阅读说明：本技术 海藻糖作为保护剂在食用菌菌种液氮冷冻保存中的应用 (Application of trehalose as protective agent in liquid nitrogen cryopreservation of edible fungi ) 是由 孔维丽 崔筱 袁瑞奇 刘芹 张玉亭 康源春 孔维威 段亚魁 胡素娟 宋志波 徐柯 于 2019-10-08 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种海藻糖作为保护剂在食用菌菌种液氮冷冻保存中的应用,尤其是5%～10%海藻糖作为保护剂在食用菌菌种液氮冷冻保存中的应用,尤其是10%海藻糖作为保护剂在羊肚菌菌株、猴头菇菌株、鲍鱼菇菌株和木耳菌株液氮冷冻保存中的应用。本发明的优点在于充分利用海藻糖可在细胞表面形成保护膜的特性,将海藻糖作为保护剂用于食用菌菌种的液氮冷冻保存,海藻糖作为保护剂能够冷冻保存的菌种种类远远多于传统的甘油保护剂,适用菌种种类多。(The invention discloses an application of trehalose as a protective agent in liquid nitrogen cryopreservation of edible fungi, in particular an application of 5-10% of trehalose as a protective agent in liquid nitrogen cryopreservation of edible fungi, and in particular an application of 10% of trehalose as a protective agent in liquid nitrogen cryopreservation of morchella strains, hericium erinaceus strains, abalone mushroom strains and agaric strains. The invention has the advantages that the characteristic that trehalose can form a protective film on the cell surface is fully utilized, the trehalose is used as a protective agent for liquid nitrogen cryopreservation of edible fungus strains, the strain types which can be cryopreserved by taking the trehalose as the protective agent are far more than those of the traditional glycerol protective agent, and the invention is suitable for various strains.)

海藻糖作为保护剂在食用菌菌种液氮冷冻保存中的应用

技术领域

本发明涉及食用菌液氮保藏领域，尤其是涉及海藻糖作为保护剂在食用菌菌种液氮冷冻保存中的应用。

背景技术

在微生物领域，无论是基础科研还是生物技术的应用研究，都需要保证菌种的质量和活力，通过研究挖掘微生物的应用价值，让其不断“升值”。食用菌是可供人类食用的大型真菌，种类繁多，有2000余种，能大面积人工栽培的食用菌就有60余种。由于食用菌在使用和传代过程中容易发生污染、变异甚至死亡，导致造成菌种衰退，甚至导致优良菌种丢失，因而，常需要将菌种进行保藏，以尽可能保持其原有性状和稳定的活力，确保菌种不死亡、不变异、不被污染，保持菌株优良性状不退化，保持优良菌株存活，以满足研究、交换和使用等诸方面的需要。

目前，食用菌菌种的保藏方式主要有菌丝保藏法和孢子保藏法两种，因孢子保藏法较为复杂，在实际生产中常用菌丝保藏法。菌丝保藏法包括定期移植法、矿油封藏法、单子菌菌丝液体保藏法、甘油低温保藏法、冷冻真空干燥法和液态氮超低温冻结法等。液氮超低温冻结法是将保存的菌株密封在冻存管内，加入冷冻保护剂，冻存管预冷至-40℃后放入-196℃的液氮罐内，以实现菌种的长期保存。

液氮超低温冻结法能够适用于多种微生物，因而已经被国内外保藏机构所采用。对液氮低温冻结法来说，每种菌种冷冻保存后的存活率要求≥80%。冷冻保护剂是影响菌株冻存存活率的重要因素，甘油为食用菌菌株液氮冻存常用的保护剂，在保藏时需要经过程序降温后才能将菌种放入液氮罐内，否则根本无法保证菌种的成活率。同时甘油保护剂适用的菌种种类很少，难以满足不同菌种的液氮冷冻保存需求。

海藻糖是由两个葡萄糖分子以1,1-糖苷键构成的非还原性糖，是一种安全、可靠的天然糖类，广泛存在于动植物体和微生物体中，如人们日常食用的蘑菇类、海藻类、豆类、虾米、啤酒以及酵母发酵食品中均匀较高含量。海藻糖在高温、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下，可在细胞表面形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质分子不变性失活，从而维持生物体的生命特征，因而已被广泛用于食品保鲜技术和医疗领域，如在海鲜上喷洒海藻糖溶液于-16℃冷冻保存，不仅可以保证海鲜的硬度、伸缩性，还能够提高海鲜的口感，又比如海藻糖作为诊断工具酶等生物试剂的稳定剂，可将诊断工具酶置于常温条件或高温条件（70℃）干燥保存。但是将海藻糖作为食用菌菌种液氮冷冻保存用保护剂则在国内外尚未见报道。

