阅读说明：本技术 一种实时荧光定量pcr的数据分析方法 (Data analysis method of real-time fluorescence quantitative PCR ) 是由 高静 蔡亦梅 范东雨 张瑜 李洁昆 任鲁风 于 2019-03-27 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种实时荧光定量PCR的数据分析方法,包括：荧光信号的采集、指数区的确定、背景区的数据分析,阈值的确定,扩增曲线的获得。本发明的数据分析方法,采用线性回归拟合的算法,避免PCR的扩增效率不同产生的误差,简化实时PCR分析所涉及的计算,使荧光信号处理更准确、简便、快速,易于集成于便携式核酸分析系统。在必须进行小样本量核酸可靠检测时,优化的实时荧光定量PCR数据分析方法具有重要的意义。(The invention discloses a data analysis method of real-time fluorescence quantitative PCR, which comprises the following steps: collecting a fluorescence signal, determining an index region, analyzing data of a background region, determining a threshold value, and obtaining an amplification curve. The data analysis method of the invention adopts the algorithm of linear regression fitting, avoids errors caused by different amplification efficiencies of PCR, simplifies the calculation related to real-time PCR analysis, enables the fluorescence signal processing to be more accurate, simple, convenient and rapid, and is easy to integrate in a portable nucleic acid analysis system. When the reliable detection of nucleic acid with small sample size is required, the optimized real-time fluorescence quantitative PCR data analysis method has important significance.)

一种实时荧光定量PCR的数据分析方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及实时荧光定量PCR的数据分析方法。

背景技术

实时荧光定量聚合酶链反应（Real-Time PCR），是以聚合酶链反应（PCR）为基础的分子生物学实验技术，实时监控PCR过程中目标DNA分子的扩增，具有准确、灵敏度高、特异性强、简便快速及易于自动化等优点，被广泛应用于临床及生命科学等领域的核酸分子检测，如基因表达研究、传染病和癌症基因异常的检测、食品安全相关的微生物检测、植物病原体的检测、临床病毒感染的定量和基因分型等。

Real-Time PCR是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实现实时监测整个PCR过程，利用合适的数据分析方法，对起始模板进行定量分析。用于Real-Time PCR的荧光基团包括荧光染料和荧光探针。荧光染料与所有双链DNA PCR产物结合后发出荧光，每个循环的荧光强度被测量，从而检测PCR产物的量。荧光探针如TaqMan探针工作的基本原理是根据荧光共振能量传递（FRET）原理，荧光基团和淬灭剂距离很近使发射荧光被淬灭，当探针被DNA聚合酶降解时，两者分离，荧光发射出来被收集，特异性PCR产物被实时监测。

Real-Time PCR的扩增产物呈指数增长，扩增产物量的基本计算公式为：Y_n=X（1+E）ⁿ（Yn为第n个循环后的PCR产物量，X为起始模板量，E为扩增效率，n为扩增循环数）。扩增曲线分为基线期、指数增长期、线性增长期、平台期。

Real-Time PCR产物的定量测定可分为绝对定量和相对定量。绝对定量是用已知浓度的标准品绘制标准曲线推测未知样品的量。使用一系列稀释的已知浓度的标准品与样品同时进行测定，根据系列浓度标准品的阈值循环数（threshold cycle, Ct）与起始模板（DNA或RNA）量之间的线性比例关系，绘制标准曲线，根据待测样品的Ct值计算出其起始拷贝数。相对定量是使用内标，将待测样品与内标进行相同基因的表达比较，从而获得待测样品表达量的变化。

广泛使用的Real-Time PCR数据处理模式是假定样本与标准的扩增效率相同，并且在整个指数扩增期保持恒定，但在许多情况下并非如此。随着定量PCR仪的发展和改进，需要对PCR整个反应的每一个循环具体的荧光信号进行计算分析，使结果更加准确。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是实时荧光定量PCR仪改进后，样本与标准品扩增效率不同产生结果误差，提供一种优化的定量PCR数据分析方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

