一种分离土壤中抗花叶病毒细菌的工艺
阅读说明：本技术 一种分离土壤中抗花叶病毒细菌的工艺 (Process for separating anti-mosaic virus bacteria in soil ) 是由 张国基 张希兰 汤燕雯 赵甜 于 2019-10-16 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种分离土壤中抗花叶病毒细菌的工艺,包括以下步骤：(1)取1.0g土样,放入瓶内,加入无菌水,密封后震荡培养1-3h；(2)将步骤(1)中震荡培养后的溶液静置20-60min后,取上清液梯度稀释,混合均匀后每个浓度取80-120μL分别均匀涂布于培养基的平板上；(3)将平板在25-30℃恒温培养箱中培养15-20h；(4)取出培养后的平板,从中选择细菌菌落分布均匀的平板,挑取单斑放至2-5mL培养液中震荡培养10-20h,形成菌液。本发明公开了从不同生境(浅海海泥和烟草根际土壤)采集的样品中分离对花叶病毒病毒具有抑制作用的细菌,丰富抗病毒有益细菌的种类,并进一步简单测定抗病毒效果,为抗花叶病毒细菌的利用奠定了基础。(The invention discloses a process for separating mosaic virus-resistant bacteria in soil, which comprises the following steps: (1) taking 1.0g of soil sample, placing into a bottle, adding sterile water, sealing, and culturing for 1-3h with shaking; (2) standing the solution subjected to shake culture in the step (1) for 20-60min, taking supernatant for gradient dilution, uniformly mixing, and respectively uniformly coating 80-120 mu L of each concentration on a flat plate of a culture medium; (3) culturing the flat plate in a constant temperature incubator at 25-30 ℃ for 15-20 h; (4) and taking out the cultured plate, selecting a plate with uniformly distributed bacterial colonies from the plate, picking a single spot, placing the single spot into 2-5mL of culture solution, and performing shake culture for 10-20h to form a bacterial solution. The invention discloses a method for separating bacteria with inhibiting effect on mosaic virus from samples collected from different environments (shallow sea mud and tobacco rhizosphere soil), enriching the types of beneficial antiviral bacteria, further simply determining antiviral effect and laying a foundation for the utilization of the mosaic virus resisting bacteria.)
技术领域
本发明涉及微生物生态学技术领域，尤其涉及一种分离土壤中抗花叶病毒细菌的工艺。
背景技术
目前在病毒病害治理中主要采用抗病毒品种的选育、传毒媒介防控及交叉保护等方式，而针对植物病毒病的有效化学农药种类少，亟待农业科研人员去解决。花叶病毒(tobacco mosaic virus，TMV)是烟草花叶病等的病原体，具有广泛的寄主范围，可侵染十字花科、茄科和葫芦科等至少9个科125种植物，其发生频率高、流行快、为害重、难治理，一旦植物染病，无法得到有效的控制，极易引发病毒病的流行，造成严重的经济损失。每年因花叶病毒造成的经济损失高达数十亿美元。
