抗人cd47单克隆抗体及其应用
阅读说明：本技术 抗人cd47单克隆抗体及其应用 (Anti-human CD47 monoclonal antibody and application thereof ) 是由 崔文俊 马琳 郭树华 于 2019-06-20 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物医药领域,尤其涉及抗人CD47单克隆抗体,包括三个重链互补决定区(重链CDR1、重链CDR2、重链CDR3)和三个轻链互补决定区(轻链CDR1、轻链CDR2、轻链CDR3),具有良好特异性、较高的亲和性和稳定性,并同时还提供上述抗体、核酸分子、载体、宿主细胞、偶联物、组合物在制备治疗疾病的药物或检测试剂中的应用。(The invention relates to the field of biomedicine, in particular to an anti-human CD47 monoclonal antibody which comprises three heavy chain complementary determining regions (a heavy chain CDR1, a heavy chain CDR2 and a heavy chain CDR3) and three light chain complementary determining regions (a light chain CDR1, a light chain CDR2 and a light chain CDR3), has good specificity and high affinity and stability, and also provides application of the antibody, a nucleic acid molecule, a vector, a host cell, a conjugate and a composition in preparation of a medicine or a detection reagent for treating diseases.)
技术领域
本发明涉及生物医药领域，尤其涉及抗人CD47单克隆抗体及其应用。
背景技术
CD47又称整联蛋白、卵巢癌抗原OA3、Rh相关抗原和Mel6，是一种参与多种细胞过程的免疫球蛋白超家族成员，其全长305个氨基酸，胞外氨基端为一个IgV样的胞外结构域，高度疏水延伸的 5个跨膜片段和1个短的选择性拼接的羧基端胞质尾区，其中IgV样结构域是其主要配体结合部位。其配体包括：信号调节蛋白α链(Signal-regulatory proteinα，SIRPα)、凝血酶敏感蛋白(Thrombospondin，TSP)和整合素(Integrins)。CD47广泛表达于细胞膜表面，存在于所有组织的不同细胞上，尤其是白细胞，如多形核白细胞(PMN)、树突状细胞(DC)、T细胞，红细胞，胎盘，血小板，正常造血干细胞(hematopoietic stem cells，HSCs)等正常细胞。同时，CD47在人体大部分肿瘤细胞中高表达，并且它可以作为肿瘤诊断及判断预后的一个标准。如在急慢性髓系白血病、急性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤以及膀胱癌、卵巢癌、乳腺癌、直肠癌、***癌、肾癌、多发性骨髓瘤等多种实体肿瘤细胞或肿瘤干细胞(如白血病干细胞leukemia stem cells，LSC)存在过表达，并且其高表达与临床预后差相关。研究表明，肿瘤细胞表面的CD47通过与巨噬细胞、DC细胞等免疫细胞表面的SIRPα配体结合，向其传递―don’t eat me”的抑制信号，从而逃避这些细胞的吞噬，并进而逃避吞噬后肿瘤抗原的递呈所导致的T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。
研究表明，通过阻断肿瘤细胞表面的CD47与巨噬细胞表面的SIRPα 的相互作用，可以促进巨噬细胞、DC细胞对肿瘤细胞的吞噬，并进一步增加肿瘤抗原的提呈，激活获得性免疫应答。抗CD47抗体或抗SIRPα抗体同样能促进巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬。其次，抗CD47单抗也可通过Fc受体介导的细胞毒作用清除肿瘤细胞；另外，抗CD47单抗还可能通过直接诱导细胞凋亡来清除肿瘤细胞。
最近，人们已经开始关注整联蛋白相关分子 CD47(IAP)，其与αvβ3整联蛋白形成一种复合物，还研究了整联蛋白相关 分子CD47的抗体的医药用途。
WO97/32601尝试生产一种抗脾***株的单克隆抗体，目的在于开 发一种特异性抗体，该抗体能够鉴定脾***，该专利申请描述获得了 一种识别小鼠CD47作为抗原的新单克隆抗体。另一方面，WO97/32601公 开了所述单克隆抗体具有在骨髓细胞中诱导凋亡的特性。
WO99/12973描述被生产来抗人CD47(下文被称作为人CD47；在J.Cell Biol.，123，485-496，1993；Journal of Cell Science，108，3419-3425，1995中描 述的氨基酸序列和核苷酸序列)的单克隆抗体，该抗体具备在具有人CD47 的有核血细胞(骨髓细胞和淋巴细胞)中诱导凋亡的特性，即单克隆的 MABL-1和MABL-2抗体，以及生产这些抗体的杂交瘤，这些抗体是 MABL-1(FERM BP-6100)和MABL-2(FERM BP-6101)。
WO02/33072和WO02/33073公开了具有单链Fv区的单链Fv，该单链 Fv区具备在具有人CD47的有核血细胞中诱导凋亡的特性，其来自生成来抵抗人CD47的单克隆抗体。
人源抗体是治疗性抗体发展的最终方向，临床上应用人抗体，患者依从性好，可最大限度减少抗体的免疫原性、延长药物在体内的半衰期并可借助人免疫球蛋白Fc段介导免疫调理、ADCC及CDC等效应，进而增强抗体的生物学效应。目前，已经有多个抗CD47治疗性抗体进入临床研究阶段(NCT02096770，NCT02216409，NCT02367196，NCT02447354，NCT02488811)。
发明内容
本发明的提供一种具有良好特异性、较高的 亲和性和稳定性的抗人CD47单克隆抗体。
本发明的第一目的是提供抗人CD47单克隆抗体的氨基酸序列，具体如下：
一种抗人CD47单克隆抗体，具有三个重链互补决定区(重链CDR1、重链CDR2、重链CDR3)和三个轻链互补决定区（轻链CDR1、轻链CDR2、轻链CDR3），
重链CDR1选自：SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO:67、SEQID NO:73、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:133、SEQID NO:139、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:181或SEQ ID NO:187中的一种或者与其中一种同源性大于50%的相似序列；或与上述序列结合相同抗原表位的序列；
