阅读说明：本技术 用于治疗患有恶性血液病的患者的方法 (Method for treating a patient suffering from a hematological malignancy ) 是由 W·G·莱斯 J·M·曹 Y·洪 于 2018-02-21 设计创作，主要内容包括：本公开包括一种用于施用2,3-二氢-异吲哚-1-酮化合物或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物和/或前药以治疗血液癌症诸如急性骨髓性白血病(AML)的方法。本公开进一步涉及降低或抑制由野生型或突变Fms样酪氨酸激酶-3受体(FLT3)活化的细胞增殖。本公开进一步涉及一种抑制或降低有需要的受试者中的异常(例如过度表达)野生型或突变BTK活性或表达的方法。(The present disclosure includes a method for administering a 2, 3-dihydro-isoindol-1-one compound or a pharmaceutically acceptable salt, ester, solvate, and/or prodrug thereof for the treatment of hematological cancers, such as Acute Myeloid Leukemia (AML). The present disclosure further relates to reducing or inhibiting proliferation of cells activated by wild-type or mutant Fms-like tyrosine kinase-3 receptor (FLT 3). The present disclosure further relates to a method of inhibiting or reducing aberrant (e.g., overexpressed) wild-type or mutant BTK activity or expression in a subject in need thereof.)

用于治疗患有恶性血液病的患者的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年2月21日提交的美国临时申请号62/461,584和2017年10月30日提交的美国临时申请号62/578,948的优先权，所述美国临时申请的公开内容据此出于所有目的以引用的方式整体并入本文。

技术领域

本发明涉及用于治疗癌症诸如血液癌症的2,3-二氢-异吲哚-1-酮化合物或其药学上可接受的盐、酯、前药、水合物、溶剂合物和异构体，其中患者展现FLT3突变或野生型或突变形式的BTK。

发明背景

许多酪氨酸激酶已被证明是在许多癌症类型的情况下促进细胞存活的调控性通路的一部分。Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)基因是编码影响造血作用，从而导致血液病症和恶性肿瘤的膜结合型受体酪氨酸激酶的一个所述实例。

受体酪氨酸激酶FLT3可经受一系列突变，包括近膜区域中的活化性内部串联重复(ITD)和酪氨酸激酶结构域中的点突变，诸如在活化环残基D835处。FLT3是急性骨髓性白血病(AML)疗法的靶标，因为FLT3-ITD突变存在于约24％的AML患者中，并且它与极其不良预后相关联。参见C.Thiede等,Blood 2002,99,4326；P.D.Kottaridis等,Leukemia&lymphoma2003,44,905。然而，已在显示对FLT3抑制剂索拉非尼(sorafenib)或奎扎替尼(quizartinib)的抗性/复发的临床患者中鉴定的额外获得性FLT3突变，包括D835或“门卫”F691突变，可致使大多数FLT3抑制剂无效。参见C.H.Man等,Blood 2012,119,5133；C.C.Smith等,Nature 2012,485,260。另外报道的是其他并行促存活信号传导通路的异常上调可致使AML对FLT3靶向疗法具有抗性。参见W.Zhang等,Clin.Cancer Res.2014,20,2363。

因此，存在对将抑制获得FLT3突变的恶性血液病患者中的突变FLT3的治疗的需要。

另一酪氨酸激酶布鲁顿氏酪氨酸激酶(Bruton's tyrosine kinase，BTK)也被发现在血液癌症的情况下在调控细胞增殖方面具有功能重要性。BTK见于B细胞和造血细胞而非一些T细胞、天然杀伤细胞、浆细胞等中。当BTK受由各种炎症性应答或癌症引起的B细胞膜受体(BCR)信号刺激时，BTK在产生细胞因子诸如TNF-α、IL-6等方面，以及在通过引发下游信号传导诸如磷脂酶Cγ2(PLCγ)来产生NF-KB方面起重要作用。

在癌症治疗中，已知的是BTK修饰产生抗***信号的BCR和B细胞表面蛋白。因此，抑制BTK可导致针对与BCR信号传导相关的癌症诸如淋巴瘤的抗癌作用。BTK抑制剂作为消炎剂以及抗癌剂的作用机理充分描述于Nature Chemical Biology 2011,7,4中。

这些信号传导通路必须被精确调控。编码BTK的基因中的突变在人中导致称为X染色体连锁的无γ球蛋白血症(XLA)的遗传性B细胞特异性免疫缺陷疾病(Conley等,Annu.Rev.Immunol.27:199-227,2009)。异常BCR介导信号传导可导致B细胞活化调控异常，从而导致许多自体免疫和炎症性疾病。临床前研究显示BTK缺陷性小鼠对显现胶原诱导性关节炎具有抗性。此外，作为用以使成熟B细胞消减的CD20抗体的利妥星(Rituxan)的临床研究揭示B细胞在许多炎症性疾病诸如类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮和多发性硬化症中的关键作用(Gurcan等,Int.Immunopharmacol.9:10-25,2009)。因此，BTK抑制剂可用于治疗自体免疫和/或炎症性疾病。

此外，BTK的异常活化或过度表达在B细胞淋巴瘤的发病机理中起重要作用，从而指示抑制BTK适用于治疗恶性血液病(Davis等,Nature 463:88-92,2010)。初级临床试验结果显示BTK抑制剂伊布替尼(ibrutinib)(PCI-32765)有效治疗若干类型的B细胞淋巴瘤(例如第54届美国血液学协会(ASH)年会摘要，2012年12月：686The Bruton's TyrosineKinase(BTK)Inhibitor,ibrutinib(PCI-32765),Has Preferential Activity in theABC Subtype of Relapsed/Refractory De Novo Diffuse Large B-Cell Lymphoma(DLBCL):Interim Results of a Multicenter,Open-Label,Phase 1Study)。因为BTK作为介体在多个信号转导通路中起主要作用，所以BTK的抑制剂作为消炎剂和/或抗癌剂受到极大关注(Mohamed等,Immunol.Rev.228:58-73,2009；Pan,Drug News perspect 21:357-362,2008；Rokosz等,Expert Opin.Ther.Targets 12:883-903,2008；Uckun等,Anti-cancer Agents Med.Chem.7:624-632,2007；Lou等,J.Med.Chem.55(10):4539-4550,2012)。

伊布替尼以化学方式与BTK的活性位点中的半胱氨酸481残基相互作用，并且使BTK酶失活。然而，半胱氨酸481残基突变成丝氨酸残基(BTK-C481S)会导致对伊布替尼的抗性，并且BTK-C481S已在临床上观察到。这个特定点突变有效消除伊布替尼的靶标，由此使伊布替尼不能作为有效药物。在用伊布替尼治疗的CLL患者之中，以4年为标记，51％患者由于各种原因而中止对它的使用。举例来说，24％由于不耐受性、不利事件、感染或死亡而中止使用伊布替尼。27％的患者由于疾病进展(例如里希特氏综合征(Richter’s)、BTK-C481S突变、PLCγ2突变)而中止对它的使用，并且约1/3的中止使用伊布替尼的患者具有C481S突变。因此，有需要鉴定用于治疗难治性、不耐受性或抗性患者(包括具有突变形式的BTK的患者)的新型治疗剂，特别是通过与伊布替尼不同的机理来起作用的治疗剂。

现有治疗剂在靶标显示各种抗性表型的情形下通常是无效的。因此，所述癌症的存活预后不良。因此，重要的是开发显示对多种激酶靶标的亲和力的新型药物制剂，具体来说是能够双重抑制BTK和FLT3的那些。

发明内容

本公开涉及化合物7、其药学上可接受的盐、酯、前药、水合物、溶剂合物和异构体。

在一个实施方案中，本公开提供一种抑制或降低受试者中的野生型Fms相关激酶3(FLT3)活性或表达的方法，其包括向所述受试者施用化合物7或其药学上可接受的盐。在一个实施方案中，本公开提供一种抑制或降低受试者中的突变FLT3活性或表达的方法，其包括向所述受试者施用化合物7或其药学上可接受的盐。

在一个实施方案中，本公开提供一种抑制或降低人细胞中的野生型FLT3活性或表达的方法，其包括使化合物7或其药学上可接受的盐与所述人细胞接触。在另一实施方案中，本公开提供一种抑制或降低人细胞中的突变FLT3活性或表达的方法，其包括使化合物7或其药学上可接受的盐与所述人细胞接触。

在另一实施方案中，本公开提供一种在有需要的受试者中诱导表达野生型FLT3的细胞的凋亡的方法，其包括施用化合物7或其药学上可接受的盐。在一个实施方案中，本公开提供一种在有需要的受试者中诱导表达突变FLT3的细胞的凋亡的方法，其包括施用化合物7或其药学上可接受的盐。

在一个实施方案中，本公开提供一种治疗与野生型FLT3相关的恶性血液病的方法，其包括向有需要的受试者施用化合物7或其药学上可接受的盐。在一个实施方案中，方法抑制或降低野生型FLT3活性或表达。在另一实施方案中，本公开提供一种治疗与突变FLT3相关的恶性血液病的方法，其包括向有需要的受试者施用化合物7或其药学上可接受的盐。在一个实施方案中，方法抑制或降低突变体FLT3活性或表达。

在任一本文公开的方法的一个实施方案中，突变FLT3包含至少一个点突变。在一个实施方案中，至少一个点突变在一个或多个选自由以下组成的组的残基上：D835、F691、K663、R834、N841和Y842。在另一实施方案中，突变FLT3包含在D835处的至少一个突变。在另一实施方案中，突变FLT3包含在F691处的至少一个突变。在一个实施方案中，突变FLT3包含在K663处的至少一个突变。在另一实施方案中，突变FLT3包含在N841处的至少一个突变。在另一实施方案中，突变FLT3包含在R834处的至少一个突变。在另一实施方案中，突变FLT3包含在Y842处的至少一个突变。

在任一本文公开的方法的一个方面，至少一个点突变在FLT3的酪氨酸激酶结构域中。在另一实施方案中，至少一个点突变在FLT3的活化环中。在一个实施方案中，至少一个点突变在一个或多个选自由以下组成的组的氨基酸残基位置上：686、687、688、689、690、691、692、693、694、695和696。在一个实施方案中，突变FLT3具有额外ITD突变。在一个实施方案中，突变FLT3具有一个或多个选自由以下组成的组的突变：FLT3-D835H、FLT3-D835V、FLT3-D835Y、FLT3-ITD-D835V、FLT3-ITD-D835Y、FLT3-ITD-D835H、FLT3-F691L、FLT3-ITD-F691L、FLT3-K663Q、FLT3-ITD-K663Q、FLT3-N841I、FLT3-ITD-N841I、FLT-3R834Q、FLT3-ITD-834Q、FLT3-D835G、FLT3-ITD-D835G、FLT3-Y842C和FLT3-ITD-Y842C。

在任一本文公开的方法的一个实施方案中，至少一个点突变是两个或更多个存在于同一等位基因上的点突变。在一个实施方案中，至少一个点突变是两个或更多个存在于不同等位基因上的点突变。

在任一本文公开的方法的一个实施方案中，受试者是哺乳动物。在另一实施方案中，受试者是人。

在用于抑制或降低人细胞中的野生型FLT3或突变FLT3活性或表达的任何本文公开的方法的一个实施方案中，所述人细胞是人白血病细胞系。在一个方面，人白血病细胞系是急性淋巴细胞性白血病细胞系、急性骨髓性白血病细胞系、急性早幼粒细胞性白血病细胞系、慢性淋巴细胞性白血病细胞系、慢性骨髓性白血病细胞系、慢性中性粒细胞性白血病细胞系、急性未分化白血病细胞系、间变性大细胞淋巴瘤细胞系、前淋巴细胞性白血病细胞系、青少年髓单核细胞性白血病细胞系、成人T细胞急性淋巴细胞性白血病细胞系、伴有三系骨髓发育不良的急性骨髓性白血病细胞系、混合谱系白血病细胞系、嗜酸粒细胞性白血病细胞系或套细胞淋巴瘤细胞系。在一个方面，人白血病细胞系是嗜酸粒细胞性白血病细胞系。在一个实施方案中，人白血病细胞系是急性骨髓性白血病细胞系。

在用于治疗与野生型FLT3或突变FLT3活性或表达相关的恶性血液病的任何本文公开的方法的一个实施方案中，所述恶性血液病是白血病。在另一实施方案中，白血病是急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、急性早幼粒细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性中性粒细胞性白血病、急性未分化白血病、间变性大细胞淋巴瘤、前淋巴细胞性白血病、青少年髓单核细胞性白血病、成人T细胞急性淋巴细胞性白血病、伴有三系骨髓发育不良的急性骨髓性白血病、混合谱系白血病、嗜酸粒细胞性白血病或套细胞淋巴瘤。在另一实施方案中，白血病是嗜酸粒细胞性白血病。在另一实施方案中，白血病是急性骨髓性白血病。

在一个实施方案中，本公开提供一种治疗有需要的受试者的恶性血液病的方法，其包括施用化合物7或其药学上可接受的盐，其中所述受试者显示对FLT3活性或表达的抑制剂的抗性或复发。在一个实施方案中，抑制剂是奎扎替尼、吉列替尼(gilteritinib)、舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼、米哚妥林(midostaurin)、来他替尼(lestaurtinib)、克瑞兰尼(crenolanib)、PLX3397、PLX3623、克瑞兰尼、泊那替尼(ponatinib)或帕克替尼(pacritinib)。在另一实施方案中，抑制剂是奎扎替尼或吉列替尼。