发明内容

本发明目的在于针对现有技术所存在的不足而提供一种海藻糖的新用途：即海藻糖作为保护剂在食用菌菌种液氮冷冻保存方面的应用。

进一步的，本发明还提供：

5%～10%海藻糖作为保护剂在食用菌菌种液氮冷冻保存中的应用。

5%海藻糖和10%海藻糖作为保护剂在平菇菌株液氮冷冻保存中的应用。

10%海藻糖作为保护剂在羊肚菌菌株、猴头菇菌株、鲍鱼菇菌株和木耳菌株液氮冷冻保存中的应用。

10%海藻糖作为保护剂在香菇菌株、草菇菌株、白灵菇菌株、灵芝菌株和灰树花菌株液氮冷冻保存中的应用。

使用时，将待保藏的食用菌菌株放入冷冻管内，向冷冻管内加入海藻糖，盖盖密封后，直接将冷冻管放入-196℃液氮罐内冷冻保存。

本发明的优点在于充分利用海藻糖可在细胞表面形成保护膜的特性，将海藻糖作为保护剂用于食用菌菌种的液氮冷冻保存，海藻糖作为保护剂能够冷冻保存的菌种种类远远多于传统的甘油保护剂，适用菌种种类多。具体地，海藻糖作为保护剂不经过程序降温的情况，能够适用于平菇、木耳、金针菇、猴头菇、羊肚菌等菌种，与传统甘油保护剂相比，省略了程序降温步骤；海藻糖作为保护剂经程序降温冷冻后，特别适用于香菇、草菇、灵芝、灰树花等菌种的冷冻保存。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行详细说明，本发明所用的海藻糖和甘油均为市售产品，本发明所用的10%甘油和不同浓度的海藻糖均由水配制而成。

实施例1 海藻糖作为保护剂在平菇菌丝冷冻保存中的应用

本发明以黑平16-1（河南省农科院食用菌研究开发中心提供）、新831（河南省农科院食用菌研究开发中心提供）、黑抗650（河南省农科院食用菌研究开发中心提供）、苏引6号（河南省农科院食用菌研究开发中心提供）和农平4号（河南省农科院食用菌研究开发中心提供）五种平菇菌株为参试菌株，考察海藻糖作为保护剂对平菇菌株液氮冷冻保存后成活率的影响，包括以下步骤：

第一步，以水为对照，分别配制10%甘油、5%海藻糖和10%海藻糖三种保护剂，对配制好的保护剂进行高压灭菌，然后冷却至室温备用；

第二步，将每种平菇菌株的菌丝分别接种到PDA培养基中，25℃下培养至菌丝满皿，用打孔器（直径为0.5cm）在PDA培养基上取下100个母种菌丝块，每种平菇菌株的母种菌丝块分别放入20个冷冻管内（每个冷冻管内放入5个母种菌丝块），每5个冷冻管为一组，每组分别加入一种第一步中的保护剂并盖盖密封，保护剂的加入量均为850uL；

第三步，将密封后的冷冻管直接放入-196℃的液氮罐内低温冷藏6个月；

第四步，冷藏结束后，将冷冻管从液氮罐内取出，37℃水浴解冻10min，25℃静置24h，将每个冷冻管内的菌丝分别接种在PDA培养基中，每个冷冻管接种5皿，25℃培养，观察平菇菌丝的长势，菌丝长势用“+”表示，“+++”表明菌丝洁白长势较好，“++”菌丝长势好，“+”菌丝长势差，每种平菇菌株的成活率见表1。

表1 各保护剂对平菇菌株成活率的影响

结果表明，10%海藻糖作为保护剂，不经过程序降温直接液氮冷冻保存，不同平菇菌株的菌丝成活率均≥85%能够，满足平菇菌株的液氮冷冻保存要求，且略去了程序降温步骤，简化了保藏步骤；5%海藻糖作为保护剂不经过程序降温可用于除黑抗650外的四种平菇菌株的液氮冷冻保存；甘油作为保护剂，平菇菌株不经过降温程序直接液氮冷冻保存，平菇菌丝成活率为≤50%，因而甘油作为保护剂不能用于平菇菌株的直接冷冻保存；而仅添加水的五种平菇菌株成活率均为零。

实施例2 本发明分别以木耳（黑木耳1号，由黑龙江省农业科学院提供）、灵芝（黄山8号，由河南省农科院食用菌研究开发中心提供）、香菇（香菇856，由河南省农科院食用菌研究开发中心提供）、金针菇（金19，由河南省农科院食用菌研究开发中心提供）、羊肚菌（川羊肚菌1号，由四川省农业科学院提供）、鲍鱼菇（鲍鱼菇02，由河南省农科院食用菌研究开发中心提供）、灰树花（灰树花1号，由河南省农科院食用菌研究开发中心提供）、白灵菇（天山2号，由河南省农科院食用菌研究开发中心提供）和猴头菇（常山猴头菇，由河南省农科院食用菌开发中心提供）九种菌株为参试菌株，考察10%海藻糖作为保护剂对该九种菌株液氮冷冻保存后存活率的影响，包括以下步骤：