重链CDR2选自：SEQ ID NO:50、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO:68、SEQ IDNO:74、SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 92、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:134、SEQ IDNO:140、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:182或SEQ ID NO:188中的一种或者与其中一种同源性大于50%的相似序列；或与上述序列结合相同抗原表位的序列；
重链CDR3选自：SEQ ID NO:51、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO:69、SEQ IDNO:75、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 93、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:135、SEQ IDNO:141、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:183或SEQ ID NO:189中的一种或者与其中一种同源性大于50%的相似序列；或与上述序列结合相同抗原表位的序列；
轻链CDR1选自：SEQ ID NO:52、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO:70、SEQ IDNO:76、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 94、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:136、SEQ IDNO:142、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:184或SEQ ID NO:190中的一种或者与其中一种同源性大于50%的相似序列；或与上述序列结合相同抗原表位的序列；
轻链CDR2选自：SEQ ID NO:53、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO:71、SEQ IDNO:77、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 95、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:137、SEQ IDNO:143、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:185或SEQ ID NO:191中的一种或者与其中一种同源性大于50%的相似序列；或与上述序列结合相同抗原表位的序列；
轻链CDR3选自：SEQ ID NO:54、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO:72、SEQ IDNO:78、SEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 90、SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:138、SEQ IDNO:144、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:186或SEQ ID NO:192中的一种或者与其中一种同源性大于50%的相似序列；或与上述序列结合相同抗原表位的序列。
优选的，上述抗体还具有重链可变区和轻链可变区，其中：重链可变区包含上述的重链CDR1、CDR2和CDR3；轻链可变区包含上述的轻链CDR1、CDR2和CDR3。
进一步优选的，重链可变区包含如SEQ ID NO：49所示的重链 CDR1、如 SEQ IDNO：50 所示的重链CDR2以及如SEQ ID NO：51 所示的重链CDR3；和/或轻链可变区包含如SEQ ID NO：52 所示的轻链CDR1、如SEQ ID NO：53 所示的轻链CDR2以及如SEQ ID NO：54所示的轻链CDR3；或者
重链可变区包含如SEQ ID NO：55所示的重链 CDR1、如 SEQ ID NO：56 所示的重链CDR2以及如SEQ ID NO：57 所示的重链CDR3；和/或轻链可变区包含如SEQ ID NO：58 所示的轻链CDR1、如SEQ ID NO：59所示的轻链CDR2以及如SEQ ID NO：60所示的轻链CDR3；或者
重链可变区包含如SEQ ID NO：61所示的重链 CDR1、如 SEQ ID NO：62所示的重链CDR2以及如SEQ ID NO：63所示的重链CDR3；和/或轻链可变区包含如SEQ ID NO：64 所示的轻链CDR1、如SEQ ID NO：65所示的轻链CDR2以及如SEQ ID NO：66所示的轻链CDR3；或者
重链可变区包含如SEQ ID NO：67所示的重链 CDR1、如 SEQ ID NO：68 所示的重链CDR2以及如SEQ ID NO：69 所示的重链CDR3；和/或轻链可变区包含如SEQ ID NO：70 所示的轻链CDR1、如SEQ ID NO：71所示的轻链CDR2以及如SEQ ID NO：72所示的轻链CDR3；或者
重链可变区包含如SEQ ID NO：73所示的重链 CDR1、如 SEQ ID NO：74 所示的重链CDR2以及如SEQ ID NO：75所示的重链CDR3；和/或轻链可变区包含如SEQ ID NO：76 所示的轻链CDR1、如SEQ ID NO：77所示的轻链CDR2以及如SEQ ID NO：78所示的轻链CDR3；或者
重链可变区包含如SEQ ID NO：79所示的重链 CDR1、如 SEQ ID NO：80所示的重链CDR2以及如SEQ ID NO：81所示的重链CDR3；和/或轻链可变区包含如SEQ ID NO：82所示的轻链CDR1、如SEQ ID NO：83所示的轻链CDR2以及如SEQ ID NO：84所示的轻链CDR3；或者
重链可变区包含如SEQ ID NO：85所示的重链 CDR1、如 SEQ ID NO：86所示的重链CDR2以及如SEQ ID NO：87所示的重链CDR3；和/或轻链可变区包含如SEQ ID NO：88 所示的轻链CDR1、如SEQ ID NO：89所示的轻链CDR2以及如SEQ ID NO：90所示的轻链CDR3；或者
重链可变区包含如SEQ ID NO：91所示的重链 CDR1、如 SEQ ID NO：92所示的重链CDR2以及如SEQ ID NO：93所示的重链CDR3；和/或轻链可变区包含如SEQ ID NO：94 所示的轻链CDR1、如SEQ ID NO：95所示的轻链CDR2以及如SEQ ID NO：96所示的轻链CDR3；或者
重链可变区包含如SEQ ID NO：97所示的重链 CDR1、如 SEQ ID NO：98 所示的重链CDR2以及如SEQ ID NO：99所示的重链CDR3；和/或轻链可变区包含如SEQ ID NO：100 所示的轻链CDR1、如SEQ ID NO：101所示的轻链CDR2以及如SEQ ID NO：102所示的轻链CDR3；或者