在一个实施方案中，恶性血液病是白血病。在其他实施方案中，白血病是急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、急性早幼粒细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性中性粒细胞性白血病、急性未分化白血病、间变性大细胞淋巴瘤、前淋巴细胞性白血病、青少年髓单核细胞性白血病、成人T细胞急性淋巴细胞性白血病、伴有三系骨髓发育不良的急性骨髓性白血病、混合谱系白血病、嗜酸粒细胞性白血病或套细胞淋巴瘤。在一特定实施方案中，白血病是嗜酸粒细胞性白血病。在另一特定实施方案中，白血病是急性骨髓性白血病。

在一个实施方案中，本公开提供一种抑制或降低有需要的受试者中的异常(例如过度表达)野生型或突变BTK活性或表达的方法，其包括施用化合物7或其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，突变BTK包含至少一个点突变。举例来说，至少一个点突变可在半胱氨酸残基上(例如所述半胱氨酸残基在BTK的激酶结构域中)。受试者可为哺乳动物，例如人。在某些实施方案中，至少一个点突变在一个或多个选自由以下组成的组的残基上：残基E41、P190和C481。举例来说，点突变可为一个或多个选自由以下组成的组的点突变：E41K、P190K和C481S。在一个实施方案中，在残基C481处的点突变选自C481S、C481R、C481T和/或C481Y。

在某些实施方案中，BTK突变体对由共价BTK抑制剂(例如伊布替尼和/或阿卡替尼(acalabrutinib)或其他共价BTK抑制剂)达成的抑制具有抗性。在一个实施方案中，由共价不可逆BTK抑制剂对突变BTK的活性的抑制小于由共价不可逆BTK抑制剂对野生型BTK的活性的抑制。举例来说，共价不可逆BTK抑制剂对突变BTK具有的IC50比对野生型BTK具有的IC50高至少50％。在某些实施方案中，BTK突变体对由非共价BTK抑制剂达成的抑制具有抗性。在某些实施方案中，BTK突变体对由非共价BTK抑制剂达成的抑制具有抗性。

在一个实施方案中，半胱氨酸上的点突变在BTK的仅一个等位基因上。在另一实施方案中，半胱氨酸上的点突变在BTK的两个等位基因上。

在一个实施方案中，本公开提供一种用于治疗有需要的受试者的癌症的方法，其包括向有需要的受试者施用化合物7或其药学上可接受的盐，其中患者具有野生型(例如过度表达野生型)或突变形式的BTK。

在一个实施方案中，本公开提供一种治疗有需要的受试者的B细胞恶性肿瘤的方法，其包括向所述受试者施用化合物7或其药学上可接受的盐。在一个实施方案中，化合物7抑制BTK、ERK、FLT3、AURK或AKT的通路活化。在一个实施方案中，受试者具有突变形式的BTK。举例来说，B细胞恶性肿瘤选自由以下组成的组中的一者或多者：套细胞淋巴瘤(MCL)、B细胞急性淋巴母细胞性白血病(B-ALL)、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。在某些实施方案中，化合物7抑制和/或降低Aurora激酶的任何形式(野生型或突变)的活性。在一个实施方案中，Aurora激酶是突变Aurora激酶。在一个实施方案中，施用化合物7会诱导通过诸如凋亡的机理来达成的细胞死亡。在另一实施方案中，施用化合物7会诱导多倍性、自体吞噬、细胞周期阻滞或其他非凋亡形式的细胞死亡。在一实施方案中，化合物7抑制和/或降低野生型和/或突变体BTK的活性或表达。突变BTK包含至少一个点突变，例如在半胱氨酸残基(例如残基C481)上。

在一些实施方案中，化合物7抑制和/或降低受试者中的野生型Fms相关酪氨酸激酶3(FLT3)活性或表达。在其他实施方案中，化合物7抑制和/或降低受试者中的突变体Fms相关酪氨酸激酶3(FLT3)活性或表达。突变体FLT3可包含至少一个点突变。举例来说，至少一个点突变在一个或多个选自由以下组成的组的残基上：D835、F691、K663、Y842和N841。突变FLT3可具有在一个或两个等位基因中的额外ITD突变。

在一个实施方案中，本公开提供一种抑制或降低人细胞中的异常(例如过度表达)野生型或突变BTK活性或表达的方法，其包括使化合物7或其药学上可接受的盐与所述人细胞接触。突变BTK可包含至少一个点突变。在一个实施方案中，至少一个点突变在半胱氨酸残基上。在一个实施方案中，半胱氨酸残基在BTK的激酶结构域中。至少一个点突变在一个或多个选自由以下组成的组的残基上：残基E41、P190和C481。在一个实施方案中，在残基半胱氨酸481处的点突变选自C481S、C481R、C481T和/或C481Y。

应了解前述构思和在以下更详细讨论的额外构思的所有组合(前提是所述构思不互相不协调)都被涵盖为本文公开的发明主题的一部分。特定来说，在本公开的结尾处出现的所要求保护的主题的所有组合都被涵盖为本文公开的发明主题的一部分。也应了解也可在以引用的方式并入本文的任何公开中出现的本文明确采用的术语应被给予与本文公开的特定构思最为一致的含义。

附图说明

图1是蛋白质印迹图像，其显示化合物7以类似于奎扎替尼以及不同于伊布替尼的方式抑制MV4-11细胞中的FLT3通路。

图2是蛋白质印迹图像，其显示化合物7在0.5、5.0和50nM处理量下抑制MV4-11细胞中的BTK通路，并且结果与由伊布替尼处理而观察到的结果一致。

图3是蛋白质印迹图像，其显示化合物7在0.5、5.0和50nM处理量下抑制EOL-1细胞中的BTK通路，并且结果与由伊布替尼处理而观察到的结果一致。

图4以剂量-响应曲线形式显示化合物7、伊布替尼和奎扎替尼对FLT3-ITD(MV411和MOLM-13)和FLT3-WT(NOMO-1和KG-1)细胞的细胞毒性作用的比较，以及显示相应IC₅₀值。

图5显示通过采用静脉内方式、口服混悬液或口服胶囊以多种施用途径来在各种剂量下提供的化合物7的平均血浆浓度的大鼠药物动力学数据。

图6呈现历经22天时期在若干不同剂量下给与的化合物7的功效的小鼠异种移植物模型研究，与历经相同时期在单一剂量下给与的对照和伊布替尼进行比较。图6证明当相较于对照或伊布替尼治疗时，化合物7以增加的剂量使肿瘤体积降低。

图7显示在0.5、5.0和50nM化合物7、伊布替尼和奎扎替尼处理的情况下的早期凋亡细胞、总凋亡细胞和活细胞。

图8是蛋白质印迹图像(顶部)和膜联蛋白V测定(底部)，其显示相较于伊布替尼和奎扎替尼处理，化合物7诱导MV4-11细胞的凋亡。

图9是蛋白质印迹图像，其显示化合物7在HEK293T经转染细胞中使各种酶的磷酸化形式降低。野生型形式的BTK与C481S突变形式的BTK两者均由化合物7在0.5μM与1.0μM两种浓度下抑制。

图10显示蛋白质印迹图像，其显示化合物7抑制BTK。显示的是1小时和24小时时间点。

图11显示化合物7和伊布替尼针对各种细胞系的剂量-响应曲线。

图12显示化合物7诱导Mino和Ramos B细胞恶性细胞系的细胞凋亡。

图13显示化合物7是一种高度强力Aurora激酶抑制剂。从顶部至底部，细胞系是：Mino、Ramos和SU-DHL6。

图14显示化合物7诱导Mino和Ramos B细胞恶性细胞系中的多倍性。竖直线区分具有正常DNA含量的细胞和具有多倍性的细胞。在竖直线的左侧，细胞含有正常DNA含量(<＝4N)，并且处于细胞周期的G0/G1、S或G2/M时期。在竖直线的右侧，细胞不经受M时期，并且积累较高量的DNA(>4N)，从而表明具有多倍性。

图15显示化合物7在各种血细胞系的情况下的细胞毒性的剂量-响应曲线。

图16显示化合物7、奎扎替尼、吉列替尼和克瑞兰尼针对用各种FLT3突变体(所指示)转染的同基因Ba/F3细胞的剂量-响应曲线。

图17A-图17J显示化合物7以时间依赖性方式诱导MV4-11细胞的凋亡。图17A表示仅MV4-11细胞的膜联蛋白V测定。图17B表示用媒介物处理的MV4-11细胞在1小时时的膜联蛋白V测定。图17C表示用媒介物处理的MV4-11细胞在3小时时的膜联蛋白V测定。图17D表示用媒介物处理的MV4-11细胞在6小时时的膜联蛋白V测定。图17E表示用媒介物处理的MV4-11细胞在24小时时的膜联蛋白V测定。图17F表示用化合物7处理的MV4-11细胞在1小时时的膜联蛋白V测定。图17G表示用化合物7处理的MV4-11细胞在3小时时的膜联蛋白V测定。图17H表示用化合物7处理的MV4-11细胞在6小时时的膜联蛋白V测定。图17I表示用化合物7处理的MV4-11细胞在24小时时的膜联蛋白V测定。图17J表示处于晚期凋亡状态、早期凋亡状态或活体状态的细胞的百分比的图(CG＝化合物7)。

图18显示化合物7以剂量依赖性方式诱导MV411细胞中的G0/G1细胞周期阻滞。图18A是在不同浓度下处于G0/G1状态、S状态或G2/M状态的MV4-11细胞的百分比的图示。图18B显示流式细胞图，其中y轴表示5-乙炔基-2′-脱氧尿苷(EdU)荧光，并且x轴表示经碘化丙锭染色细胞。

图19显示化合物7以剂量依赖性方式诱导MOLM-13细胞中的G0/G1细胞周期阻滞。竖直线区分具有正常DNA含量的细胞和具有多倍性的细胞。在竖直线的左侧，细胞含有正常DNA含量(<＝4N)，并且处于细胞周期的G0/G1、S或G2/M时期。在竖直线的右侧，细胞不经受M时期，并且积累较高量的DNA(>4N)，从而表明具有多倍性。

图20A显示流式细胞图，其中y轴表示5-乙炔基-2′-脱氧尿苷(EdU)荧光，并且x轴表示经碘化丙锭染色细胞。图20B显示化合物7诱导各种血细胞系中的多倍性(图20)。竖直线区分具有正常DNA含量的细胞和具有多倍性的细胞。在竖直线的左侧，细胞含有正常DNA含量(<＝4N)，并且处于细胞周期的G0/G1、S或G2/M时期。在竖直线的右侧，细胞不经受M时期，并且积累较高量的DNA(>4N)，从而表明具有多倍性。

图21显示发现化合物7以剂量依赖性方式诱导KG-1细胞中的细胞周期调控异常。竖直线区分具有正常DNA含量的细胞和具有多倍性的细胞。在竖直线的左侧，细胞含有正常DNA含量(<＝4N)，并且处于细胞周期的G0/G1、S或G2/M时期。在竖直线的右侧，细胞不经受M时期，并且积累较高量的DNA(>4N)，从而表明具有多倍性。

图22显示发现化合物7以剂量依赖性方式诱导NOMO-1细胞中的细胞周期调控异常。竖直线区分具有正常DNA含量的细胞和具有多倍性的细胞。在竖直线的左侧，细胞含有正常DNA含量(<＝4N)，并且处于细胞周期的G0/G1、S或G2/M时期。在竖直线的右侧，细胞不经受M时期，并且积累较高量的DNA(>4N)，从而表明具有多倍性。

图23显示发现化合物7以剂量依赖性方式诱导具有各种FLT3突变(所指示)的同基因BA/F3细胞中的细胞周期调控异常。

图24显示相对于Aurora激酶抑制剂AT928，化合物7抑制MV4-11细胞中的Aurora激酶活性和信号传导，如以蛋白质印迹征象所指示。

图25显示相对于伊布替尼和奎扎替尼，根据所指示蛋白质印迹征象，化合物7抑制FLT-3WT细胞(KG-1)中的Aurora激酶活性(A)和信号传导(B)。

图26显示化合物7抑制EOL-1细胞中的PDGFRA和FLT3(WT)信号传导。

图27显示化合物7干扰RAMOS细胞中的细胞周期进展。竖直线区分具有正常DNA含量的细胞和具有多倍性的细胞。在竖直线的左侧，细胞含有正常DNA含量(<＝4N)，并且处于细胞周期的G0/G1、S或G2/M时期。在竖直线的右侧，细胞不经受M时期，并且积累较高量的DNA(>4N)，从而表明具有多倍性。

图28显示化合物7干扰Mino、RAMOS、GRANTA-519和SU-DHL-6细胞中的细胞周期进展。竖直线区分具有正常DNA含量的细胞和具有多倍性的细胞。在竖直线的左侧，细胞含有正常DNA含量(<＝4N)，并且处于细胞周期的G0/G1、S或G2/M时期。在竖直线的右侧，细胞不经受M时期，并且积累较高量的DNA(>4N)，从而表明具有多倍性。

