉碎机粉碎，粉碎粒度40目，获得***花叶颗粒。
2、然后以1g：4mL的料液比加入体积分数30％的乙醇水溶液，搅拌提取，获得提取液。所述提取温度为48℃，时间为40min，提取2次。
3、在提取结束后将提取液进行过滤，除去滤渣，取过滤液放入浓缩器中，进行溶剂回收，回收溶剂后，提取液浓缩至原体积的20％；减压浓缩温度为52℃，真空度为0.072MPa。
4、步骤3中获得的浓缩液放置冷却，加入2%NaOH水溶液，调节PH值至5-6；加入正己烷萃取，合并萃取液，浓缩抽干；每次加入正己烷的量为浓缩液的2倍，萃取次数为2次。
5、将萃取后的水相倒入到1000目过滤罐中，加压至0.2MPa过滤，获得粗滤液。
6、得到的粗滤液用分子量为1000D的中空纤维膜过滤，得到的滤液低温减压浓缩至1/5体积，获得***黄酮浓缩液。
7、获得的***黄酮浓缩液，通过柱层析分离得到***黄素；所用填料为大孔树脂AB-8。
8、将分离得到的***黄素溶液，低温减压浓缩抽干，获得***黄素晶体；所述的低温减压浓缩温度为52℃，真空度为0.072MPa。
9、得到的***黄素晶体，按料比1:3加入乙醇水溶液溶解，溶解完全后低温减压回收溶剂，浓缩至***黄素晶体析出，放置冷却获得***黄素结晶液。
10、用玻砂漏斗过滤结晶液，得到高纯度***黄素晶体，将所得晶体放入干燥箱中，真空度0 .08MPa ,真空冻干温度-65℃，冻干时间28h，得***黄素成品。
实施例2
***黄素分离纯化方法
1、取***花叶1000g，用高速粉碎机粉碎，粉碎粒度40目，然后加活力单位为1000U/g的纤维素酶，加入量为0 .1g/kg***花叶，在pH4 .5，温度为45℃，搅拌桨转数为20转/min，搅拌40min进行酶解，获得纤维素酶酶解花叶。
2、然后以1g：4mL的料液比加入体积分数30％的乙醇水溶液，搅拌提取，获得提取液。所述提取温度为48℃，时间为40min，提取2次。
3、在提取结束后将提取液进行过滤，除去滤渣，取过滤液放入浓缩器中，进行溶剂回收，回收溶剂后，提取液浓缩至原体积的20％；减压浓缩温度为52℃，真空度为0.072MPa。
4、步骤3中获得的浓缩液放置冷却，加入2%NaOH水溶液，调节PH值至5-6；加入正己烷萃取，合并萃取液，浓缩抽干；每次加入正己烷的量为浓缩液的2倍，萃取次数为2次。
5、将萃取后的水相倒入到1000目过滤罐中，加压至0.2MPa过滤，获得粗滤液。
6、得到的粗滤液用分子量为1000D的中空纤维膜过滤，得到的滤液低温减压浓缩至1/5体积，获得***黄酮浓缩液。
7、获得的***黄酮浓缩液，通过柱层析分离得到***黄素；所用填料为大孔树脂HDX-5。
8、将分离得到的***黄素溶液，低温减压浓缩抽干，获得***黄素晶体；所述的低温减压浓缩温度为52℃，真空度为0.072MPa。
9、得到的***黄素晶体，按料比1:3加入乙醇水溶液溶解，溶解完全后低温减压回收溶剂，浓缩至***黄素晶体析出，放置冷却获得***黄素结晶液。
10、用玻砂漏斗过滤结晶液，得到高纯度***黄素晶体，将所得晶体放入干燥箱中，真空度0 .08MPa ,真空冻干温度-65℃，冻干时间28h，得***黄素成品。
实施例3
***黄素分离纯化方法
1、取***花叶1000g，用高速粉碎机粉碎，粉碎粒度40目，然后加活力单位为1000U/g的纤维素酶，加入量为0 .1g/kg***花叶，在pH4 .5，温度为45℃，搅拌桨转数为20转/min，搅拌40min进行酶解，获得纤维素酶酶解花叶。
2、然后以1g：4mL的料液比加入体积分数30％的乙醇水溶液，搅拌提取，获得提取液。所述提取温度为48℃，时间为40min，提取2次。
3、在提取结束后将提取液进行过滤，除去滤渣，取过滤液放入浓缩器中，进行溶剂回收，回收溶剂后，提取液浓缩至原体积的20％；减压浓缩温度为52℃，真空度为0.072MPa。
4、步骤3得到的浓缩液倒入到1000目过滤罐中，加压至0.2MPa过滤，获得粗滤液。
5、得到的粗滤液用分子量为1000D的中空纤维膜过滤，得到的滤液低温减压浓缩至1/5体积，获得***黄酮浓缩液。
6、获得的***黄酮浓缩液，通过柱层析分离得到***黄素；所用填料为大孔树脂HDX-5。
7、将分离得到的***黄素溶液，低温减压浓缩抽干，获得***黄素晶体；所述的低温减压浓缩温度为52℃，真空度为0.072MPa。
8、得到的***黄素晶体，按料比1:3加入乙醇水溶液溶解，溶解完全后低温减压回收溶剂，浓缩至***黄素晶体析出，放置冷却获得***黄素结晶液。
9、用玻砂漏斗过滤结晶液，得到高纯度***黄素晶体，将所得晶体放入干燥箱中，真空度0 .08MPa ,真空冻干温度-65℃，冻干时间28h，得***黄素成品。
实施例1与实施2相比较：
实施例1的方法为乙醇水溶液提取配合大孔树脂层析方法提取***黄素，与本申请的不同在于***花叶没有经过酶解处理。
实施例3与实施2相比较：
实施例3的方法为乙醇水溶液提取配合大孔树脂层析方法提取***黄素，与本申请的不同在于提取液没有经萃取就进行柱层析。
通过上述实施例对比分析可得：本发明具有提取率高，得到的***黄素纯度高，且不含有***素等优点。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。