重链可变区包含如SEQ ID NO：103所示的重链 CDR1、如 SEQ ID NO：104所示的重链CDR2以及如SEQ ID NO：105所示的重链CDR3；和/或轻链可变区包含如SEQ ID NO：106 所示的轻链CDR1、如SEQ ID NO：107所示的轻链CDR2以及如SEQ ID NO：108所示的轻链CDR3；或者
重链可变区包含如SEQ ID NO：109所示的重链 CDR1、如 SEQ ID NO：110 所示的重链CDR2以及如SEQ ID NO：111所示的重链CDR3；和/或轻链可变区包含如SEQ ID NO：112 所示的轻链CDR1、如SEQ ID NO：113所示的轻链CDR2以及如SEQ ID NO：114所示的轻链CDR3；或者
重链可变区包含如SEQ ID NO：115所示的重链 CDR1、如 SEQ ID NO：116所示的重链CDR2以及如SEQ ID NO：117所示的重链CDR3；和/或轻链可变区包含如SEQ ID NO：118所示的轻链CDR1、如SEQ ID NO：119所示的轻链CDR2以及如SEQ ID NO：120所示的轻链CDR3；或者
重链可变区包含如SEQ ID NO：121所示的重链 CDR1、如 SEQ ID NO：122所示的重链CDR2以及如SEQ ID NO：123所示的重链CDR3；和/或轻链可变区包含如SEQ ID NO：124所示的轻链CDR1、如SEQ ID NO：125所示的轻链CDR2以及如SEQ ID NO：126所示的轻链CDR3；或者
重链可变区包含如SEQ ID NO：127所示的重链 CDR1、如 SEQ ID NO：128所示的重链CDR2以及如SEQ ID NO：129所示的重链CDR3；和/或轻链可变区包含如SEQ ID NO：130所示的轻链CDR1、如SEQ ID NO：131所示的轻链CDR2以及如SEQ ID NO：132所示的轻链CDR3；或者
重链可变区包含如SEQ ID NO：133所示的重链 CDR1、如 SEQ ID NO：134 所示的重链CDR2以及如SEQ ID NO：135所示的重链CDR3；和/或轻链可变区包含如SEQ ID NO：136 所示的轻链CDR1、如SEQ ID NO：137所示的轻链CDR2以及如SEQ ID NO：138所示的轻链CDR3；或者
重链可变区包含如SEQ ID NO：139所示的重链 CDR1、如 SEQ ID NO：140 所示的重链CDR2以及如SEQ ID NO：141所示的重链CDR3；和/或轻链可变区包含如SEQ ID NO：142所示的轻链CDR1、如SEQ ID NO：143所示的轻链CDR2以及如SEQ ID NO：144所示的轻链CDR3；或者
重链可变区包含如SEQ ID NO：145所示的重链 CDR1、如 SEQ ID NO：146所示的重链CDR2以及如SEQ ID NO：147所示的重链CDR3；和/或轻链可变区包含如SEQ ID NO：148 所示的轻链CDR1、如SEQ ID NO：149所示的轻链CDR2以及如SEQ ID NO：150所示的轻链CDR3；或者
重链可变区包含如SEQ ID NO：151所示的重链 CDR1、如 SEQ ID NO：152所示的重链CDR2以及如SEQ ID NO：153所示的重链CDR3；和/或轻链可变区包含如SEQ ID NO：154所示的轻链CDR1、如SEQ ID NO：155所示的轻链CDR2以及如SEQ ID NO：156所示的轻链CDR3；或者
重链可变区包含如SEQ ID NO：157所示的重链 CDR1、如 SEQ ID NO：158所示的重链CDR2以及如SEQ ID NO：159所示的重链CDR3；和/或轻链可变区包含如SEQ ID NO：160所示的轻链CDR1、如SEQ ID NO：161所示的轻链CDR2以及如SEQ ID NO：162所示的轻链CDR3；或者
重链可变区包含如SEQ ID NO：163所示的重链 CDR1、如 SEQ ID NO：164所示的重链CDR2以及如SEQ ID NO：165所示的重链CDR3；和/或轻链可变区包含如SEQ ID NO：166所示的轻链CDR1、如SEQ ID NO：167所示的轻链CDR2以及如SEQ ID NO：168所示的轻链CDR3；或者
重链可变区包含如SEQ ID NO：169所示的重链 CDR1、如 SEQ ID NO：170所示的重链CDR2以及如SEQ ID NO：171所示的重链CDR3；和/或轻链可变区包含如SEQ ID NO：172所示的轻链CDR1、如SEQ ID NO：173所示的轻链CDR2以及如SEQ ID NO：174所示的轻链CDR3；或者
重链可变区包含如SEQ ID NO：175所示的重链 CDR1、如 SEQ ID NO：176所示的重链CDR2以及如SEQ ID NO：177所示的重链CDR3；和/或轻链可变区包含如SEQ ID NO：178所示的轻链CDR1、如SEQ ID NO：179所示的轻链CDR2以及如SEQ ID NO：180所示的轻链CDR3；或者
重链可变区包含如SEQ ID NO：181所示的重链 CDR1、如 SEQ ID NO：182所示的重链CDR2以及如SEQ ID NO：183所示的重链CDR3；和/或轻链可变区包含如SEQ ID NO：184所示的轻链CDR1、如SEQ ID NO：185所示的轻链CDR2以及如SEQ ID NO：186所示的轻链CDR3；或者
重链可变区包含如SEQ ID NO：187所示的重链 CDR1、如 SEQ ID NO：188所示的重链CDR2以及如SEQ ID NO：189所示的重链CDR3；和/或轻链可变区包含如SEQ ID NO：190所示的轻链CDR1、如SEQ ID NO：191所示的轻链CDR2以及如SEQ ID NO：192所示的轻链CDR3。
优选的，重链CDR1为SEQ ID NO: 49、重链CDR1为SEQ ID NO: 50、重链CDR1为SEQID NO: 51且轻链CDR1为SEQ ID NO: 52、轻链CDR1为SEQ ID NO: 53、轻链CDR1为SEQ IDNO: 54；或
重链CDR1为SEQ ID NO: 55、重链CDR1为SEQ ID NO: 56、重链CDR1为SEQ ID NO: 57且轻链CDR1为SEQ ID NO: 58、轻链CDR1为SEQ ID NO: 59、轻链CDR1为SEQ ID NO: 60；或
重链CDR1为SEQ ID NO: 61、重链CDR1为SEQ ID NO: 62、重链CDR1为SEQ ID NO: 63且轻链CDR1为SEQ ID NO: 64、轻链CDR1为SEQ ID NO: 65、轻链CDR1为SEQ ID NO: 66；或
重链CDR1为SEQ ID NO: 67、重链CDR1为SEQ ID NO: 68、重链CDR1为SEQ ID NO: 69且轻链CDR1为SEQ ID NO: 70、轻链CDR1为SEQ ID NO: 71、轻链CDR1为SEQ ID NO: 72；或
重链CDR1为SEQ ID NO: 73、重链CDR1为SEQ ID NO: 74、重链CDR1为SEQ ID NO: 75且轻链CDR1为SEQ ID NO: 76、轻链CDR1为SEQ ID NO: 77、轻链CDR1为SEQ ID NO: 78；或
重链CDR1为SEQ ID NO: 79、重链CDR1为SEQ ID NO: 80、重链CDR1为SEQ ID NO: 81且轻链CDR1为SEQ ID NO: 82、轻链CDR1为SEQ ID NO: 83、轻链CDR1为SEQ ID NO: 84；或