图29显示相对于伊布替尼，化合物7抑制Ramos细胞中的BTK和Aurora激酶活性。

图30显示相对于伊布替尼，化合物7影响Ramos细胞中的BCR信号传导。

图31显示化合物7在高血清浓度下保留高活性。

具体实施方式

在一个实施方案中，本公开提供一种用2,3-二氢-异吲哚-1-酮化合物或其药学上可接受的盐、酯、前药、水合物、溶剂合物和异构体抑制或降低野生型或突变Fms相关酪氨酸激酶(FLT3)的方法，所述2,3-二氢-异吲哚-1-酮化合物或其药学上可接受的盐、酯、前药、水合物、溶剂合物和异构体用于治疗由这个激酶的异常活化驱动的癌症诸如血液癌症。此外，鉴于关于治疗与BTK相关，特别是与突变BTK(例如C481S BTK)相关的B细胞恶性肿瘤的前述挑战，发现化合物7针对B细胞恶性细胞系具有惊人细胞毒性；常规治疗剂(例如伊布替尼)针对所述B细胞恶性细胞系中的许多具有少许乃至不具有作用。不同于其他常规治疗剂(例如伊布替尼)，化合物7的作用机理据信是通过与BTK的非共价结合相互作用来达成，此有助于防止BTK蛋白的抗性。因此，在一个实施方案中，本公开提供一种抑制或降低有需要的受试者中的异常(例如过度表达)野生型或突变BTK活性或表达的方法，其包括施用化合物7或其药学上可接受的盐。此外，化合物7抑制在B细胞恶性肿瘤的情况下起作用的不受伊布替尼影响的额外激酶(AURK、c-Src以及其他激酶)。

定义

应了解本文所用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并且不意图具有限制性。

除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与本申请所属领域中的普通技术人员通常理解相同的含义。尽管与本文所述的那些方法和材料类似或等效的任何方法和材料都可用于实施或测试本申请，但本文描述代表性方法和材料。

在整篇本说明书中提及“一个实施方案”或“一实施方案”意指与所述实施方案关联描述的特定特征、结构或特性被包括在至少一个实施方案中。因此，短语“在一个实施方案中”或“在一实施方案中”在整篇本说明书中在各种地方出现未必全都涉及同一实施方案。此外，特定特征、结构或特性可以任何适合方式组合在一个或多个实施方案中。此外，除非内容另外明确规定，否则如本说明书和随附权利要求中所用，单数形式“一个(种)(a/an)”和“这个(种)(the)”包括复数个(种)指示物。也应注意除非内容另外明确规定，否则术语“或”通常以它的包括“和/或”的意义加以采用。

除非另外指示，否则说明书和权利要求中使用的表述成分的数量、反应条件等的所有数值都应被理解为在所有情况下都由术语“约”加以修饰。因此，除非相反指示，否则本说明书和随附权利要求中阐述的数值参数是可视为本申请所设法获得的所需性质而变化的近似值。

在整篇本说明书中，提供某些数量的数值范围。应了解这些范围包括其中所有子范围。因此，范围“从50至80”包括其中所有可能范围(例如51-79、52-78、53-77、54-76、55-75、60-70等)。此外，给定范围内的所有值都可为由此涵盖的范围的端点(例如范围50-80包括具有各种端点的范围诸如55-80、50-75等)。

化合物7是指1-{3-氟-4-[7-(5-甲基-1H-咪唑-2-基)-1-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-4-基]-苯基}-3-(2,4,6-三氟苯基)脲，并且具有以下结构：。

本发明也包括化合物7的其药学上可接受的盐、酯、前药、水合物、溶剂合物和异构体。

“药学上可接受的盐”包括酸加成盐与碱加成盐两者。

化合物7的药学上可接受的盐可为由无机酸或有机酸获得的“药学上可接受的酸加成盐”，并且所述盐可为含有阴离子的药学上可接受的无毒酸加成盐。举例来说，盐可包括通过以下各物来形成的酸加成盐：无机酸，诸如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、氢溴酸、氢碘酸等；有机含碳酸，诸如酒石酸、甲酸、柠檬酸、乙酸、三氯乙酸、三氟乙酸、葡萄糖酸、苯甲酸、乳酸、反丁烯二酸、顺丁烯二酸等；以及磺酸，诸如甲烷磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、萘磺酸等。

化合物7的药学上可接受的盐可通过本领域中熟知的常规方法来制备。具体来说，本发明的“药学上可接受的盐”可通过例如以下方式来制备：将化合物7溶解于水混溶性有机溶剂诸如丙酮、甲醇、乙醇或乙腈等中；向其中添加过量有机酸或无机酸水溶液；使由此获得的混合物沉淀或结晶。此外，它可通过从其进一步蒸发溶剂或过量酸；接着使混合物干燥或通过使用例如抽吸过滤器过滤萃取物来制备。

如本文所用的术语“酯”是指具有化学结构-(R)_n-COOR'的化学部分，其中除非另外指示，否则R和R'各自独立地选自由以下组成的组：烷基、环烷基、芳基、杂芳基(通过芳族环来连接于氧原子)和杂脂环(通过芳族环来连接)，并且n是0或1。

如本文所用的术语“前药”是指将在体内经受代谢活化以产生母体药物的前体化合物。前药经常是适用的，因为在一些情况下，它们相较于其母体药物可易于施用。举例来说，不同于其母体药物经常显示不良生物可用性，一些前药可通过口服施用来达成生物可用。此外，相较于其母体药物，前药可显示在药物组合物中改进的溶解性。举例来说，化合物7可以酯前药形式施用以便使药物递送效率增加，因为药物的溶解性可不利地影响跨细胞膜可透性。接着，一旦呈酯前药形式的化合物进入靶标细胞，它即可被代谢水解成羧酸和活性实体。

化合物7的水合物或溶剂合物被包括在本发明的范围内。如本文所用，“溶剂合物”意指通过溶合(溶剂分子与本发明的活性剂的分子或离子的组合)来形成的复合物，或由溶质离子或分子(本发明的活性剂)与一个或多个溶剂分子一起组成的聚集物。溶剂可为水，在所述情况下，溶剂合物可为水合物。水合物的实例包括但不限于半水合物、单水合物、二水合物、三水合物、六水合物等。本领域普通技术人员应了解本发明化合物的药学上可接受的盐也可以溶剂合物形式存在。溶剂合物通常通过水合来形成，所述水合是制备本发明化合物的一部分或通过由本发明的无水化合物天然吸湿来达成。包括水合物的溶剂合物可处于各种化学计量比率，例如每个溶剂合物或每个水合物分子具有两个、三个、四个盐分子。另一可能性例如是两个盐分子与三个、五个、七个溶剂或水合物分子化学计量相关。用于结晶的溶剂，诸如醇，尤其是甲醇和乙醇；醛；酮，尤其是丙酮；酯，例如乙酸乙酯；可被包埋在晶栅中，特别是药学上可接受的溶剂。

本公开化合物或它们的药学上可接受的盐可含有一个或多个手性轴，以致阻转异构是可能的。阻转异构体是由于围绕单键的旋转受阻而产生的立体异构体，其中归因于立体张力或其他促进因素的能量差异产生足够高以允许分离个别构象异构体的旋转屏障。本公开意图包括所有所述可能的异构体以及它们的外消旋和光学纯形式，无论它们是否在本文中加以明确描绘。光学活性异构体可使用手性合成子或手性试剂来制备，或使用常规技术例如色谱法和分级结晶来拆分。用于制备/分离个别阻转异构体的常规技术包括从适合光学纯前体进行手性合成，或使用例如手性高压液相色谱法(HPLC)来拆分外消旋物(或盐或衍生物的外消旋物)。

“立体异构体”是指由通过相同键加以键合的相同原子组成，但具有不可互换的不同三维结构的化合物。本发明涵盖各种立体异构体及其混合物，因为这属于阻转异构现象。

如本文所用，蛋白质激酶的异常活化意图包括导致疾病、病症或疾患的相异、异常、非典型、反常或不合常规的激酶性状。所述疾病、病症和疾患可包括癌症、与类风湿性关节炎和骨关节炎相关的炎症、哮喘、过敏、异位性皮炎或牛皮癣，但不限于这些。在癌症的情况下，疾病、病症和疾患的特征可在于细胞增殖不受控制。

引起癌症的异常活化的蛋白质激酶的特定实例包括但不限于ABL(Abelson酪氨酸激酶)、ACK(活化cdc42相关激酶)、AXL、Aurora、BLK(B淋巴细胞酪氨酸激酶)、RMX(骨髓X染色体连锁的激酶)、BTK(布鲁顿氏酪氨酸激酶)、CDK(周期素(Cyclin)依赖性激酶)、CSK(C-Src激酶)、DDR(盘状结构域受体)、EPHA(肝配蛋白(Ephrin)A型受体激酶)、FER(Fer(fps/fes相关)酪氨酸激酶)、FES(猫肉瘤致癌基因)、FGFR(纤维母细胞生长因子受体)、FGR、FLT(Fms样酪氨酸激酶)、FRK(Fyn相关激酶)、FYN、HCK(造血细胞激酶)、IRR(胰岛素受体相关受体)、ITK(白介素2诱导性T细胞激酶)、JAK(Janus激酶)、KDR(激酶***结构域受体)、KIT、LCK(淋巴细胞特异性蛋白质酪氨酸激酶)、LYN、MAPK(有丝***原(Mitogen)活化的蛋白质激酶)、MER(c-Mer原致癌基因酪氨酸激酶)、MET、MINK(Misshapen样激酶)、MNK(MAPK相互作用激酶)、MST(哺乳动物不育系20样激酶)、MUSK(肌肉特异性激酶)、PDGFR(血小板源性生长因子受体)、PLK(Polo样激酶)、RET(在转染期间重排的激酶)、RON、SRC(类固醇受体共活化子)、SRM(亚精胺合成酶)、TIE(具有免疫球蛋白和EGF重复的酪氨酸激酶)、SYK(脾酪氨酸激酶)、TNK1(非受体酪氨酸激酶1)、TRK(原肌凝蛋白(Tropomyosin)受体激酶)、TNIK(TRAF2和NCK相互作用激酶)等。

关于特定疾病或病症的术语“治疗(treat/treating/treatment)”包括预防所述疾病或病症，和/或减轻、改进、改善或消除所述疾病或病症的症状和/或病变。通常，如本文所用的所述术语是指改善、缓和、减轻和消除疾病或疾患的症状。本文化合物7可以治疗有效量处于制剂或药剂中，所述治疗有效量是例如可导致生物作用诸如某些细胞(例如癌细胞)的凋亡、某些细胞的增殖降低，或导致改善、缓和、减轻或消除疾病或疾患的症状的量。所述术语也可指使细胞增殖速率降低或停止(例如使肿瘤生长减缓或停止)或使增殖癌细胞的数目降低(例如消除肿瘤的一部分或全部)。

当如上所述的治疗是指预防疾病、病症或疾患时，所述治疗被称为是防治性的。所述防治剂的施用可发生在为增生性病症所特有的症状的表现之前，以使疾病或病症得以预防，或替代地，在它的进展方面得以延迟。

如本文所用，术语“抑制”或“降低”细胞增殖意图使如使用为本领域普通技术人员所知的方法测量的细胞增殖的量在相较于未经受本申请的方法、组合物和组合的增殖细胞时以例如10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％进行减缓、降低或例如停止。

如本文所用，术语“凋亡”是指内在细胞自我破坏或***程序。应答于触发刺激，细胞经受包括细胞收缩、细胞膜起泡以及染色质凝缩和碎裂的事件的级联。这些事件导致细胞向成簇的膜结合型粒子(凋亡体)转变，所述膜结合型粒子此后由巨噬细胞加以吞噬。

如本文所用，“多倍体”或“多倍性”是指细胞具有的染色体的数目大于通常二倍体数目(“2n”)而是单倍体数目(“n”)的某一倍数所处的状况。术语“多倍体细胞”或“多倍性细胞”是指处于多倍性状况下的细胞。换句话说，多倍体细胞或生物体具有的染色体数目是单倍体染色体数目的三倍或更多倍。在人中，通常单倍体染色体数目是23，并且通常二倍体染色体数目是46。

“哺乳动物”包括人以及家养动物诸如实验室动物和家居宠物(例如猫、狗、猪、牛、绵羊、山羊、马、兔)与非家养动物诸如野生生物等两者。如本文所用的术语“患者”或“受试者”包括人和动物。

“非哺乳动物”包括非哺乳动物无脊椎动物和非哺乳动物脊椎动物，诸如鸟(例如鸡或鸭)或鱼。

“药物组合物”是指本公开化合物和在本领域中被普遍接受用于向哺乳动物例如人递送生物活性化合物的介质的制剂。这种介质包括其所有药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

“有效量”是指治疗有效量或防治有效量。“治疗有效量”是指在必要剂量下以及持续必要时期，有效实现所需治疗结果的量，所述结果诸如肿瘤尺寸降低、寿命增加或预期寿命增加。化合物的治疗有效量可根据诸如受试者的疾病状态、年龄、性别和重量以及化合物在受试者中引发所需响应的能力的因素而变化。可调整剂量方案以提供最优治疗响应。治疗有效量也是其中治疗有益作用胜过化合物的任何毒性或有害作用的量。“防治有效量”是指在必要剂量下以及持续必要时期，有效实现所需防治结果的量，所述结果诸如肿瘤较小或细胞增殖较缓慢。通常，防治剂量在疾病之前或在疾病的较早阶段用于受试者中，因此，防治有效量可小于治疗有效量。