目前已发现，有许多细菌和真菌及其代谢物质都具有一定钝化花叶病毒病毒粒子的能力，但如何分离抗花叶病毒细菌还没有较好的方法。植物病毒被细菌污染后其汁液会很快失去侵染活力，随后一些科研工作者开始致力于微生物及其代谢产物抗病毒活性的研究。因此，针对上述问题，有必要提出进一步地解决方案。
发明内容
本发明旨在提供一种分离土壤中抗花叶病毒细菌的工艺，以克服现有技术中存在的不足。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种分离土壤中抗花叶病毒细菌的工艺，包括以下步骤：
(1)取1.0g土样，放入瓶内，加入无菌水，密封后震荡培养1-3h；
(2)将所述步骤(1)中震荡培养后的溶液静置20-60min后，取上清液梯度稀释，混合均匀后每个浓度取80-120μL分别均匀涂布于培养基的平板上；
(3)将平板在25-30℃恒温培养箱中培养15-20h；
(4)取出培养后的平板，从中选择细菌菌落分布均匀的平板，挑取单斑放至2-5mL培养液中震荡培养10-20h，形成菌液；
(5)取1mL菌液，离心8-12min，取上清液与等体积花叶病毒接种液混合，室温静置15-30min形成混合液；
(6)取花叶病毒接种液与等体积磷酸盐缓冲溶液混合，室温静置15-30min形成对照混合液；
(7)以三生烟为实验材料，在三生烟叶片上均匀撒布石英砂，以三生烟叶的主脉为界限，轻轻摩擦混合液于半片叶片；另外半片叶片摩擦对照混合液；
(8)摩擦混合液和对照混合液15-30min后，用无菌水喷洒清洗叶片，室温条件下自然风干；
(9)温室中隔离培养2-4d，然后计数叶片上枯斑的数目，实验数据进行单因素方差分析，进行差异显著行分析，按照以下公式统计抗病毒效果：
花叶病毒。
优选地，所述步骤(1)中加入7-12mL无菌水。
优选地，所述步骤(1)和/或步骤(4)在25-30℃下以100-140rpm进行震荡。
优选地，所述步骤(2)中取上清液梯度稀释100、10-1、10-2、10-3、10-4和10-5。
优选地，所述培养基采用LB固体培养基。
优选地，所述培养液为LB液体培养基。
优选地，所述土样取自浅海海泥或烟草根际土壤。
优选地，所述三生烟在光照时长16h，光照强度2000lux，黑暗时长8h，温度25±1℃，相对湿度60％的条件下培养。
优选地，所述步骤(7)采用培养四周的三生烟。
优选地，所述花叶病毒接种液的制备方法包括以下步骤：
(1)取部分侵染花叶病毒的烟草叶，用10mmol/L、pH 7.4的磷酸盐缓冲液研磨、匀浆；
(2)将所述步骤(1)中产生的浆液用双层纱布过滤，并离心；
(3)取所述步骤(2)离心后的上清液，用聚乙二醇处理两次后再次离心；
(4)所述步骤(3)最终离心后，取其沉淀，用10mmol/L、pH 7.4的磷酸盐缓冲液重悬，即得到花叶病毒接种液。
优选地，花叶病毒接种液的制备在4℃条件下操作。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明公开了一种分离土壤中抗花叶病毒细菌的工艺，从不同生境(浅海海泥和烟草根际土壤)采集的样品中分离对花叶病毒病毒具有抑制作用的细菌，丰富抗病毒有益细菌的种类，并进一步简单测定抗病毒效果，为抗花叶病毒细菌的利用奠定了基础。
具体实施方式
连接词“由…组成”排除任何未指出的要素、步骤或组分。如果用于权利要求中，此短语将使权利要求为封闭式，使其不包含除那些描述的材料以外的材料，但与其相关的常规杂质除外。当短语“由…组成”出现在权利要求主体的子句中而不是紧接在主题之后时，其仅限定在该子句中描述的要素；其它要素并不被排除在作为整体的所述权利要求之外。
当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1至5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
单数形式包括复数讨论对象，除非上下文中另外清楚地指明。“任选的”或者“任意一种”是指其后描述的事项或事件可以发生或不发生，而且该描述包括事件发生的情形和事件不发生的情形。
实施例1：