重链CDR1为SEQ ID NO: 85、重链CDR1为SEQ ID NO: 86、重链CDR1为SEQ ID NO: 87且轻链CDR1为SEQ ID NO: 88、轻链CDR1为SEQ ID NO: 89、轻链CDR1为SEQ ID NO: 90；或
重链CDR1为SEQ ID NO: 91、重链CDR1为SEQ ID NO: 92、重链CDR1为SEQ ID NO: 93且轻链CDR1为SEQ ID NO: 94、轻链CDR1为SEQ ID NO: 95、轻链CDR1为SEQ ID NO: 96；或
重链CDR1为SEQ ID NO: 97、重链CDR1为SEQ ID NO: 98、重链CDR1为SEQ ID NO: 99且轻链CDR1为SEQ ID NO: 100、轻链CDR1为SEQ ID NO: 101、轻链CDR1为SEQ ID NO: 102；或
重链CDR1为SEQ ID NO: 103、重链CDR1为SEQ ID NO: 104、重链CDR1为SEQ ID NO:105且轻链CDR1为SEQ ID NO: 106、轻链CDR1为SEQ ID NO: 107、轻链CDR1为SEQ ID NO:108；或
重链CDR1为SEQ ID NO: 109、重链CDR1为SEQ ID NO: 110、重链CDR1为SEQ ID NO:111且轻链CDR1为SEQ ID NO: 112、轻链CDR1为SEQ ID NO: 113、轻链CDR1为SEQ ID NO:114；或
重链CDR1为SEQ ID NO: 115、重链CDR1为SEQ ID NO: 116、重链CDR1为SEQ ID NO:117且轻链CDR1为SEQ ID NO: 118、轻链CDR1为SEQ ID NO: 119、轻链CDR1为SEQ ID NO:120；或
重链CDR1为SEQ ID NO: 121、重链CDR1为SEQ ID NO: 122、重链CDR1为SEQ ID NO:123且轻链CDR1为SEQ ID NO: 124、轻链CDR1为SEQ ID NO: 125、轻链CDR1为SEQ ID NO:126；或
重链CDR1为SEQ ID NO: 127、重链CDR1为SEQ ID NO: 128、重链CDR1为SEQ ID NO:129且轻链CDR1为SEQ ID NO: 130、轻链CDR1为SEQ ID NO: 131、轻链CDR1为SEQ ID NO:132；或
重链CDR1为SEQ ID NO: 133、重链CDR1为SEQ ID NO: 134、重链CDR1为SEQ ID NO:135且轻链CDR1为SEQ ID NO: 136、轻链CDR1为SEQ ID NO: 137、轻链CDR1为SEQ ID NO:138；或
重链CDR1为SEQ ID NO: 139、重链CDR1为SEQ ID NO: 140、重链CDR1为SEQ ID NO:141且轻链CDR1为SEQ ID NO: 142、轻链CDR1为SEQ ID NO: 143、轻链CDR1为SEQ ID NO:144；或
重链CDR1为SEQ ID NO: 145、重链CDR1为SEQ ID NO: 146、重链CDR1为SEQ ID NO:147且轻链CDR1为SEQ ID NO: 148、轻链CDR1为SEQ ID NO: 149、轻链CDR1为SEQ ID NO:150；或
重链CDR1为SEQ ID NO: 151、重链CDR1为SEQ ID NO: 152、重链CDR1为SEQ ID NO:153且轻链CDR1为SEQ ID NO: 154、轻链CDR1为SEQ ID NO: 155、轻链CDR1为SEQ ID NO:156；或
重链CDR1为SEQ ID NO: 157、重链CDR1为SEQ ID NO: 158、重链CDR1为SEQ ID NO:159且轻链CDR1为SEQ ID NO: 160、轻链CDR1为SEQ ID NO: 161、轻链CDR1为SEQ ID NO:162；或
重链CDR1为SEQ ID NO: 163、重链CDR1为SEQ ID NO: 164、重链CDR1为SEQ ID NO:165且轻链CDR1为SEQ ID NO: 166、轻链CDR1为SEQ ID NO: 167、轻链CDR1为SEQ ID NO:168；或
重链CDR1为SEQ ID NO: 169、重链CDR1为SEQ ID NO: 170、重链CDR1为SEQ ID NO:171且轻链CDR1为SEQ ID NO: 172、轻链CDR1为SEQ ID NO: 173、轻链CDR1为SEQ ID NO:174；或
重链CDR1为SEQ ID NO: 175、重链CDR1为SEQ ID NO: 176、重链CDR1为SEQ ID NO:177且轻链CDR1为SEQ ID NO: 178、轻链CDR1为SEQ ID NO: 179、轻链CDR1为SEQ ID NO:180；或
重链CDR1为SEQ ID NO: 181、重链CDR1为SEQ ID NO: 182、重链CDR1为SEQ ID NO:183且轻链CDR1为SEQ ID NO: 184、轻链CDR1为SEQ ID NO: 185、轻链CDR1为SEQ ID NO:186；或
重链CDR1为SEQ ID NO: 187、重链CDR1为SEQ ID NO: 188、重链CDR1为SEQ ID NO:189且轻链CDR1为SEQ ID NO: 190、轻链CDR1为SEQ ID NO: 191、轻链CDR1为SEQ ID NO:192。
优选的，重链可变区氨基酸序列选自：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO: 7；SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ IDNO: 17、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 37、SEQ IDNO: 39、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 45或SEQ ID NO: 47中的一种；
轻链可变区氨基酸序列选自：SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 6、SEQ IDNO: 8；SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 28、SEQ IDNO: 30、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 46或SEQ ID NO: 48中的一种。
作为优选，重链可变区氨基酸的序列为与序列a具有至少50%的同源性的相似序列，所述序列a为SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7；SEQ ID NO:9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19、SEQID NO: 21、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 41、SEQID NO: 43、SEQ ID NO: 45或SEQ ID NO: 47中的一种。