如本文所用的术语“布鲁顿氏酪氨酸激酶”或BTK是指来自智人的布鲁顿氏酪氨酸激酶，如例如美国专利号6,326,469中所公开(GenBank登录号NP 000052)。

如本文所用的术语“共价BTK抑制剂”是指与BTK反应以形成共价复合物的抑制剂。在一些实施方案中，共价BTK抑制剂是不可逆BTK抑制剂。

如本文所用的术语“非共价BTK抑制剂”是指与BTK反应以形成非共价复合物或相互作用的抑制剂。在一些实施方案中，非共价BTK抑制剂是可逆BTK抑制剂。

方法

在一些实施方案中，本公开提供一种抑制或降低受试者中的野生型或突变Fms相关酪氨酸激酶3(FLT3)活性或表达的方法，其包括向有需要的受试者施用化合物7或其药学上可接受的盐。在一个实施方案中，方法通过施用化合物7来抑制或降低有需要的受试者中的FLT3活性或表达。

Fms相关酪氨酸激酶3(FLT3)是指由FLT3基因编码的蛋白质。野生型FLT3是指呈非突变形式的蛋白质。FLT3可经受一系列突变，包括FLT3的近膜区域中的活化性内部串联重复(ITD)和酪氨酸激酶结构域或活化环中的点突变。当DNA序列中的单一碱基对被修饰时发生点突变。举例来说，F691L意图定义在位置691处的氨基酸从苯丙氨酸向亮氨酸的变化。

在一个实施方案中，突变FLT3具有额外ITD突变。在一个实施方案中，ITD突变与在FTD驱动的血液癌症诸如AML的情况下的极其不良预后相关联。

在任何本文公开的方法的另一实施方案中，突变FLT3包含至少一个点突变。在另一实施方案中，至少一个点突变在一个或多个选自由以下组成的组的氨基酸残基位置上：686、687、688、689、690、691、692、693、694、695和696。在另一实施方案中，突变FLT3具有一个或多个选自由以下组成的组的突变：FLT3-D835H、FLT3-D835V、FLT3-D835Y、FLT3-ITD-D835V、FLT3-ITD-D835Y、FLT3-ITD-D835H、FLT3-ITD-F691L、FLT3-K663Q、FLT3-N841I、FLT3-D835G、FLT3-Y842C和FLT3-ITD-Y842C。在其他实施方案中，至少一个点突变是两个或更多个在同一等位基因上或在不同等位基因上的点突变。

在任何本文公开的方法的一个实施方案中，至少一个点突变在氨基酸残基位置686上。在一个实施方案中，至少一个点突变在氨基酸残基位置687上。在一个实施方案中，至少一个点突变在氨基酸残基位置688上。在一个实施方案中，至少一个点突变在氨基酸残基位置689上。在一个实施方案中，至少一个点突变在氨基酸残基位置690上。在一个实施方案中，至少一个点突变在氨基酸残基位置691上。在一个实施方案中，至少一个点突变在氨基酸残基位置692上。在一个实施方案中，至少一个点突变在氨基酸残基位置693上。在一个实施方案中，至少一个点突变在氨基酸残基位置694上。在一个实施方案中，至少一个点突变在氨基酸残基位置695上。在一个实施方案中，至少一个点突变在氨基酸残基位置696上。在另一实施方案中，至少一个点突变在对应于任何残基686-696位置的氨基酸残基上。

在另一实施方案中，突变FLT3是FLT3-D835H。在另一实施方案中，突变FLT3是FLT3-D835V。在另一实施方案中，突变FLT3是FLT3-D835Y。在另一实施方案中，突变FLT3是FLT3-ITD-D835V。在另一实施方案中，突变FLT3是FLT3-ITD-D835Y。在另一实施方案中，突变FLT3是FLT3-ITD-D835H。在另一实施方案中，突变FLT3是FLT3-ITD-F691L。在另一实施方案中，突变FLT3是FLT3-K663Q。在另一实施方案中，突变FLT3是FLT3-N841I。在另一实施方案中，突变FLT3是FLT3-D835G、FLT3-Y842C和/或FLT3-ITD-Y842C。

FLT3是癌症疗法的一个靶标。与FLT3的异常活化相关的疾病、病症和疾患的实例包括由归因于FLT3中的突变而过度刺激FLT3所致的那些，或由归因于FLT3中的异常高量突变的异常高量FLT3活性所致的病症。在不束缚于任何理论下，FLT3的过度活性已牵涉于包括癌症的许多疾病的发病机理中。与FLT3的过度活性有关的癌症包括但不限于骨髓增生性病症，诸如血小板减少症、原发性血小板增多症(ET)、原因不明性髓样化生、骨髓纤维化(MF)、骨髓纤维化伴髓样化生(MMM)、慢性特发性骨髓纤维化(UIMF)以及真性红细胞增多症(PV)、血细胞减少症和恶化前骨髓异常增生综合征；癌症，诸如神经胶质瘤癌症、肺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、***癌、胃癌、食道癌、结肠癌、胰腺癌、卵巢癌和恶性血液病，包括骨髓发育不良、多发性骨髓瘤、白血病和淋巴瘤。

在一个实施方案中，本公开提供一种治疗与野生型FLT3相关的恶性血液病的方法，其包括向有需要的受试者施用化合物7或其药学上可接受的盐。在另一实施方案中，本公开提供一种治疗与突变FL T3相关的恶性血液病的方法，其包括向有需要的受试者施用化合物7或其药学上可接受的盐。

在任一本文公开的方法的一个实施方案中，恶性血液病的实例包括但不限于白血病、淋巴瘤、霍奇金氏病(Hodgkin's disease)和骨髓瘤。也包括急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、急性早幼粒细胞性白血病(APL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性中性粒细胞性白血病(CNL)、急性未分化白血病(AUL)、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、前淋巴细胞性白血病(PML)、青少年髓单核细胞性白血病(JMML)、成人T细胞ALL、伴有三系骨髓发育不良的AML(AMLITMDS)、混合谱系白血病(MLL)、骨髓异常增生综合征(MDS)、骨髓增生性病症(MPD)和多发性骨髓瘤(MM)。

在一个实施方案中，本公开提供一种治疗与野生型或突变FLT3相关的白血病的方法，其包括向有需要的受试者施用化合物7或其药学上可接受的盐。在一个实施方案中，白血病是AML。

在一个实施方案中，本公开提供一种用化合物7或其药学上可接受的盐抑制或降低人细胞中的野生型或突变FLT3活性或表达的方法。在另一实施方案中，本公开提供一种通过使化合物7与人细胞接触来抑制或降低所述人细胞中的突变FLT3活性或表达的方法。

在一个实施方案中，人细胞是人白血病细胞系。在另一实施方案中，人白血病细胞系是急性淋巴细胞性白血病细胞系、急性骨髓性白血病细胞系、急性早幼粒细胞性白血病细胞系、慢性淋巴细胞性白血病细胞系、慢性骨髓性白血病细胞系、慢性中性粒细胞性白血病细胞系、急性未分化白血病细胞系、间变性大细胞淋巴瘤细胞系、前淋巴细胞性白血病细胞系、青少年髓单核细胞性白血病细胞系、成人T细胞急性淋巴细胞性白血病细胞系、伴有三系骨髓发育不良的急性骨髓性白血病细胞系、混合谱系白血病细胞系、嗜酸粒细胞性白血病细胞系或套细胞淋巴瘤细胞系。

在特定实施方案中，人白血病细胞系是嗜酸粒细胞性白血病细胞系。在另一实施方案中，人白血病细胞系是急性骨髓性白血病细胞系。这两种血液癌症均已知是FLT3驱动的。在一个实施方案中，MV4-11、MUTZ-11、MOLM-13和PL-21是具有FLT3-ITD突变的急性骨髓性白血病细胞系。

治疗方法提供用于治疗处于显现由FLT3的异常激酶活性驱动的细胞增生性病症的风险下或易显现所述细胞增生性病症的受试者的防治方法与治疗方法两者。在一个实例中，本发明提供用于预防与FLT3相关的细胞增生性病症的方法，其包括向有需要的受试者施用防治有效量的化合物7或其药学上可接受的盐或包含化合物7的药物组合物。在一个实施方案中，防治性治疗可发生在为FLT3驱动的细胞增生性病症所特有的症状的表现之前，以使疾病或病症得以预防，或替代地，在它的进展方面得以延迟。

在一个实施方案中，本公开提供一种治疗有需要的受试者的恶性血液病的方法，其包括施用化合物7或其药学上可接受的盐，其中所述受试者显示对FLT3活性或表达的抑制剂的抗性或复发。在一个实施方案中，抑制剂是奎扎替尼、吉列替尼、舒尼替尼、索拉非尼、米哚妥林、来他替尼、克瑞兰尼、PLX3397、PLX3623、克瑞兰尼、泊那替尼或帕克替尼。在另一实施方案中，抑制剂是奎扎替尼或吉列替尼。

在一个实施方案中，恶性血液病是白血病。在其他实施方案中，白血病是急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、急性早幼粒细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性中性粒细胞性白血病、急性未分化白血病、间变性大细胞淋巴瘤、前淋巴细胞性白血病、青少年髓单核细胞性白血病、成人T细胞急性淋巴细胞性白血病、伴有三系骨髓发育不良的急性骨髓性白血病、混合谱系白血病、嗜酸粒细胞性白血病或套细胞淋巴瘤。在一特定实施方案中，白血病是嗜酸粒细胞性白血病。在另一特定实施方案中，白血病是急性骨髓性白血病。

在一个实施方案中，方法在有需要的受试者中诱导表达野生型FLT3的细胞的凋亡，包括向所述受试者施用化合物7或其药学上可接受的盐。在一个实施方案中，本公开提供一种在有需要的受试者中诱导表达突变FLT3的细胞的凋亡的方法，其包括施用化合物7或其药学上可接受的盐。

在另一实施方案中，方法包括用于治疗有需要的受试者的癌症的方法，其包括向有需要的受试者施用化合物7或其药学上可接受的盐，其中所述受试者具有突变形式的FLT3。在另一实施方案中，突变FLT3包含至少一个点突变。在另一实施方案中，至少一个点突变在一个或多个选自由以下组成的组的残基上：D835、F691、K663、Y842和N841。在另一实施方案中，突变FLT3包含在D835处的至少一个突变。在另一实施方案中，突变FLT3包含在F691处的至少一个突变。在另一实施方案中，突变FLT3包含在K663处的至少一个突变。在另一实施方案中，突变FLT3包含在N841处的至少一个突变。在另一实施方案中，至少一个点突变在FLT3的酪氨酸激酶结构域中。在另一实施方案中，至少一个点突变在FLT3的活化环中。在另一实施方案中，至少一个点突变在一个或多个选自由以下组成的组的氨基酸残基位置上：686、687、688、689、690、691、692、693、694、695和696。在另一实施方案中，突变FLT3是ITD突变。在另一实施方案中，突变FLT3包含至少一个点突变以及ITD突变。在另一实施方案中，突变FLT3具有一个或多个选自由以下组成的组的突变：FLT3-D835H、FLT3-D835V、FLT3-D835Y、FLT3-ITD-D835V、FLT3-ITD-D835Y、FLT3-ITD-D835H、FLT3-F691L、FLT3-ITD-F691L、FLT3-K663Q、FLT3-ITD-K663Q、FLT3-N841I、FLT3-ITD-N841I、FLT-3R834Q、FLT3-ITD-834Q、FLT3-D835G、FLT3-ITD-D835G、FLT3-Y842C和FLT3-ITD-Y842C。在另一实施方案中，至少一个点突变是两个或更多个存在于同一等位基因上的点突变。在另一实施方案中，至少一个点突变是两个或更多个存在于不同等位基因上的点突变。在另一实施方案中，受试者是哺乳动物。在另一实施方案中，受试者是人。在另一实施方案中，癌症是白血病。在另一实施方案中，白血病是急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、急性早幼粒细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性中性粒细胞性白血病、急性未分化白血病、间变性大细胞淋巴瘤、前淋巴细胞性白血病、青少年髓单核细胞性白血病、成人T细胞急性淋巴细胞性白血病、伴有三系骨髓发育不良的急性骨髓性白血病、混合谱系白血病、嗜酸粒细胞性白血病和/或套细胞淋巴瘤。在另一特定实施方案中，白血病是急性骨髓性白血病。

在一个实施方案中，本发明提供一种通过向有需要的受试者施用化合物7或其药学上可接受的盐来双重抑制或降低所述受试者中的激酶的活性或表达的方法。在另一实施方案中，双重抑制或降低活性或表达的方法是在受试者中针对突变Fms相关酪氨酸激酶3(FLT3)活性，以及联合抑制或降低布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)的活性或表达，包括施用化合物7或其药学上可接受的盐。在一个实施方案中，化合物7抑制或降低FLT3(包括野生型和突变FLT3)活性与BTK活性两者。靶向多激酶通路是一种可使在具有不良预后的癌症的情况下的效果改进的方法。

在一些实施方案中，本公开提供一种抑制或降低有需要的受试者中的异常(例如过度表达)野生型或突变BTK活性或表达的方法，其包括向所述受试者施用化合物7或其药学上可接受的盐。