一种实时荧光定量PCR的数据分析方法，其特征在于，包括：荧光信号的采集、指数区的确定、背景区的数据分析，阈值的确定，扩增曲线的获得。

优选地，所述荧光信号的采集在延伸步骤完成，每个循环取最大值作为原始数据。

优选地，指数区的确定采用滑动窗口线性最小二乘法回归拟合算法分析。

优选地，背景区的数据分析采用线性回归拟合。

优选地，阈值的确定依赖于指数区的荧光信号值。

优选地，扩增曲线包括线性曲线和对数曲线。

优选地，数据分析方法用于DNA和RNA的扩增分析。

优选地，数据分析方法单独使用，或集成于实时荧光定量PCR仪器中使用。

本发明的有益效果在于：

本发明的实时荧光定量PCR的数据分析方法，可直接估计和比较样本和标准品的初始量，不需要假设PCR的扩增效率相等，简化了实时PCR分析所涉及的计算，使PCR反应每个循环的荧光信号采集处理更准确、简便、快速。在神经科学和医学诊断领域，必须进行小样本量可靠检测时，优化的数据分析方法具有重要的意义。

附图说明

图1是实时荧光定量PCR的扩增曲线。

具体实施方式

实施例 DNA样本荧光信号的实时定量PCR数据分析

1.荧光信号采集

对于四个梯度的模板扩增反应，每个反应取每个循环（cycle）的延伸时荧光信号最大值作为原始数据，共40个值。

2. 指数区的数据分析

1）将所有cycle荧光值取log值;

2）以滑动窗口（sliding window）为“4”开始，从第一个cycle开始至37个cycle进行线性最小二乘法回归拟合（linear least-squares regression fit），计算拟合所有线段的斜率（slope）和拟合优度（r²），选择最大斜率（greatest slope）和拟合优度r²大于0.99的线段。以滑动窗口为“5”，“6”，“7”，“8”，“9”，“10”，“11”，“12”等，循环进行回归拟合，直至找到含有最大滑动窗口，拟合优度r²大于0.99和最大斜率（greatest slope）的线段；

3) 选取拟合优度r²大于0.99，最大斜率（greatest slope），含有最长cycles（记为Ca-Cb cycle）数的线段作为指数区（Exponential Region）。

3.背景区的数据分析

1）背景区（Noise Region）的区域确定为1cycle到Ca-1 cycle；

2）将背景区的原始数据进行线性回归拟合，得到循环数x与背景（baseline）荧光值y的最佳拟合直线y=mx+b，得到背景值与cycle数的等式关系；

3）将等式带入每个cycle，计算baseline的数值，原始数据减去baseline值，得到每个 cycle的数据校正荧光值Rn。

4.扩增曲线及Ct的计算结果

1）将校正荧光值Rn与对应的cycle数做散点图，得到扩增曲线线性图Linear Plot；

2）将每个cycle的调整荧光值取对数log，荧光log值与对应的cycle数做散点图，得到扩增曲线图Log Plot；

3) 将Log 值以滑动窗口（sliding window）为“4”开始，从第一个cycle开始至37个cycle进行线性最小二乘法回归拟合，计算拟合所有线段的斜率（slope）a和拟合优度（r²），以滑动窗口为“5”，“6”，“7”，“8”，“9”，“10”，“11”，“12”等，循环进行回归拟合，选择最大斜率（greatest slope）和最佳拟合优度（r²）的线段，荧光值y与cycle数x的最佳拟合直线等式为y=ax+c，计算扩增效率E=10^a-1；

5）每一个稀释梯度的模板做一个反应，找出每个反应计算扩增效率的最佳拟合线段所包含的cycle数，得到每个反应相应cycle数的荧光Log值，把不同模板量的多个反应指数区所有cycle的荧光Log值取平均数作为阈值（Threshold）值；

6）根据Threshold值及每个反应拟合线段的等式计算Ct值。Ct值如表1。

表1

样本量	10<sup>7</sup>	10<sup>6</sup>	10<sup>5</sup>	10<sup>4</sup>
					Ct	18.77	22.32	26.28	29.69

以上所述的实施例只是本发明的优选实施方式，用于举例说明，对于本领域的技术人员在本发明的基础上所做的若干变形和改进，均属于本发明的保护范围。