作为优选，轻链可变区氨基酸的序列为与序列b具有至少50%的同源性的相似序列，所述序列b为SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8；SEQ ID NO:10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 20、SEQID NO: 22、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO: 42、SEQID NO: 44、SEQ ID NO: 46或SEQ ID NO: 48中的一种。
优选，所述重链可变区为SEQ ID NO: 1且所述轻链可变区为SEQ ID NO: 2；或
所述重链可变区为SEQ ID NO: 3且所述轻链可变区为SEQ ID NO: 4；或
所述重链可变区为SEQ ID NO: 5 且所述轻链可变区为SEQ ID NO: 6；或
所述重链可变区为SEQ ID NO: 7且所述轻链可变区为SEQ ID NO: 8；或
所述重链可变区为SEQ ID NO: 9且所述轻链可变区为SEQ ID NO: 10；或
所述重链可变区为SEQ ID NO: 11且所述轻链可变区为SEQ ID NO:12；或
所述重链可变区为SEQ ID NO: 13且所述轻链可变区为SEQ ID NO: 14；或
所述重链可变区为SEQ ID NO: 15且所述轻链可变区为SEQ ID NO: 16；或
所述重链可变区为SEQ ID NO: 17且所述轻链可变区为SEQ ID NO: 18；或
所述重链可变区为SEQ ID NO: 19且所述轻链可变区为SEQ ID NO: 20；或
所述重链可变区为SEQ ID NO: 21且所述轻链可变区为SEQ ID NO: 22；或
所述重链可变区为SEQ ID NO: 23且所述轻链可变区为SEQ ID NO: 24；或
所述重链可变区为SEQ ID NO: 25且所述轻链可变区为SEQ ID NO: 26；或
所述重链可变区为SEQ ID NO: 27且所述轻链可变区为SEQ ID NO: 28；或
所述重链可变区为SEQ ID NO: 29且所述轻链可变区为SEQ ID NO: 30；或
所述重链可变区为SEQ ID NO: 31且所述轻链可变区为SEQ ID NO: 32；或
所述重链可变区为SEQ ID NO: 33且所述轻链可变区为SEQ ID NO:34；或
所述重链可变区为SEQ ID NO: 35且所述轻链可变区为SEQ ID NO: 36；或
所述重链可变区为SEQ ID NO: 37且所述轻链可变区为SEQ ID NO: 38；或
所述重链可变区为SEQ ID NO: 39且所述轻链可变区为SEQ ID NO: 40；或
所述重链可变区为SEQ ID NO: 41且所述轻链可变区为SEQ ID NO: 42；或
所述重链可变区为SEQ ID NO: 43且所述轻链可变区为SEQ ID NO: 44；或
所述重链可变区为SEQ ID NO: 45且所述轻链可变区为SEQ ID NO: 46；或
所述重链可变区为SEQ ID NO: 47且所述轻链可变区为SEQ ID NO: 48。
上述抗体还具有重链的氨基酸序列，该氨基酸序列包括重链CDR1、重链CDR2、重链CDR3和轻链CDR1、轻链CDR2、轻链CDR3；重链CDR1选自：SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 55、SEQID NO: 61、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:121、SEQID NO:127、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:181或SEQ ID NO:187中的一种或者与其中一种同源性大于50%的相似序列；
重链CDR2选自：SEQ ID NO:50、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO:68、SEQ IDNO:74、SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 92、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:134、SEQ IDNO:140、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:182或SEQ ID NO:188中的一种或者与其中一种同源性大于50%的相似序列；
重链CDR3选自：SEQ ID NO:51、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO:69、SEQ IDNO:75、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 93、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:135、SEQ IDNO:141、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:183或SEQ ID NO:189中的一种或者与其中一种同源性大于50%的相似序列；
轻链CDR1选自：SEQ ID NO:52、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO:70、SEQ IDNO:76、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 94、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:136、SEQ IDNO:142、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:184或SEQ ID NO:190中的一种或者与其中一种同源性大于50%的相似序列；
轻链CDR2选自：SEQ ID NO:53、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO:71、SEQ IDNO:77、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 95、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:137、SEQ IDNO:143、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:185或SEQ ID NO:191中的一种或者与其中一种同源性大于50%的相似序列；
轻链CDR3选自：SEQ ID NO:54、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO:72、SEQ IDNO:78、SEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 90、SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:138、SEQ IDNO:144、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:186或SEQ ID NO:192中的一种或者与其中一种同源性大于50%的相似序列。