在某些实施方案中，BTK是野生型的。在一个实施方案中，野生型BTK在受试者中是异常的(例如过度表达)。在另一实施方案中，野生型BTK在受试者中具有过度活性或是活性过度的。

在某些实施方案中，BTK是突变BTK。BTK突变可由为熟练技术人员显而易见的多种因素引起，所述因素诸如***突变、缺失突变和取代突变(例如点突变)。在一个实施方案中，突变BTK包含至少一个点突变。

多种点突变被涵盖在本公开的范围内。举例来说，至少一个点突变可关于BTK上的任何残基。在一些实施方案中，BTK基因内的突变包括在以下氨基酸位置处的突变：L11、K12、S14、K19、F25、K27、R28、R33、Y39、Y40、E41、I61、V64、R82、Q103、V113、S115、T117、Q127、C154、C155、T184、P189、P190、Y223、W251、R288、L295、G302、R307、D308、V319、Y334、L358、Y361、H362、H364、N365、S366、L369、I370M、R372、L408、G414、Y418、I429、K430、E445、G462、Y476、M477、C481、C502、C506、A508、M509、L512、L518、R520、D521、A523、R525、N526、V535、L542、R544、Y551、F559、R562、W563、E567、5578、W581、A582、F583、M587、E589、S592、G594、Y598、A607、G613、Y617、P619、A622、V626、M630、C633、R641、F644、L647、L652、V1065和/或A1185。在一些实施方案中，BTK基因内的突变从以下之中加以选择：L11P、K12R、S14F、K19E、F25S、K27R、R28H、R28C、R28P、T33P、Y3S9、Y40C、Y40N、E41K、I61N、V64F、V64D、R82K、Q103Q5FSSVR、V113D、S115F、T117P、Q127H、C1545、C155G、T184P、P189A、Y223F、W251L、R288W、R288Q、L295P、G302E、R307K、R307G、R307T、D308E、V319A、Y334S、L358F、Y361C、H362Q、H364P、N365Y、S366F、L369F、I370M、R372G、L408P、G414R、Y418H、I429N、K430E、E445D、G462D、G462V、Y476D、M477R、C481S、C502F、C502W、C506Y、C506R、A508D、M5091、M509V、L512P、L512Q、L518R、R520Q、D521G、D521H、D521N、A523E、R525G、R525P、R525Q、N526K、V535F、L542P、R544G、R544K、Y551F、F559S、R562W、R562P、W563L、E567K、S578Y、W581R、A582V、F583S、M587L、E589D、E589K、E589G、S592P、G594E、Y598C、A607D、G613D、Y617E、P619A、P619S、A622P、V626G、M630I、M630K、M630T、C633Y、R641C、F644L、F644S、L647P、L652P、V10651和A1185V。在一个实施方案中，至少一个点突变在半胱氨酸残基上。在一个实施方案中，半胱氨酸残基在BTK的激酶结构域中。在一些实施方案中，至少一个点突变在一个或多个选自由以下组成的组的残基上：残基E41、P190和C481。在一些实施方案中，BTK中的突变在氨基酸位置481处(即C481)。C481点突变可为被任何氨基酸部分取代。在一些实施方案中，BTK中的突变是C481S。在一个实施方案中，在残基C481处的点突变选自C481S、C481R、C481T和/或C481Y。在一个实施方案中，至少一个点突变是一个或多个选自由以下组成的组的点突变：E41K、P190K和C481S。

在一些实施方案中，B细胞淋巴瘤的特征在于多个细胞具有突变体BTK多肽。在一些实施方案中，突变体BTK多肽含有一个或多个赋予对由共价和/或不可逆BTK抑制剂达成的抑制的抗性的氨基酸取代。在一些实施方案中，突变体BTK多肽含有一个或多个赋予对由共价结合野生型BTK的在氨基酸位置481处的半胱氨酸的共价和/或不可逆BTK抑制剂达成的抑制的抗性的氨基酸取代。在一些实施方案中，突变体BTK多肽含有一个或多个赋予对由选自以下的共价和/或不可逆BTK抑制剂达成的抑制的抗性的氨基酸取代：PCI-32765(伊布替尼)、PCI-45292、PCI-45466、AVL-101/CC-101(Avila Therapeutics/CelgeneCorporation)、AVL-263/CC-263(Avila Therapeutics/Celgene Corporation)、AVL-292/CC-292(Avila Therapeutics/Celgene Corporation)、AVL-291/CC-291(AvilaTherapeutics/Celgene Corporation)、CNX 774(Avila Therapeutics)、BMS-488516(Bristol-Myers Squibb)、BMS-509744(Bristol-Myers Squibb)、CGI-1746(CGI Pharma/Gilead Sciences)、CGI-560(CGI Pharma/Gilead Sciences)、CTA-056、GDC-0834(Genentech)、HY-11066(也是CTK4I7891、HMS3265G21、HMS3265G22、HMS3265H21、HMS3265H22、439574-61-5、AG-F-54930)、ONO-4059(Ono Pharmaceutical Co.、Ltd.)、ONO-WG37(Ono Pharmaceutical Co.、Ltd.)、PLS-123(Peking University)、RN486(Hoffmann-La Roche)、HM71224(Hanmi Pharmaceutical Company Limited)、LFM-A13、BGB-3111(Beigene)、KBP-7536(KBP BioSciences)、ACP-196(Acerta Pharma)或JTE-051(JapanTobacco Inc)。在一些实施方案中，突变体BTK多肽含有一个或多个赋予对由伊布替尼达成的抑制的抗性的氨基酸取代。在一些情况下，多个细胞包括至少两个细胞。在某些实施方案中，BTK突变体含有一个或多个赋予对由非共价BTK抑制剂达成的抑制的抗性的氨基酸取代。在某些实施方案中，BTK突变体含有一个或多个赋予对由可逆BTK抑制剂达成的抑制的抗性的氨基酸取代。

如以上在一些实施方案中所述，修饰包括相较于野生型BTK，在氨基酸位置481处的氨基酸取代或缺失。在一些实施方案中，修饰包括相较于野生型BTK，在位置481处的氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰是在BTK多肽的氨基酸位置481处，半胱氨酸被取代成从以下之中加以选择的氨基酸：亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、脯氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸和谷氨酸。在一些实施方案中，修饰是在BTK多肽的氨基酸位置481处，半胱氨酸被取代成从丝氨酸、甲硫氨酸或苏氨酸之中加以选择的氨基酸。在一些实施方案中，修饰是在BTK多肽的氨基酸位置481处，半胱氨酸被取代成丝氨酸(“C481S”)。

在一些实施方案中，BTK中的突变赋予在B细胞增生性病症的情况下对TEC抑制剂(例如ITK抑制剂、BTK抑制剂诸如伊布替尼)的抗性。在一些实施方案中，BTK中的C481S突变赋予在B细胞增生性病症的情况下对TEC抑制剂(例如ITK抑制剂、BTK抑制剂诸如伊布替尼)的抗性。在一些实施方案中，BTK中的突变赋予在B细胞增生性病症的情况下对共价BTK抑制剂的抗性。在一些实施方案中，BTK中的突变赋予在B细胞增生性病症的情况下对伊布替尼和阿卡替尼的抗性。

在一个实施方案中，由共价不可逆BTK抑制剂对突变BTK的活性的抑制小于由共价不可逆BTK抑制剂对野生型BTK的活性的抑制。共价不可逆BTK抑制剂对突变BTK具有的IC₅₀可比对野生型BTK具有的IC₅₀高至少约1％至至少约1000％。举例来说，共价不可逆BTK抑制剂对突变BTK具有的IC₅₀可比对野生型BTK具有的IC₅₀高至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、310％、320％、330％、340％、350％、360％、370％、380％、390％、400％、410％、420％、430％、440％、450％、460％、470％、480％、490％、500％、510％、520％、530％、540％、550％、560％、570％、580％、590％、600％、610％、620％、630％、640％、650％、660％、670％、680％、690％、700％、710％、720％、730％、740％、750％、760％、770％、780％、790％、800％、810％、820％、830％、840％、850％、860％、870％、880％、890％、900％、910％、920％、930％、940％、950％、960％、970％、980％、990％至至少约1000％。在一个实施方案中，共价不可逆BTK抑制剂对突变BTK具有的IC₅₀比对野生型BTK具有的IC₅₀高至少50％。在一个实施方案中，不可逆共价BTK抑制剂是伊布替尼和/或阿卡替尼。举例来说，不可逆共价BTK抑制剂是伊布替尼。

在一个实施方案中，点突变在BTK的仅一个等位基因上。在另一实施方案中，点突变在BTK的两个等位基因上。在一个实施方案中，半胱氨酸上的点突变在BTK的仅一个等位基因上。在另一实施方案中，半胱氨酸上的点突变在BTK的两个等位基因上。在一个实施方案中，C481上的点突变在BTK的仅一个等位基因上。在另一实施方案中，C481上的点突变在BTK的两个等位基因上。在一个实施方案中，C481S点突变在BTK的仅一个等位基因上。在另一实施方案中，C481S点突变在BTK的两个等位基因上。

在一个实施方案中，受试者是哺乳动物。在一个实施方案中，受试者是人。

本公开的另一方面涉及一种用于治疗有需要的受试者的癌症的方法，其包括向有需要的受试者施用化合物7或其药学上可接受的盐，其中所述受试者具有突变形式的BTK。

本公开的另一方面涉及一种治疗有需要的受试者的B细胞恶性肿瘤的方法，其包括向所述受试者施用化合物7或其药学上可接受的盐。在一个实施方案中，受试者具有突变形式的BTK。

在一些实施方案中，B细胞恶性肿瘤是慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、高风险CLL或非CLL/SLL淋巴瘤。在一些实施方案中，B细胞增生性病症是滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、套细胞淋巴瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)、多发性骨髓瘤、边缘区淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、非伯基特高等级B细胞淋巴瘤或结外边缘区B细胞淋巴瘤。在一些实施方案中，B细胞恶性肿瘤是急性或慢性骨髓源性(或骨髓性)白血病、骨髓异常增生综合征或急性淋巴母细胞性白血病。在一些实施方案中，B细胞恶性肿瘤是复发或难治性弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、复发或难治性套细胞淋巴瘤、复发或难治性滤泡性淋巴瘤、复发或难治性CLL；复发或难治性SLL；复发或难治性多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，B细胞恶性肿瘤是分类为高风险的B细胞增生性病症。在一些实施方案中，B细胞恶性肿瘤是高风险CLL或高风险SLL。

因此，在一个实施方案中，治疗的B细胞恶性肿瘤选自由以下组成的组中的一者或多者：套细胞淋巴瘤(MCL)、B细胞急性淋巴母细胞性白血病(B-ALL)、伯基特氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。在一个实施方案中，治疗的B细胞恶性肿瘤是套细胞淋巴瘤(MCL)。在另一实施方案中，治疗的B细胞恶性肿瘤是B细胞急性淋巴母细胞性白血病(B-ALL)。在一个实施方案中，治疗的B细胞恶性肿瘤是伯基特氏淋巴瘤。在一个实施方案中，治疗的B细胞恶性肿瘤是慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。在一个实施方案中，治疗的B细胞恶性肿瘤是套细胞淋巴瘤(MCL)。在一个实施方案中，治疗的B细胞恶性肿瘤是弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。

B细胞恶性肿瘤是血液的赘瘤，并且尤其涵盖非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤和白血病。它们可起源于淋巴组织中(如在淋巴瘤的情况下)或骨髓中(如在白血病和骨髓瘤的情况下)，并且它们全都涉及淋巴细胞或白血细胞的生长不受控制。存在许多亚型的B细胞增生性病症。B细胞增生性病症的疾病过程和治疗取决于B细胞增生性病症亚型；然而，即使在各亚型内，临床呈现、形态外观和对疗法的响应也是异质的。

在另一实施方案中，方法也可包括通过向有需要的患者施用化合物7或其药学上可接受的盐来治疗恶性血液病。在另一实施方案中，恶性血液病是白血病。在另一实施方案中，白血病是急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、急性早幼粒细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性中性粒细胞性白血病、急性未分化白血病、间变性大细胞淋巴瘤、前淋巴细胞性白血病、青少年髓单核细胞性白血病、成人T细胞急性淋巴细胞性白血病、伴有三系骨髓发育不良的急性骨髓性白血病、混合谱系白血病、嗜酸粒细胞性白血病和/或套细胞淋巴瘤。在一特定实施方案中，白血病是急性骨髓性白血病。

恶性淋巴瘤是主要驻留在淋巴组织内的细胞的赘生性转化形式。两组恶性淋巴瘤是霍奇金氏淋巴瘤和非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)。两种类型的淋巴瘤均浸润网状内皮组织。然而，它们在赘生性来源细胞、疾病部位、全身性症状的存在性以及对治疗的响应方面不同。

在一个实施方案中，化合物7抑制和/或降低Aurora激酶的活性。Aurora激酶(Aurora-A、Aurora-B、Aurora-C)是丝氨酸/苏氨酸蛋白质激酶，其为增殖细胞所必需，并且已被鉴定为有丝***和减数***中的在从形成有丝***纺锤体至胞质***的范围内的不同步骤的关键调控剂。Aurora家族激酶对细胞***至关重要，并且已与肿瘤发生和癌症易感性密切关联。在各种人癌症的情况下，已观察到Aurora-A、Aurora-B和/或Aurora C的激酶活性的过度表达和/或上调。Aurora激酶的过度表达在临床上与癌症进展和不良存活预后相关联。Aurora激酶涉及于调控细胞周期的磷酸化事件(例如组蛋白H3的磷酸化)中。细胞周期的错误调控可导致细胞增殖和其他异常。