本申请实施例中所用植物材料为花叶病毒的枯斑寄主三生烟(Nicotiana.tabacum cv.SunsamNN)，由本申请人留种繁殖，培养于温室中。植物培养条件：光照16h，温度25±1℃，光照强度2000lux，相对湿度60％；黑暗时长8h，温度25±1℃，相对湿度60％。所用营养基质由山东省寿光市沃德营养土加工厂生产，植物生长期间无需额外施肥。
花叶病毒毒源采集于山东省青岛市，并于温室中栽培的普通烟草NC89上繁殖保存。
土样分别采集自烟草根际土壤、浅海海泥。
花叶病毒接种液的制备：采用Gooding&Helbert(1967)方法并稍作改进制备花叶病毒溶液。取系统侵染花叶病毒的NC89上部新叶，用10mmol/L的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)研磨、匀浆；然后用双层纱布过滤，并离心(1000×g，20min)；取上清，用聚乙二醇处理两次。再次离心(10000×g，30min)后；沉淀用10mmol/L PBS缓冲液(pH 7.4)重悬，即得到花叶病毒接种液。整个操作需要在4℃条件下进行，然后用分光光度计测定260nm波长的吸光度值，根据公式计算病毒浓度。
病毒浓度(mg/mL)＝(A260×稀释倍数)/E0.1％ 1cm260nm
注：E为消光系数，即波长260nm时，浓度为0.1％(1mg/mL)的悬浮液在光程为1crn时的光吸收(光密度)值。花叶病毒的E0.1％ 1cm260nm为3.1，病毒母液浓度为10μg/mL。
一种分离土壤中抗花叶病毒细菌的工艺，包括以下步骤：
(1)取1.0g土样，放入无菌的锥形瓶内，加入9mL无菌水(超净台中操作)，密封后震荡培养2h(28℃,120rpm)。
(2)取出后，放在超净台中静置30min，取上清梯度稀释100、10-1、10-2、10-3、10-4和10-5，混匀后每个浓度取100μL均匀涂布在LB固体培养基的平板上。
(3)LB平板在28℃恒温培养箱中培养16h。
(4)取出，选择细菌菌落分布均匀(菌落数量适中)的平板，挑取单斑放至3mL LB液体培养基中震荡培养16h(28℃,120rpm)。
(5)取1mL菌液，6000×g离心10min，取上清与等体积花叶病毒接种液混合，室温静置20min。
(6)取花叶病毒接种液与等体积磷酸盐缓冲溶液混合，室温静置20min形成对照混合液；
(7)采用“半叶法”检测菌液的抗病毒效果：以培养4周的三生烟(NN)为实验材料，在三生烟叶片上均匀撒布石英砂，然后用无菌棉签蘸取混合液，以主脉为界限，轻轻摩擦于半片叶片；另外半片叶片摩擦对照组接种混合液；
(8)摩擦20min后，用无菌水喷洒清洗叶片，室温条件下自然风干；
(9)温室中隔离(远离健康烟)培养3d，然后计数叶片上枯斑的数目，实验数据用SPSS v18.0进行邓肯新复极差法进行单因素方差分析，进行差异显著行分析，按照以下公式统计抗病毒效果：
花叶病毒。
实施例2：
(1)取1.0g土样，放入无菌的锥形瓶内，加入11mL无菌水(超净台中操作)，密封后震荡培养3h(26℃,130rpm)。
(2)取出后，放在超净台中静置50min，取上清梯度稀释100、10-1、10-2、10-3、10-4和10-5，混匀后每个浓度取110μL均匀涂布在LB固体培养基的平板上。
(3)LB平板在26℃恒温培养箱中培养20h。
(4)取出，选择细菌菌落分布均匀(菌落数量适中)的平板，挑取单斑放至4mL LB液体培养基中震荡培养20h(26℃,130rpm)。
(5)取1mL菌液，6000×g离心10min，取上清与等体积花叶病毒接种液混合，室温静置25min。
(6)取花叶病毒接种液与等体积磷酸盐缓冲溶液混合，室温静置25min形成对照混合液；
(7)采用“半叶法”检测菌液的抗病毒效果：以培养4周的三生烟(NN)为实验材料，在三生烟叶片上均匀撒布石英砂，然后用无菌棉签蘸取混合液，以主脉为界限，轻轻摩擦于半片叶片；另外半片叶片摩擦对照组接种混合液；
(8)摩擦25min后，用无菌水喷洒清洗叶片，室温条件下自然风干；
其它步骤与实施例1相同。
综上所述，本发明公开了一种分离土壤中抗花叶病毒细菌的工艺，从不同生境(浅海海泥和烟草根际土壤)采集的样品中分离对花叶病毒病毒具有抑制作用的细菌，丰富抗病毒有益细菌的种类，并进一步简单测定抗病毒效果，为抗花叶病毒细菌的利用奠定了基础。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。