本发明的第二目的是提供抗人CD47单克隆抗体的核酸序列，具体如下：
一种核酸分子，其包含能够编码重链CDR和/或轻链CDR的核酸序列，重链CDR1选自：SEQID NO: 49、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:109、SEQID NO:115、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:175、SEQID NO:181或SEQ ID NO:187中的一种或者与其中一种同源性大于50%的序列；
重链CDR2选自：SEQ ID NO:50、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO:68、SEQ IDNO:74、SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 92、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:134、SEQ IDNO:140、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:182或SEQ ID NO:188中的一种或者与其中一种同源性大于50%的序列；
重链CDR3选自：SEQ ID NO:51、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO:69、SEQ IDNO:75、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 93、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:135、SEQ IDNO:141、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:183或SEQ ID NO:189中的一种或者与其中一种同源性大于50%的序列；
轻链CDR1选自：SEQ ID NO:52、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO:70、SEQ IDNO:76、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 94、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:136、SEQ IDNO:142、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:184或SEQ ID NO:190中的一种或者与其中一种同源性大于50%的序列；
轻链CDR2选自：SEQ ID NO:53、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO:71、SEQ IDNO:77、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 95、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:137、SEQ IDNO:143、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:185或SEQ ID NO:191中的一种或者与其中一种同源性大于50%的序列；
轻链CDR3选自：SEQ ID NO:54、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO:72、SEQ IDNO:78、SEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 90、SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:138、SEQ IDNO:144、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:186或SEQ ID NO:192中的一种或者与其中一种同源性大于50%的序列。
一种核酸分子，其包含能够编码重链可变区和/或轻链可变区的核酸序列，所述重链可变区的氨基酸序列为：序列a或与序列a具有至少50%同源性的序列，所述序列a为为SEQID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7；SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 21、SEQ IDNO: 23、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 43、SEQ IDNO: 45或SEQ ID NO: 47中的一种；
所述轻链可变区的氨基酸序列为：序列b或与序列b具有至少50%的同源性的序列，所述序列b为SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8；SEQ ID NO: 10、SEQID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 32、SEQID NO: 34、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO: 46或SEQ ID NO: 48中的一种。
本发明还提供一种载体，其含有上述任一项的核酸分子。
本发明还提供一种宿主细胞，含有上述任一项所述的氨基酸序列、核酸分子或含有上述的载体。
本发明还提供一种偶联物，其含有上述任一项所述的抗体。
本发明还提供一种组合物，含有主成分和辅成分，所述主成分含有上述任一项所述的抗体或者所述任一项的核酸分子或上述的载体、上述宿主细胞或者上述的偶联物中的一种或多种，所述辅成分选自药学上可接受的载体或赋形剂，以及任选的其它生物活性物质。
所述其它生物活性物质包括但不限于其它抗体、融合蛋白或药物(例如抗肿瘤药物，如放、化疗 药物)。
本发明还提供上述抗体、核酸分子、载体、宿主细胞、偶联物、组合物在制备治疗疾病的药物或检测试剂中的应用。
所述疾病为恶性肿瘤、心血管疾病或者炎症类疾病。
本发明还提供一种诊断试剂或试剂盒，其含有上述任一项所述的抗体。所述诊断试剂或试剂盒用于在体外 (例如细胞或组织)或体内(例如人或动物模型)诊断与CD47相关的疾病。
以下对本发明做进一步描述：在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