在不受任何特定理论束缚下，抑制BTK和/或Aurora激酶可导致胞质***失败以及从有丝***异常退出，此可导致多倍性细胞、细胞周期阻滞，以及最终导致凋亡。

因此，在一个实施方案中，施用化合物7会诱导多倍性。在另一实施方案中，施用化合物7会诱导凋亡。举例来说，在一个实施方案中，使细胞与有效量的化合物7接触，由此导致细胞多倍性和/或细胞周期阻滞和/或凋亡。细胞可为癌细胞或肿瘤细胞。因此，在一个实施方案中，施用化合物7会诱导癌细胞和/或肿瘤细胞的凋亡。在另一实施方案中，施用化合物7会诱导表达突变体BTK(例如C481S)的癌细胞和/或肿瘤细胞的凋亡。

在任何本公开的实施方案中，化合物7可抑制和/或降低野生型BTK和/或突变体BTK的活性或表达。因此，在一些实施方案中，化合物7抑制和/或降低野生型BTK的活性或表达。在其他实施方案中，化合物7抑制和/或降低突变体BTK的活性或表达。突变体BTK可包含至少一个点突变。在一个实施方案中，突变体BTK包含在半胱氨酸残基上的至少一个点突变。在一个实施方案中，突变体BTK包含在残基C481处的至少一个点突变。在一个实施方案中，突变体BTK至少包含C481S突变。

Fms相关酪氨酸激酶3(FLT3)是指由FLT3基因编码的蛋白质。野生型FLT3是指呈非突变形式的蛋白质。FLT3可经受一系列突变，包括FLT3的近膜区域中的活化性内部串联重复(ITD)和酪氨酸激酶结构域或活化环中的点突变。在任何本公开的实施方案中，化合物7抑制和/或降低受试者中的野生型和/或突变体Fms相关酪氨酸激酶3(FLT3)活性或表达。在一个实施方案中，化合物7抑制和/或降低受试者中的野生型Fms相关酪氨酸激酶3(FLT3)活性或表达。在另一实施方案中，化合物7抑制和/或降低受试者中的突变体Fms相关酪氨酸激酶3(FLT3)活性或表达。突变体FLT3可包含至少一个点突变。在一个实施方案中，突变FLT3包含至少一个在一个或多个选自由以下组成的组的残基上的点突变：D835、F691、K663、Y842和N841。突变FLT3可为FLT3-ITD。突变FLT3可进一步包含额外ITD突变。

本公开的另一方面涉及一种抑制或降低人细胞中的异常(例如过度表达)野生型或突变BTK活性或表达的方法，其包括使化合物7或其药学上可接受的盐与所述人细胞接触。

在一个实施方案中，突变BTK包含至少一个点突变。多种点突变被涵盖在本公开的范围内，并且在以上加以描述。举例来说，至少一个点突变可关于BTK上的任何残基。在一个实施方案中，至少一个点突变在半胱氨酸残基上。在一个实施方案中，半胱氨酸残基在BTK的激酶结构域中。在一些实施方案中，至少一个点突变在一个或多个选自由以下组成的组的残基上：残基E41、P190和C481。在一些实施方案中，BTK中的突变在氨基酸位置481处。C481点突变可为被任何氨基酸部分取代。在一些实施方案中，BTK中的突变是C481S。在一个实施方案中，在残基C481处的点突变选自C481S、C481R、C481T和/或C481Y。在一个实施方案中，至少一个点突变是一个或多个选自由以下组成的组的点突变：E41K、P190K和C481S。

制剂

化合物7、其药学上可接受的盐、酯、前药、水合物、溶剂合物和异构体、或包含化合物7或其药学上可接受的盐的药物组合物的有效量可由本领域技术人员基于已知方法来确定。

在一个实施方案中，本公开的药物组合物或药物制剂包含化合物7或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体。药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂包括不限于已由美国食品与药物管理局核准为可为在人或家养动物中使用所接受的任何佐剂、载体、赋形剂、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、风味增强剂、表面活性剂、湿润剂、分散剂、混悬剂、稳定剂、等张剂、溶剂或乳化剂。

在一个实施方案中，适合药学上可接受的载体包括但不限于惰性固体填充剂或稀释剂和无菌水性或有机溶液。药学上可接受的载体为本领域技术人员所熟知，并且包括但不限于约0.01至约0.1M，并且优选是0.05M磷酸盐缓冲液或0.8％盐水。所述药学上可接受的载体可为水性或非水性溶液、混悬液和乳液。适于在本申请中使用的非水性溶剂的实例包括但不限于丙二醇、聚乙二醇、植物油诸如橄榄油、以及可注射有机酯诸如油酸乙酯。

适于在本申请中使用的水性载体包括但不限于水、乙醇、醇性/水性溶液、甘油、乳液或混悬液，包括盐水和缓冲介质。口服载体可为酏剂、糖浆、胶囊、片剂等。

适于在本申请中使用的液体载体可用于制备溶液、混悬液、乳液、糖浆、酏剂和加压化合物。可将活性成分溶解或混悬于药学上可接受的液体载体诸如水、有机溶剂、两者的混合物、或药学上可接受的油或脂肪中。液体载体可含有其他适合药物添加剂，诸如增溶剂、乳化剂、缓冲剂、防腐剂、甜味剂、调味剂、混悬剂、增稠剂、着色剂、粘度调控剂、稳定剂或渗透调控剂。

适于在本申请中使用的液体载体包括但不限于水(部分地含有如上添加剂，例如纤维素衍生物，优选是羧甲基纤维素钠溶液)、醇(包括一元醇和多元醇，例如二醇)和它们的衍生物、以及油(例如分馏椰子油和花生油)。对于胃肠外施用，载体也可包括油性酯诸如油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯。无菌液体载体适用于供胃肠外施用的包含化合物的无菌液体形式中。用于本文公开的加压化合物的液体载体可为卤化烃或其他药学上可接受的推进剂。

适于在本申请中使用的固体载体包括但不限于惰性物质诸如乳糖、淀粉、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、磷酸二钙、甘露糖醇等。固体载体可进一步包括一种或多种充当调味剂、润滑剂、增溶剂、混悬剂、填充剂、助流剂、压制助剂、粘合剂或片剂崩解剂的物质；它也可为囊封物质。在粉剂的情况下，载体可为与精细分散活性化合物掺混的精细分散固体。在片剂的情况下，活性化合物与具有必要压制性质的载体以适合比例混合，并且以所需形状和尺寸加以压紧。粉剂和片剂优选含有多达99％的活性化合物。适合固体载体包括例如磷酸钙、硬脂酸镁、滑石、糖、乳糖、糊精、淀粉、明胶、纤维素、聚乙烯吡咯烷、低熔点蜡和离子交换树脂。片剂可通过任选与一种或多种辅助成分一起压制或模制来制备。压制片剂可通过在适合机器中压制任选与粘合剂(例如聚维酮、明胶、羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如淀粉乙醇酸钠、交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂混合的呈诸如粉末或颗粒的自由流动形式的活性成分来制备。模制片剂可通过在适合机器中模制湿润粉状化合物与惰性液体稀释剂的混合物来制备。片剂可任选被包衣或刻痕，并且可以不同比例使用例如羟丙基甲基纤维素以提供所需释放概况加以配制以便提供其中活性成分的缓慢或控制释放。片剂可任选具有肠溶性包衣以提供在消化道的除胃以外的部分中释放。

适于在本申请中使用的胃肠外载体包括但不限于氯化钠溶液、林格氏右旋糖(Ringer's dextrose)、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏液和不挥发性油。静脉内载体包括流体和营养补充剂、电解质补充剂，诸如基于林格氏右旋糖的那些等。也可存在防腐剂和其他添加剂，诸如像抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等。

适于在本申请中使用的载体可根据需要使用本领域中已知的常规技术与崩解剂、稀释剂、粒化剂、润滑剂、粘合剂等混合。载体也可使用如本领域中通常已知的不有害地与化合物反应的方法来灭菌。

可将稀释剂添加至本发明制剂中。稀释剂使固体药物组合物和/或组合的体积增加，并且可使含有组合物和/或组合的药物剂型对于患者和护理给与者来说更易于处理。用于固体组合物和/或组合的稀释剂包括例如微晶纤维素(例如AVICEL)、微细纤维素、乳糖、淀粉、预胶凝淀粉、碳酸钙、硫酸钙、糖、葡萄糖结合剂、糊精、右旋糖、磷酸氢钙二水合物、磷酸钙、高岭土、碳酸镁、氧化镁、麦芽糖糊精、甘露糖醇、聚甲基丙烯酸酯(例如EUDRAGIT(r))、氯化钾、粉状纤维素、氯化钠、山梨糖醇和滑石。

出于本公开的目的，本公开的药物组合物可被配制来以含有药学上可接受的载体、佐剂和媒介物的制剂形式通过多种手段进行施用，所述手段包括口服、胃肠外、通过吸入喷雾、经表面、或经直肠。如此处所用的术语胃肠外包括用多种输注技术进行皮下、静脉内、肌肉内和动脉内注射。如本文所用的动脉内和静脉内注射包括通过导管来施用。

本发明的药物组合物可通过使用任何本领域中熟知的常规方法来制备成任何类型的制剂和药物递送系统。本发明药物组合物可配制成可注射制剂，其可通过包括鞘内、室内、静脉内、腹膜内、鼻内、眼内、肌肉内、皮下或骨内的途径来施用。此外，它也可通过直肠、肠或鼻腔中的粘膜来以口服或胃肠外方式施用(参见Gennaro,A.R.编(1995)Remington'sPharmaceutical Sciences)。优选地，组合物经表面而非经肠施用。举例来说，组合物可通过靶向药物递送系统诸如储槽制剂或持续释放制剂来注射或递送。

本发明的药物制剂可通过本领域中任何熟知方法来制备，所述方法诸如混合、溶解、粒化、糖衣片制备、磨细、乳化、囊封、包埋或冻干工艺。如上所提及，本发明组合物可包括一种或多种生理上可接受的载体，诸如促进将活性分子加工成用于药物用途的制剂的赋形剂和佐剂。

适当制剂取决于所选施用途径。对于注射，举例来说，组合物可配制成优选在生理上可相容的缓冲液诸如汉克氏溶液(Hank's solution)、林格氏溶液或生理盐水缓冲液中的水溶液。对于经粘膜或经鼻施用，适合于待渗透的屏障的渗透剂用于制剂中。所述渗透剂通常在本领域中是已知的。在本发明的一个实施方案中，本发明化合物可制备成口服制剂。对于口服施用，化合物可易于通过使活性化合物与本领域中已知的药学上可接受的载体组合来配制。所述载体使得所公开化合物能够被配制成用于由受试者口服摄取的片剂、丸剂、糖衣片、胶囊、液体、凝胶剂、糖浆、浆液、混悬液等。化合物也可配制成例如含有常规栓剂基质诸如可可脂或其他甘油酯的经直肠组合物诸如栓剂或滞留灌肠剂。

供口服使用的药物制剂可采用固体赋形剂来获得，任选在需要时在添加适合佐剂之后研磨所得混合物，以及加工颗粒的混合物以获得片剂或糖衣片核心。特定来说，适合赋形剂可为填充剂诸如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇；纤维素制剂诸如玉米淀粉、小麦淀粉、稻米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)制剂。此外，可采用崩解剂，诸如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐，诸如海藻酸钠。此外，可添加湿润剂，诸如十二烷基硫酸钠等。

糖衣片核心具有适合的包衣。出于这个目的，可使用浓缩糖溶液，其可任选含有***胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡伯波凝胶(carbopol gel)、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液和适合有机溶剂或溶剂混合物。可将染料或颜料添加至片剂或糖衣片包衣中以标识或表征活性化合物剂量的不同组合。

供口服施用的药物制剂可包括由明胶制得的推入-配合型胶囊以及由明胶和塑化剂诸如甘油或山梨糖醇制得的软质密封胶囊。推入-配合型胶囊可含有活性成分与填充剂诸如乳糖、粘合剂诸如淀粉、和/或润滑剂诸如滑石或硬脂酸镁，以及任选与稳定剂的掺混物。在软质胶囊中，活性化合物可被溶解或混悬于适合液体诸如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇中。此外，可添加稳定剂。供口服施用的所有制剂在剂量方面都应适于所述施用。

在一个实施方案中，本发明化合物可诸如通过皮肤贴片来经皮施用，或经表面施用。在一个方面，本发明的经皮或经表面制剂可另外包含一种或多种渗透增强剂或其他效应物，包括使所递送化合物的迁移增强的试剂。优选地，可使用经皮或经表面施用，例如在其中需要位置特异性递送的情况下。