第一步，分别配制10%甘油和10%海藻糖，配制完成后对保护剂高压灭菌，然后冷却至室温备用；

第二步，将木耳、灵芝、香菇、金针菇、羊肚菌、鲍鱼菇、灰树花、白灵菇和猴头菇分别接种到PDA培养基中，25℃培养至菌丝长满培养皿，用0.5cm的打孔器从培养基上取下每种菌株的母种菌丝块，将每种菌株的母种菌丝块分别分装于20个无菌冷冻管内（每个冷冻管内装5个母种菌丝块），每10个无菌冷冻管为一组，一组冷冻管内加入850uL 的10%甘油而另一组冷冻管内加入850uL 的10%海藻糖，盖盖密封；

第三步，将密封后的冷冻管直接放入-196℃液氮罐内低温冷藏4～12个月；

第四步，冷藏结束后，将冷冻管从液氮罐内取出，37℃水浴解冻10min，然后25℃静置24h，将每个冷冻管内的菌丝分别接种在PDA培养基内，每个冷冻管接种5皿，25℃培养，观察每种菌株的菌丝长势，菌丝长势用“+”表示，“+++”表明菌丝洁白长势较好，“++”菌丝长势好，“+”菌丝长势差，各菌株的成活率见表2。

表2 海藻糖对不同食用菌菌株成活率的影响

结果表明，10%海藻糖作为保护剂无需程序降温，即可用于木耳、猴头菇、鲍鱼菇、金针菇以及羊肚菌的液氮冷冻保存，经液氮冷冻保存后的菌丝成活率均为100%；而10%甘油保护剂，不经程序降温仅可用于猴头菇、鲍鱼菇和木耳三种菌种的直接液氮冷冻保存，适用菌种少。

实施例3 本发明分别以灵芝（农灵1-1，由河南省农业科学院提供；黄山8号、红灵均由河南省农科院食用菌研究开发中心提供）、香菇（香菇856，香087，雨花3号和L808均由河南省农科院食用菌研究开发中心提供，豫香1号由河南省农业科学院提供）、白灵菇（白灵菇2号、天山2号均由河南省农科院食用菌研究开发中心提供，中农1号由中国农业科学院提供）、草菇（V23、V34、农草1号、银丝草菇、V58均由河南省农科院食用菌研究开发中心提供）和灰树花（灰树花1号，由河南省农科院食用菌研究开发中心提供）为参试菌株，考察程序降温对五种菌株液氮冷冻保存后存活率的影响，具体包括步骤：

第一步，分别配制10%甘油（对比）、10%海藻糖、以及10%甘油与10%海藻糖的混合保护剂（体积比为1:1），配制完成后对三种保护剂高压灭菌，然后冷却至室温备用；

第二步，将香菇、草菇、灵芝和灰树花三种菌株的菌丝分别接种到PDA培养基中，25℃培养至菌丝长满培养皿，用0.5cm的打孔器从培养基上取下每种菌株的母种菌丝块，将每种菌株的母种菌丝块分别分装于30个无菌冷冻管内（每个冷冻管内装5个母种菌丝块），每10个无菌冷冻管为一组，每组冷冻管分别加入一种第一步中的保护剂；

第三步，将密封后的冷冻管用程序降温仪降温，以液氮为降温媒介，每分钟降温1℃，冷冻管降温至-40℃后，再将冷冻管放入-196℃液氮罐内，冷冻保存冷藏6个月；

第四步，冷藏结束后，将冷冻管从液氮罐内取出，37℃水浴解冻10min，25℃静止24h，将每个冷冻管内的菌丝分别接种到PDA培养基中，每个冷冻管内的菌丝接种5皿，25℃培养，观察每种菌株的菌丝长势，菌丝长势用“+”表示，“+++”表明菌丝洁白长势较好，“++”菌丝长势好，“+”菌丝长势差，各菌株的成活率见表3。

表3 程序降温对各菌株成活率的影响

结果表明，10%海藻糖作为保护剂并结合程序降温，能够冷保藏香菇、草菇、灵芝、灰树花和白灵菇五种菌株，而以10%甘油作为保护剂，经过程序降温，依然不能用于草菇和灰树花的液氮冷冻保存。

由本发明实施例1-3可知，采用液氮冷冻保存食用菌菌株时，海藻糖作为保护剂适用的菌株种类明显多于甘油，并且海藻糖作为保护剂用于冷冻保存食用菌菌株的保藏效果明显优于甘油。