这里提到的术语“抗体”包括完整抗体及其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链。“抗体”是指包含通过二硫键互相连接在一起的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，或其抗原结合部分。每条重链由重链可变区(在此缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(在此缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可进一步再分为高变区，称为互补决定区(CDR)，CDR散布在被称为构架区(FR)的更加保守的区域中。每个VH和VL均由三个CDR和四个FR组成，它们从氨基端向羧基端以如下顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重链和轻链的可变区含有可与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，该宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一成分(C1q)。
在本发明中，术语抗体的“抗原结合部分”是指全长抗体的一个或多个部分，所述部分保持结合抗体所结合的相同抗原的能力，与完整抗体竞争对抗原的特异性结合。通常参见，Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.,ed., 第2版，Raven Press,N.Y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗原结合部分。在一些情况下，抗原结合部分包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(例如，scFv)、嵌合抗体、双抗体(diabody)和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。
“同源性”是指在最优选比对时两个多核苷酸序列之间或两个多肽序列之间的序列相似性。
上述说明仅仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
附图1为人鼠嵌合抗体与人CD47亲和力测试结果；
附图2为人鼠嵌合抗体与CD47工程细胞株的细胞结合活性测试结构；
附图3A-3B为人鼠嵌合抗体诱导的巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬活性测试结果；
附图4A-4B为人鼠嵌合抗体的凝血效应测试结果；
附图5为人源化抗体在小鼠肿瘤模型中的药效验证。
具体实施方式
本发明公开了单克隆抗体及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的单克隆抗体及其应用中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：
1．动物免疫
采用经典的免疫时间表，对适宜年龄的SD大鼠免疫，免疫原为人CD47蛋白（购自近岸蛋白质科技有限公司），以使动物产生抗CD47的抗体。
2．细胞融合及杂交瘤细胞筛选
融合前调整小鼠骨髓瘤SP2/0的状态，保证其生长密度不超过于1.0×106个细胞，提前3天进行终免，终免采用尾静脉注射的方式，提前一天准备饲养SP2/0细胞，铺板数量为2.0×104个细胞/孔。通过电融合仪融合，保证脾细胞或***细胞与SP2/0细胞的数量比在10:1到5:1之间，每孔所铺脾细胞数量不超过1.0×105个。融合7天以后收获上清液并更换培养基。
收获的上清液首先通过直接ELISA结合方法、流式细胞仪测定细胞结合活性以及配体结合阻断试验获得3个筛选实验中均表现为阳性的杂交瘤细胞株。
其中，所涉及的各实验方法的具体步骤如下：
A、ELISA结合方法
包被人CD47在板上，加入杂交瘤培养液上清，孵育洗涤后，再加入羊抗鼠-HRP，显色，读数拟合出反应曲线，计算出EC50值。
B、流式细胞仪测定杂交瘤上清细胞结合活性
杂交瘤上清与CD47高表达工程细胞株以及空白对照细胞株共孵育一定时间后，通过离心洗涤后加入羊抗鼠IgG Fc Alexa647二抗，离心洗涤后通过流式细胞仪读取荧光信号。
C、配体结合阻断试验
用人CD47包被96孔板，96孔板封闭后，加入一定量具有与杂交六上清共孵育的人Fc标签的SIRPa蛋白进行结合，清洗后的96孔板通过羊抗人Fc片段的Hrp二抗检测结合到抗原的配体，能阻断配体与抗原结合的抗体与Fc标签的配体共孵育后加入96孔板会降低能检测到的结合到抗原上的配体量。
3.鼠源抗体基因的获取
通过Trizol (Ambion 15596-026)试剂盒抽提杂交瘤细胞株抽提杂交瘤细胞的总RNA，然后用Takara PrimeScript 1st Strand cDNA合成试剂盒逆转录总RNA制备cDNA，分别用简并引物扩增抗体的重链和轻链可变区序列。
4.人鼠嵌合抗体的制备和活性鉴定
制备抗体1-抗体24，具体地，抗体1的重链可变区为SEQ ID NO: 1且轻链可变区为SEQID NO: 2；
抗体2的重链可变区为SEQ ID NO: 3且轻链可变区为SEQ ID NO: 4；
抗体3的重链可变区为SEQ ID NO: 5 且所述轻链可变区为SEQ ID NO: 6；
抗体4的重链可变区为SEQ ID NO: 7且所述轻链可变区为SEQ ID NO: 8；
抗体5的重链可变区为SEQ ID NO: 9且所述轻链可变区为SEQ ID NO: 10；
抗体6的重链可变区为SEQ ID NO: 11且所述轻链可变区为SEQ ID NO:12；
抗体7的重链可变区为SEQ ID NO: 13且所述轻链可变区为SEQ ID NO: 14；
抗体8的重链可变区为SEQ ID NO: 15且所述轻链可变区为SEQ ID NO: 16；
抗体9的重链可变区为SEQ ID NO: 17且所述轻链可变区为SEQ ID NO: 18；
抗体10的重链可变区为SEQ ID NO: 19且所述轻链可变区为SEQ ID NO: 20；
抗体11的重链可变区为SEQ ID NO: 21且所述轻链可变区为SEQ ID NO: 22；
抗体12的重链可变区为SEQ ID NO: 23且所述轻链可变区为SEQ ID NO: 24；
抗体13的重链可变区为SEQ ID NO: 25且所述轻链可变区为SEQ ID NO: 26；
抗体14的重链可变区为SEQ ID NO: 27且所述轻链可变区为SEQ ID NO: 28；
抗体15的重链可变区为SEQ ID NO: 29且所述轻链可变区为SEQ ID NO: 30；
抗体16的重链可变区为SEQ ID NO: 31且所述轻链可变区为SEQ ID NO: 32；
抗体17的重链可变区为SEQ ID NO: 33且所述轻链可变区为SEQ ID NO:34；
抗体18的重链可变区为SEQ ID NO: 35且所述轻链可变区为SEQ ID NO: 36；
抗体19的重链可变区为SEQ ID NO: 37且所述轻链可变区为SEQ ID NO: 38；
抗体20的重链可变区为SEQ ID NO: 39且所述轻链可变区为SEQ ID NO: 40；
抗体21的重链可变区为SEQ ID NO: 41且所述轻链可变区为SEQ ID NO: 42；
抗体22的重链可变区为SEQ ID NO: 43且所述轻链可变区为SEQ ID NO: 44；
抗体23的重链可变区为SEQ ID NO: 45且所述轻链可变区为SEQ ID NO: 46；
抗体24的重链可变区为SEQ ID NO: 47且所述轻链可变区为SEQ ID NO: 48。
A.人鼠嵌合抗体的构建
鼠抗轻链可变区序列与人IgG kappa CL区序列进行拼接，获得全长的轻链序列，通过全基因合成，构建至含有氮端信号肽的pcDNA3.1载体上获得轻链表达载体。