对于通过吸入进行的施用，本发明化合物可宜以气雾喷雾剂呈现形式在使用适合推进剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或任何其他适合气体的情况下从加压包装或喷雾器递送。在加压气雾剂的情况下，可通过提供用以递送经计量数量的阀来确定适当剂量单位。可配制用于吸入器或吹入器中的由例如明胶制得的胶囊和药筒。这些通常含有化合物和适合粉末基质诸如乳糖或淀粉的粉末混合物。被配制来通过注射例如通过团式注射或连续输注进行胃肠外施用的组合物可以单位剂型呈现，例如处于安瓿中，或在添加防腐剂的情况下处于多次剂量容器中。组合物可采用诸如于油性或水性媒介物中的混悬液、溶液或乳液的形式，并且可含有配制剂，诸如混悬剂、稳定剂和/或分散剂。供胃肠外施用的制剂包括水溶液或呈水溶性形式的其他组合物。

活性化合物的混悬液也可制备成适当油性注射混悬液。适合亲脂性溶剂或媒介物可包括脂肪油诸如芝麻油和合成脂肪酸酯诸如油酸乙酯或甘油三酯、或脂质体。水性注射混悬液可含有使混悬液的粘度增加的物质，诸如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或右旋糖酐。任选地，混悬液也可含有适合稳定剂或使化合物的溶解性增加以允许制备高度浓缩溶液的试剂。或者，活性成分可呈用于在使用之前用适合媒介物例如无菌无热原水溶解的粉末形式。

如上所提及，本发明组合物也可配制成储槽制剂。所述长效制剂可通过植入(例如皮下或肌肉内植入)或通过肌肉内注射来施用。因此，举例来说，本发明化合物可与适合聚合或疏水性物质一起配制(例如于可接受的油中的乳液)或与离子交换树脂一起配制，或可配制成微溶衍生物例如微溶盐。

对于用于本发明治疗方法中的任何组合物，可初始使用本领域中熟知的多种技术来估计治疗有效剂量。举例来说，基于从细胞培养测定获得的信息，可配制动物模型中的剂量以实现包括IC₅₀的循环浓度范围。类似地，可例如使用从细胞培养测定和其他动物研究获得的数据来确定适合于人受试者的剂量范围。

药剂的治疗有效剂量是指所述药剂的在受试者中导致症状改善或存活期延长的量。可通过标准药物程序在细胞培养物或实验动物中确定所述分子的毒性和治疗功效，例如通过测定LD₅₀(对群体的50％具有致死性的剂量)和ED₅₀(在群体的50％中具有治疗有效性的剂量)。毒性作用与治疗作用之间的剂量比率是治疗指数，其可表示为比率LD_50O/ED₅₀。寻求的是展现高治疗指数的药剂。

剂量优选落在具有少许或不具有毒性的包括ED₅₀的循环浓度范围内。视采用的剂型和利用的施用途径而定，剂量可在这个范围内变化。确切制剂、施用途径和剂量应根据本领域中熟知的方法鉴于受试者的状况的特性加以选择。

此外，施用的药剂或组合物的量将取决于多种因素，包括所治疗受试者的年龄、重量、性别、健康状况、疾病程度，痛苦的严重性，施用方式以及处方医师的判断。

本公开的化合物或药物组合物可以单次或多次单位剂型制造和/或施用。

现已大体上描述本发明，本发明将通过参照以下实施例而更易于被了解，所述实施例通过说明的方式加以提供，并且不意图限制本发明。除非另外明确陈述，否则条件和程序如本领域中通常所知来执行。

实施例

合成：材料和方法

各种起始物质可根据本领域中熟知的常规合成方法制备。一些起始物质可从试剂制造商和供应商商购获得，所述试剂制造商和供应商诸如Aldrich、Sigma、TCI、Wako、Kanto、Fluorchem、Acros、Abocado、Alfa、Fluka等，但不限于这些。

本公开化合物可通过常规方法和以下过程来从可易于获得的起始物质制备。不同方法也可用于制造本发明化合物，除非另外规定为典型或最优工艺条件(即反应温度、时间、反应物的摩尔比、溶剂、压力等)。最优反应条件可视采用的特定反应物或溶剂而变化。然而，所述条件可由本领域技术人员通过常规优化过程来确定。

此外，本领域普通技术人员认识到一些官能团可在某一反应发生之前使用各种保护基来保护/脱保护。适于对特定官能团进行保护和/或脱保护的条件以及保护基的使用在本领域中是熟知的。

举例来说，各个种类的保护基描述于T.W.Greene和G.M.Wuts,Protecting Groupsin Organic Synthesis,第2版,Wiley,New York,1991以及以上引用的其他参考文献中。

在本发明的一个实施方案中，本发明的化合物7可通过以下方式制备：根据如下所示的流程1合成中间体化合物D，接着使化合物D经受反应流程2的程序。然而，用于合成以上化合物D的方法不限于反应流程1。

流程1

用于制备反应流程1的起始物质即化合物A的方法描述于国际专利公布W02012/014017中，并且化合物D的制备描述于美国专利申请公布US2015/0336934中。

实施例1：合成1-{3-氟-4-[7-(5-甲基-1H-咪唑-2-基)-1-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-4-基]-苯基}-3-(2,4,6-三氟-苯基)-脲(化合物7)

将2,4,6-三氟苯甲酸(0.08g，0.45mmol)分散于***(5.7mL)中，缓慢添加五氯化磷(PCl₅，0.11g，0.52mmol)，接着搅拌1小时。在反应完成后，在低于室温下在减压下浓缩有机溶剂，接着通过添加丙酮(3.8mL)来稀释反应溶液。随后，在0℃下将溶解于水(0.28mL)中的叠氮化钠(NaN₃，0.035g，0.545mmol)逐滴缓慢添加至反应溶液中。在室温下搅拌2小时之后，将由此形成的2,4,6-三氟苯甲酰叠氮用乙酸乙酯稀释，接着用水洗涤。将有机层经无水硫酸镁干燥，分散于THF(2mL)中，添加含有4-(4-氨基-2-氟苯基)-7-(5-甲基-1H-咪唑-2-基)异吲哚啉-1-酮(化合物D，0.073g，0.23mmol)的THF(7.5mL)，接着在90℃下搅拌3小时。在反应完成后，在减压下浓缩溶剂，接着通过硅胶柱色谱法(洗脱剂：二氯甲烷:甲醇＝20:1)纯化以获得化合物7(0.026g，产率：23％)。¹H-NMR(300MHz,DMSO-d):14.46-14.37(m1H),9.47-9.45(br m,1H),9.37(s,1H),8.45(d,J＝l.8Hz,1H),8.30-8.27(br m,1H),7.63-7.46(m,3H),7.31-7.26(m,3H),7.09-6.84(m,1H),4.42(s,2H),2.31-2.21(m,3H)。LCMS[M+1]:496.3。

实施例2：化合物7对野生型和突变FLT3激酶的结合常数

所述激酶活性的测量结果被称为结合常数或K_d值。用于获得这些值的方案据此加以描述。对于大多数测定，在源于BL21菌株的大肠杆菌(E.coli)宿主中制备激酶标签化T7噬菌体品系。使大肠杆菌生长至对数期，并且用T7噬菌体感染并在32℃下在振荡下孵育直至溶解。对溶解产物进行离心，并且过滤以移除细胞碎片。在HEK-293细胞中产生其余激酶，并且随后用DNA加以标签化以进行qPCR检测。在室温下用生物素化小分子配体处理经链霉亲和素涂布磁性珠粒30分钟以产生用于激酶测定的亲和树脂。用过量生物素阻断配体化珠粒，并且用阻断缓冲液(SeaBlock(Pierce)，1％BSA、0.05％吐温20、1mM DTT)洗涤以移除未结合配体以及使非特异性结合降低。通过在1x结合缓冲液(20％SeaBlock、0.17x PBS、0.05％吐温20、6mM DTT)中组合激酶、配体化亲和珠粒和测试化合物来组装结合反应。测试化合物于100％DMSO中制备成111X储备物。使用11点3倍化合物稀释系列，采用三个DMSO对照点来测定Kd。用于K_d测量的所有化合物都通过声学转移(非接触分配)来散布在100％DMSO中。接着将化合物直接稀释至测定中以使DMSO的最终浓度是0.9％。所有反应都在聚丙烯384孔板中进行。各自都具有0.02ml的最终体积。在室温下在振荡下孵育测定板1小时，并且将亲和珠粒用洗涤缓冲液(1x PBS、0.05％吐温20)洗涤。接着将珠粒再混悬于洗脱缓冲液(1x PBS、0.05％吐温20、0.5μM非生物素化亲和配体)中，并且在室温下在振荡下孵育30分钟。通过qPCR来测量洗脱物中的激酶浓度。

对于化合物7和奎扎替尼测量的结合常数显示于下表1中。

表1.化合物7和奎扎替尼的结合常数(K_d)

实施例3：在MV4-11细胞的情况下对化合物7的蛋白质印迹分析

图1显示蛋白质印迹分析结果。在不束缚于任何理论下，这证明化合物7抑制MV4-11细胞中的FLT3通路。

实施例4：用化合物7抑制FLT3突变体

表2.化合物7在FLT3的情况下的IC₅₀

	IC<sub>50</sub>(nM)
		FLT3(D835Y)	166.5
FLT3(ITD)	0.8172
		FLT3(WT)	8.746

实施例5：化合物7对血细胞系的细胞毒性

表3.化合物7的细胞毒性

表3显示化合物7在各种血细胞系的情况下的细胞毒性，其中相应剂量-响应曲线表示在图15中。此外，图4显示化合物7、奎扎替尼和伊布替尼对FLT3-ITD(MV411和MOLM-13)和FLT3-WT(NOMO-1和KG-1)细胞的细胞毒性作用。此外，图16显示化合物7、奎扎替尼、吉列替尼和克瑞兰尼针对用FLT3突变体转染的同基因Ba/F3细胞的剂量-响应曲线，其结果概述于表4中。

表4化合物7针对用FLT3突变体转染的同基因Ba/F3细胞的IC₅₀

实施例6：MV4-11细胞的凋亡

在一个研究中，将MV411细胞独立地用或不用化合物7、伊布替尼或奎扎替尼在各种浓度下处理24小时，并且测量凋亡细胞计数和活细胞计数。在不束缚于任何理论下，图7和图8中的结果证明化合物7诱导MV4-11细胞的凋亡。

在另一研究中，研究化合物7关于MV4-11细胞凋亡的时间依赖性，并且如可由图17所见，化合物7以时间依赖性方式诱导凋亡。图7、图8和图17中呈现的数据使用为熟练技术人员显而易见的用于测量凋亡的熟知方案产生。在不受任何理论束缚下，程序的概述可见于例如Rieger等,Modified Annexin V/Propidium Iodide Apoptosis Assay ForAccurate Assessment of Cell Death,J VI.Exp.2011；(50):2597中。

实施例7：在大鼠中的药物动力学研究

图5证明当口服施用化合物7时，AUC以剂量依赖性方式提高。对于100mg/kg口服混悬液，获得最佳结果。合理暴露量也用静脉内施用的2mg/kg低剂量实现。

实施例8：异种移植物

图6证明当相较于对照或伊布替尼治疗时，化合物7以增加的剂量使肿瘤体积降低。

实施例9：用化合物7抑制BTK

表5.化合物7在BTK的情况下的IC₅₀

	IC<sub>50</sub>(nM)
		BTK	8.42
BTK(C481S)	2.52
		BTK(E41K)	14.53
BTK(P190K)	6.59

表5证明化合物7抑制BTK系列。

实施例10：在MV4-11细胞和EOL-1细胞的情况下对化合物7的蛋白质印迹分析

图2和图3显示蛋白质印迹分析结果。在不束缚于任何理论下，这证明化合物7抑制MV4-11细胞中以及EOL-1细胞中的BTK通路。

实施例11：对FLT3WT和FLT突变体的抗增殖活性的比较

表6.

表.化合物7、奎扎替尼和吉列替尼在AML细胞系的情况下的抗增殖活性的比较.