鼠抗重链可变区序列与人IgG4 S228P的CH1，CH2和CH3区序列进行拼接，获得全长的重链序列，通过全基因合成，构建至含有氮端信号肽的pcDNA3.1载体上重链表达载体。
B.人鼠嵌合抗体的表达和纯化
轻,重链表达载体通过共转染对HEK293F细胞进行瞬转染，转染后的293F细胞培养7天，收集培养液上清。然后通过protein A亲和层析柱纯化上清中的嵌合抗体。
C．SPR测定人鼠嵌合抗体与CD47蛋白的结合能力
在25℃条件下进行，将人鼠嵌合抗体以一定流速流经Protein A芯片表面，待抗体结合到芯片表面之后，将梯度稀释的人CD47蛋白以一定流速流经固定了抗体的芯片表面。以实验缓冲液为空白对照，并且设定一个重复浓度。实验测定的结果用1:1 Binding模型进行拟合。结果如附图1，显示所有24个抗体与人CD47的亲和力均在10-11~10-10M范围内，显示了与抗原较强的结合能力。
D．流式细胞仪测定人鼠嵌合抗体与细胞的结合能力
纯化好的人鼠嵌合抗体与CD47高表达工程细胞株以及空白对照细胞株共孵育一定时间后，通过离心洗涤后加入羊抗人IgG Fc FITC二抗，离心洗涤后通过流式细胞仪读取荧光信号。通过流式细胞仪检测在不同浓度下8个抗体与人CD47高表达HEK293细胞系的结合信号获得这些抗体与人CD47高表达HEK293细胞系结合的结合曲线，并通过拟合获得最后的结合活性EC50值，结果如附图2，这些抗体的EC50值范围在10~10-2ug/ml之间，显示了与该细胞系不同的结合活性。
E．人鼠嵌合抗体诱导的巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬实验
取人血根据CD14+单核细胞分离说明书分离人的单核细胞，然后用人M2巨噬细胞分化培养基重悬CD14+单核细胞至2 x 106个/mL，细胞培养第7天，M2巨噬细胞分化成熟，用于下游实验。收集肿瘤单细胞悬液，按照CFSE细胞标记试剂盒说明书，离心后加入室温PBS重悬，加入终浓度为3μM的CFSE溶液后置于37℃，孵育10分钟。加入44 mL的4℃预冷的培养基洗液（RPMI1640+10% FBS），离心。重复清洗一次。用无血清基础培养基重悬M2巨噬细胞和CFSE标记的肿瘤细胞，每孔加入90μL的4 x 105个细胞（巨噬细胞：肿瘤细胞=1：1）至96孔U型细胞培养板，每个抗体设计两个复孔。加入10μL终浓度为20μg/mL的抗体至对应的细胞孔，混匀。置于37℃、5%CO2培养箱中孵育2-3小时。重悬细胞，并转移至对应的流式细胞管。FACSbuffer清洗细胞两次。倒出上清液，加入100µL FACS buffer重悬细胞，并加入5μL APCanti-human CD14，轻轻混和均匀后置于4ºC，避光孵育30分钟。用200μL FACS buffer清洗细胞两次。将细胞重悬于200 µL FACS buffer，并加入5μL 7-AAD轻轻混和均匀后置于室温(25ºC)孵育5分钟避光。将样品使用流式细胞仪分析。
附图3A为一次实验中抗体浓度在20ug/ml时引起的M2巨噬细胞对表达人CD47的肿瘤细胞系的吞噬情况，在该次实验中在不于人CD47结合同型对照抗体存在的条件下，M2巨噬细胞对肿瘤细胞系的吞噬指数低于10%,而包括能阳性对照抗体在内的11个待测抗体在20ug/ml的浓度下均能显著的提升M2巨噬细胞对肿瘤细胞系的吞噬指数，促进M2巨噬细胞对肿瘤细胞系的吞噬 。
附图3B为另一次实验中抗体浓度在20ug/ml时引起的M2巨噬细胞对表达人CD47的肿瘤细胞系的吞噬情况，在该次实验中在不于人CD47结合同型对照抗体存在的条件下，M2巨噬细胞对肿瘤细胞系的吞噬指数低于5%,而阳性对照抗体，抗体19和抗体23在20ug/ml的浓度下均能提升M2巨噬细胞对肿瘤细胞系的吞噬指数，显示出一定的促进M2巨噬细胞对肿瘤细胞系的吞噬 作用。
F. 人鼠嵌合抗体的凝血效应测定
从人血中通过离心分离得到红细胞，红细胞通过PBS重悬浮以后，加入一定浓度的人鼠嵌合抗体与红细胞在室温下进行共孵育2个小时，通过目测观察红细胞的凝集。
附图4A为不同浓度下10个抗体对人红细胞的凝集效应，结果显示除了抗体3和抗体12在较高的抗体浓度下会导致红细胞的凝集外，其余8个抗体均不会导致明显的红细胞凝集现象。
附图4B通过曲线形式表现的不同浓度下10个抗体对人红细胞的凝集效应的结果。
5．抗体在小鼠肿瘤模型中的药效验证
购自ATCC的Raji细胞通过基因编辑改造添加了Luciferase，并命名为Raji-Luc细胞。该细胞培养在37℃、5%CO2的培养箱中，培养基为含有10%灭活胎牛血清的RPMI1640培养基。细胞每隔3至4天长满即分瓶传代将PBS重悬的Raji-Luc细胞以5×105个/0.2mL浓度，0.2mL/只体积通过尾静脉接种到B-NSG小鼠。接种后使用小动物成像仪在接种后第0天、第3天测量肿瘤成像信号值，当平均成像信号强度达到1X106 P/S，将动物按肿瘤成像信号值随机分组，每个实验组6只。分组当天开始给药，每周给药2次，每次5mg/kg体重。给药后，每周检测2次肿瘤生长情况（小动物成像仪检测、记录）及动物体重。每一次的测量结果，包括活体成像照片，体重，小鼠临床状态等全部做好记录并保存。结果如附图5，为给B-NSG小鼠接种Raji-Luc肿瘤细胞以后，按照5mg/kg，一周2次的剂量对小鼠进行抗体给药治疗后，小鼠体内肿瘤细胞的生长曲线。横坐标为给药的时间，纵坐标为小鼠体内肿瘤细胞成像的信号强度。结果显示，抗体1、抗体3、抗体10、抗体11、抗体15、抗体16、抗体23和抗体24在小鼠体内均能有效地抑制肿瘤细胞的生长，具有显著的抗肿瘤效应。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 瑞阳（苏州）生物科技有限公司
<120> 抗人CD47单克隆抗体及其应用
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Ala Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gly Val Thr Val Tyr Arg Asp Ser Val
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Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Arg Ser Ser Leu His
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Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
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Ala Arg His Glu Tyr Ser Ser Tyr Val Tyr Trp Gly Gln Gly Val Leu
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His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
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1 5
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