半数最大抑制剂浓度(IC₅₀)通过72小时处理来产生(吉列替尼的IC₅₀由48小时处理获得)。

实施例12：关于患者对化合物7的敏感性的离体测定

使用离体测定来评估85名诊断有急性骨髓性白血病(AML)的患者、15名患有骨髓异常增生综合征/骨髓增生性赘瘤(MDS/MPN)的患者、18名患有急性淋巴母细胞性白血病(ALL)的患者和56名患有慢性淋巴细胞性白血病(CLL)的患者对多激酶抑制剂化合物7的敏感性。跨越从10nM至10μM的浓度范围评估对化合物7的敏感性。在3天培养期之后使用基于四唑鎓的MTS比色测定来评估细胞活力，并且计算IC₅₀值作为药物敏感性的量度。

跨越数据集中恶性血液病的四个一般性亚型，存在对化合物7的广泛敏感性。大多数AML病例显示对化合物7的敏感性，其中51/85(60％)病例展现IC₅₀小于0.1μM。其他亚型(MDS/MPN、ALL、CLL)的敏感性显示类似或略微较低敏感性水平(40-60％，参见表7)。数据集中38个AML患者样本的FLT3突变状况是已知的：30个样本是WT，8个样本是ITD+，0个样本具有点突变。在这个子组中对化合物7敏感性的分析揭示在FLT3-ITD+样本的情况下，具有敏感性增强的趋势；然而，更大样本大小将为充分推动统计分析所必需。

表7：患者中的化合物7敏感性

诊断类型	评估数目	IC<sub>50</sub>&lt;0.1μM的样本％
			AML	85	60(51/85)
MDS/MPN	15	53(8/15)
			ALL	18	61(11/18)
CLL	56	41(23/56)

化合物7针对AML以及其他恶性血液病亚型展现广泛和强力活性。初步分析显示相较于FLT3野生型，在FLT3突变AML病例的情况下具有化合物7敏感性较大的趋势；然而，正在进行的额外患者样本招募可为充分推动化合物7敏感性与FLT3突变状况的统计关联所需。总之，在不受任何理论束缚下，对化合物7针对原发性恶性血液病患者样本的临床前分析显示在AML和其他疾病亚型的情况下具有广泛药物活性的迹象，并且支持进一步开发这个药剂用于恶性血液病。

实施例13.化合物7对细胞周期调控异常的影响

考查化合物7对细胞周期的各个方面的影响。

在一个实验中，发现化合物7以剂量依赖性方式诱导MV411细胞中的G0/G1细胞周期阻滞(图18a和图18b)。在另一实验中，发现化合物7以剂量依赖性方式诱导MOLM-13细胞中的G0/G1细胞周期阻滞(图19)。

在另一实验中，发现化合物7诱导各种血细胞系中的多倍性(图20)。在递增浓度的化合物7下处理MV4-11、NOMO-1和KG-1细胞24小时，并且使用EdU和PI染色，继之以使用BDAccuri C6流式细胞仪进行FACS分析来评估DNA含量增加或多倍性表型。

在另一实验中，发现化合物7以剂量依赖性方式诱导KG-1细胞(图21)、NOMO-1细胞(图22)和具有FLT3突变的同基因BA/F3细胞(图23)中的细胞周期调控异常。

实施例14.化合物7对血细胞中的细胞信号传导的抑制作用。

图24和图25显示化合物7分别在MV4-11和FLT3 WT细胞(KG-1)中抑制Aurora激酶活性和信号传导。这与Aurora激酶抑制剂AT9283(图24)以及激酶抑制剂伊布替尼和奎扎替尼(图25)进行比较。图26显示化合物7抑制EOL-1细胞中的PDGFRA和FLT3(WT)信号传导。在不受任何理论束缚下，这些图显示化合物7充当血细胞系中各种细胞信号传导通路的强力抑制剂。

实施例15：化合物7针对BTK的比较效能

除化合物7针对野生型BTK的效能之外，它也针对BTK-C481S突变体展现nM效能，如表8中所示。化合物7针对野生型BTK具有5.0nM的效能，此等于阿卡替尼的效能。甚至更惊人的是，化合物7最有效针对对伊布替尼和阿卡替尼具有抗性的BTK-C481S。化合物7也极其强力针对据信促进伊布替尼的功效的关键靶标ITK。此外，化合物7对EGFR不具有抑制作用，此表明诸如皮疹和腹泻的并发症的可能性降低。

表8：各种化合物对BTK的抑制

实施例16：化合物7抑制野生型和C481S突变形式的BTK

用野生型BTK或C481S BTK短暂转染HEK293T细胞。用或不用化合物7(0.5和1.0μM)处理经转染细胞6小时。此举一式三份进行，并且通过蛋白质印迹分析来分析结果。

如由图9中磷酸化形式的酶的降低所证实，化合物7在0.5μM与1.0μM两种浓度下抑制野生型形式的BTK与C481S突变形式的BTK两者。然而，当相较于伊布替尼时，观察到化合物7相比于伊布替尼在较小程度上抑制BTK，从而表明不同机理通路(图10)。

实施例17：化合物7对B细胞恶性肿瘤细胞系的细胞毒性。

将细胞接种于96孔板中，并且用媒介物(DMSO)或化合物7在10种不同浓度下在37℃和5％CO₂下处理3天。使用CellTiter 96水性单溶液(MTS Promega目录号G3581)评估细胞活力，并且使用GraphPad Prism 7软件来计算IC₅₀值。

表9显示化合物7在各种B细胞恶性肿瘤细胞系的情况下的细胞毒性。此外，图11显示化合物7和伊布替尼关于表9的细胞系的剂量-响应曲线。

表9.化合物7的细胞毒性

实施例18：化合物7诱导B细胞恶性肿瘤的凋亡

进行机理研究以确定化合物7的作用机理。经处理细胞的凋亡状态通过用膜联蛋白V和碘化丙锭(PI)染色，接着用BD Accuri C6流式细胞仪分析来确定，借此活细胞呈膜联蛋白V/PI阴性，早期凋亡细胞呈膜联蛋白V阳性，并且晚期凋亡细胞呈膜联蛋白V和PI阳性。此外，通过用特异性抗体进行蛋白质印迹来测定作为经典凋亡标志物的经裂解PARP的产生。

如图12中所示，化合物7诱导B细胞恶性肿瘤的细胞凋亡。Mino细胞系与Ramos细胞系两者均用递增浓度的化合物7和伊布替尼处理。在所有测试浓度下，化合物7相比于伊布替尼都更有效诱导凋亡。相应蛋白质印迹中的磷酸化样式确认这个凋亡增加。

实施例19：化合物7抑制B细胞恶性肿瘤中的Aurora激酶和BTK通过关于Aurora激酶或/和下游靶标的磷酸化水平进行蛋白质印迹以及通过细胞周期和DNA含量分析来测量对Aurora激酶活性的抑制。来自经化合物7处理细胞的全细胞提取物通过凝胶电泳来分离并转移至硝化纤维素膜中，并且用特异性抗体检测对Aurora激酶A/B和H3S10磷酸化的抑制。DNA合成和细胞周期时期通过用5-乙炔基-2′-脱氧尿苷(Edu)Alexa Fluor 488和PI染色经化合物7或媒介物处理细胞来评估。

尽管化合物7相比于伊布替尼对B细胞癌细胞更具细胞毒性，但它相比于伊布替尼是一种活性较小的BTK抑制剂(图10)。为更好了解化合物7的高效能，考查它对Aurora激酶的抑制作用，并且发现它有效作为Aurora激酶抑制剂(图13)，如通过在增加的化合物7浓度下Wester印迹中的磷酸化样式所确认。在不受任何特定理论束缚下，化合物7在B细胞癌细胞的情况下的高细胞毒性据信部分地归因于它的多激酶通路抑制概况。

实施例20：化合物7依次诱导B细胞恶性肿瘤中的多倍性和凋亡

进行其他机理研究以充分阐明化合物7的强力细胞毒性。用媒介物或化合物7处理B细胞系24-72小时，并且使用Edu和PI染色，继之以使用BD Accuri C6流式细胞仪进行FACS分析来评估DNA含量增加或多倍性表型。

用递增浓度的化合物7或伊布替尼处理Mino细胞系和Ramos细胞系以相对于伊布替尼来测定化合物7对诱导B细胞恶性细胞系中的多倍性具有的比较作用。如图14中所示，化合物7针对Mino细胞在0.1和1.0nM的浓度下，以及针对Ramos在5nM的浓度下，并且如显示细胞死亡征象的蛋白质印迹中所指示，依次有效诱导多倍性(>4n)和凋亡。

实施例21：化合物7干扰B细胞恶性肿瘤中的细胞周期进展

图27和图28显示化合物7干扰细胞周期进展。在不受任何理论束缚下，这些图显示化合物7干扰B细胞恶性细胞系中的细胞信号传导通路。图27和图28中呈现的数据使用用于测量细胞周期进展，并且为熟练技术人员显而易见的熟知方案(例如EdU和/或PI染色，继之以使用BD Accuri C6流式细胞仪进行FACS分析)产生。

实施例22.化合物7对B细胞恶性细胞系中的细胞信号传导的抑制作用。

图29显示相对于伊布替尼，化合物7抑制Ramos细胞中的BTK和Aurora激酶活性。

图30显示化合物7影响Ramos细胞中的BCR信号传导。在这个实验中，用或不用化合物7或伊布替尼在指示浓度下处理Ramos细胞1(6个重复测定)或6(3个重复测定)小时，接着用12μg/mL IgM刺激3分钟。

在不受任何理论束缚下，这些图显示化合物7充当B细胞恶性细胞系中各种细胞信号传导通路的强力抑制剂。

实施例23.化合物7在高血清条件下具有细胞毒性。

在不同血清浓度下以剂量依赖性方式测试化合物7。图31显示化合物7在高血清浓度下保留高活性。在这个实验中，在含有正常(10％)或高血清(30％、50％、80％)FBS的培养基中，用或不用化合物7处理MV4-11(n＝6)和EOL-1(n＝3～6)细胞72小时，以MTS测定充当终点。

实施例24.一般性实验程序

IC_50S和EC_50S：本文所述的某些细胞活力研究使用台盼蓝染料排斥方法或MTS测定来评估。本文所述的某些凋亡研究和相关研究通过FACS以膜联蛋白V阳性来确定。达成细胞生长抑制的50％抑制浓度(IC₅₀)和达成凋亡诱导的50％有效浓度(EC₅₀)使用CalcuSyn(BioSoft,Cambridge,UK)来计算。

免疫印迹测定：将细胞用化合物7在各种浓度下处理，并且收集以获得细胞溶解产物。所指示蛋白质的总水平和磷酸化水平通过蛋白质印迹来测定。

动物研究：将Balb/c小鼠用人细胞(例如FLTs-ITD突变白血病细胞MV4-11)注射(SQ)，并且用指示剂量的化合物7口服治疗(q.d.)14天。作用(例如抗白血病)通过测量肿瘤负荷来评估。口服毒性例如通过测量体重来评估。在第一天给药之后在所指示时间点测量血浆中的化合物7浓度。

基于抗增殖测定的MTS测定：进行MTS测定以评估抗增殖细胞外信号调控的激酶(Barltrop,J.A.等,(1991)5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4,5-dimethylthiazoly)-3-(4-sulfophenyl)tetrazolium,inner salt(MTS)and related analog of3-(4,5-dimethylthiazolyl)-2,5,-diphenyltetrazolium bromide(MTT)reducing to purplewater soluble activities of the inventive compounds via inhibition onformazans as cell-viability indicators.Bioorg.Med.Chem.Lett.1,611-4；Cory,A.H.等,(1991)；Use of an aqueous soluble tertrazolium/formazan assay for cellgrowth assays in culture.Cancer Comm.3,207-12)。人淋巴瘤细胞系例如Jeko-1(ATCC)、Mino(ATCC)、H9(韩国细胞系库(Korean Cell Line Bank))和SR(ATCC)以及人白血病细胞系例如MV4-11(ATCC)、Molm-13(DSMZ)和Ku812(ATCC)根据以下显示的程序用于测试。将各细胞(例如Jeko-1、Mino、H9、SR、MV4-11、Molm-13和Ku812细胞)在10,000个细胞/孔的密度下转移至含有补充以10％FBS的RPMI1640培养基(GIBCO，Invitrogen)的96孔板中，接着在37℃和5％20CO₂的条件下孵育24小时。将各孔用各0.2、1、5、25和100μM测试化合物处理。将孔用DMSO以0.08wt％的量处理，此用作对照，所述量是与在测试化合物的情况下相同的量。将所得细胞孵育48小时。MTS测定可商购获得，并且包括Promega CellTiter水性非放射性细胞增殖测定。进行MTS测定以评估测试化合物达成的细胞活力。将3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑鎓内盐(“MTS”)和甲硫酸吩嗪(PMS)的20μL混合溶液添加至各孔中，接着在37℃下孵育2小时。接着在490nm下读取样品的吸光度。相对于未处理对照组的吸光度，基于测试化合物的吸光度来计算抗增殖活性水平。计算测试化合物使癌细胞的生长降低50％所处的EC50(μM)值。通过使用例如Jeko-1、Mino、H9和SR淋巴瘤细胞来进行关于抗增殖活性的测定以便评估本发明化合物作为消炎剂以及抗癌剂的有效性。

RBC热点激酶测定方案：

所用试剂：基础反应缓冲液；20mM Hepes(pH 7.5)、10mM MgCl₂、1mM EGTA、0.02％Brij35、0.02mg/ml BSA、0.1mM Na₃VO₄、2mM DTT、1％DMSO。将所需辅因子个别地添加至各激酶反应中。

将化合物7溶解于100％DMSO中以获得指定浓度。通过epMotion 5070来在DMSO中进行连续稀释。在反应缓冲液中新鲜制备底物，并且添加为底物溶液所需的任何辅因子。将激酶添加至溶液中，并且温和混合。通过声学技术(Echo550；纳升范围)来将化合物7于100％DMSO中添加至激酶反应混合物中，并且在室温下孵育20分钟。将³³P-ATP(比放射性10μCi/μl)添加至反应混合物中以引发反应，将所述反应孵育2小时，之后通过滤纸结合方法来检测激酶活性。

信号传导测定。将细胞(例如MV4-11)用指定剂量(例如在500pM下)的化合物7或比较药物(例如奎扎替尼)或媒介物(例如DMSO)处理，接着经受关于FLT3和它的下游信号的蛋白质印迹。

细胞毒性程序：将细胞接种于96孔板中，并且用媒介物DMSO或化合物7在指定浓度下处理并孵育72小时。在72小时孵育期结束时，进行基于MTS的测定，并且通过GraphPadPrism7.0来测定IC50。

细胞周期分析：用媒介物DMSO或化合物7处理细胞，并且用PI和EdU染色，接着通过流式细胞术来分析以测定细胞周期的时期。

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