阅读说明：本技术 一种樟叶越桔悬浮细胞培养体系的建立方法 (Method for establishing suspension cell culture system of vaccinium camphorata ) 是由 赵平 唐军荣 刘云 阚欢 付羚 罗旭璐 张訸 于 2019-10-16 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种樟叶越桔悬浮细胞培养体系的建立方法,属于植物细胞工程领域。本发明所述方法,本发明所述方法以樟叶越桔组培苗的幼嫩叶为外植体,将处理好的幼嫩叶放入诱导培养基中诱导出愈伤组织,将愈伤组织转移到增殖培养基中,生长成适合悬浮培养的状态,将适宜的愈伤组织转移到液体培养基中,成为稳定的悬浮培养体系。本发明所述方法可以根据实际生产选择相应的培养组合进行生产,从而降低生产成本,提高效率,为工厂化生产樟叶越桔悬浮培养体系提供指导依据。(The invention discloses a method for establishing a suspension cell culture system of vaccinium dunalianum, belonging to the field of plant cell engineering. According to the method, young leaves of the vaccinium camphorata tissue culture seedling are taken as explants, the processed young leaves are placed into an induction culture medium to induce callus, the callus is transferred into a multiplication culture medium to grow into a state suitable for suspension culture, and the suitable callus is transferred into a liquid culture medium to form a stable suspension culture system. The method can select corresponding culture combination for production according to actual production, thereby reducing production cost, improving efficiency and providing guidance for industrialized production of the vaccinium camphorate suspension culture system.)

一种樟叶越桔悬浮细胞培养体系的建立方法

技术领域

本发明涉及一种樟叶越桔悬浮细胞培养体系的建立方法，属于植物细胞工程领域。

背景技术

樟叶越桔(Vaccinium dunalianum)为杜鹃花科(Ericaceae)越桔属(Vaccinium)常绿灌木，主要分布于云南西北部经滇中高原至滇南和滇东。其果实营养丰富，全株具有舒筋活络、祛风除湿等功效，具有较高的药用和保健价值。此外，樟叶越桔也是一种富含咖啡酰熊果苷类物质的特殊资源植物，其主要成分的黑色素生成抑制活性优于熊果苷，且毒性仅为熊果苷的1/2，可作为熊果苷天然替代资源加以开发利用。樟叶越桔目前仍处于野生状态，由于连年遭受破坏性采摘，导致其野生资源急剧减少，因此利用生物技术手段建立其培养体系具有重要意义。

植物细胞培养包括通过植物幼胚、原生质体、细胞、组织、器官的培养，生产重要的次生代谢产物、新的植物个体(种苗的快速繁殖)，以及进行植物细胞生理生化和遗传学研究的一个工程学和生物学相结合的交叉学科。近年来植物细胞培养以其独特的优势，越来越收到科学家的青睐，首先，细胞培养过程可以在培养皿中连续、均匀的进行，不会受到气候、病虫害等外界因素的影响；其次，培养过程可以在生物反应器中大规模进行，可以人为的对反应条件进行控制，提高目标产物的得率。近年来，国内学者利用细胞悬浮培养技术在人参(Panax ginseng)、西洋参(P.quinquefolius)、三七(P.notoginseng)、紫草(Lithospermum erythrorhizon)、红豆杉(Taxus chinensis)、雪莲(Saussureainvolucrata)和银杏(Ginkgo biloba)等药用植物次生代谢产物的生产调控上开展了许多研究，但细胞悬浮培养技术在樟叶越桔植物上的应用尚未见报道。本发明以樟叶越桔组培苗幼嫩叶为材料研究了愈伤组织的诱导及增殖条件，建立了樟叶越桔的细胞悬浮培养体系，以期进一步为樟叶越桔中咖啡酰熊果苷类物质的生产调控奠定基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种樟叶越桔悬浮细胞培养体系的建立方法，使用樟叶越桔组培苗的幼嫩叶诱导愈伤组织并建立细胞悬浮培养体系，该方法生产成本低，效率高，为工厂化生产樟叶越桔悬浮培养体系提供指导依据。

进一步的，本发明所述樟叶越桔悬浮细胞培养体系的建立方法，具体包括以下步骤：

(1)愈伤组织的诱导：切取樟叶越桔组培苗的幼嫩叶片，将叶片的正面或者背面划上条形伤口，将叶片的背面紧贴诱导培养基生长，诱导出愈伤组织；

所述诱导培养基为WPM基本培养基与细胞生长素的组合：WPM+1.0～2.0 mg/L 6-BA+0.05～1.0mg/L NAA+1.0～2.0mg/L 2,4-D+28～42g/L蔗糖+4.5～5.3g/L 琼脂。

本发明培养基中1.0～2.0mg/L 6-BA指1L的WPM基本培养基中加入 1.0～2.0mg的6-BA，28～42g/L蔗糖是指1L的WPM基本培养基中加入30g蔗糖，本发明中其他添加剂的表述的含义同上。

(2)愈伤组织的增殖：挑选挑选无褐化、生长旺盛的愈伤组织，转移至 WPM增殖培养基中培养，生长成适合悬浮培养的状态；

所述WPM增殖培养基为WPM基本培养基与细胞生长素的组合： WPM+1.0～2.0mg/LZT+0.2～0.6mg/L NAA+28～42g/L蔗糖+4.5～5.3g/L琼脂。

(3)悬浮体系的建立：挑选生长旺盛的半透明愈伤组织转移至液体培养基中(愈伤组织一般呈现暗黄色，半透明，能自行分散成近粉末状的愈伤颗粒适宜在液体培养基中生长，将此状态的愈伤组织转移至液体培养基，稍加碾压使其尽量分散)，培养7～10天后去掉大颗粒的愈伤组织，筛选后的小颗粒愈伤组织用无菌水充分清洗后，转移至新鲜的液体培养基中培养，形成稳定的悬浮培养体系，分离得到悬浮培养细胞Ⅰ；

所述培养基为WPM培养基与细胞生长素的组合：WPM培养基+1.5～2.5mg/L ZT+0.3～0.6mg/L NAA+28～42g/L蔗糖。

优选的，本发明步骤(1)中培养条件为：25±2℃，光照强度30-50μmol/m²·s，光照周期10～12h/d，培养时间为50～60d，长出的愈伤组织呈现出半透明，活性较强的优良状态。

优选的，本发明步骤(2)中愈伤组织的增殖的条件为：25±2℃，暗培养，培养时长70～90d；长出的愈伤组织除呈现半透明蓬松状态，还能在边缘处出现能自行分散成小颗粒的愈伤，此状态下的愈伤组织符合悬浮培养体系的要求。

优选的，本发明步骤(3)中培养条件为：25±2℃，暗培养，培养基pH值为4.8～5.2，摇床转速为120～160rpm/min，培养时长7～10d。

优选的，本发明步骤(3)中大小颗粒筛选过程为：用40～60目不锈钢筛过滤，筛下组织即为小颗粒愈伤组织。

优选的，本发明步骤(3)中WPM培养基替换为3/5有机的改良WPM培养基。

本发明所述WPM全称是WPM木本植物基本培养基，其中包括了大量元素 (硝酸铵400mg/L、硫酸钾990mg/L、硫酸镁370mg/L、磷酸二氢钾170mg/L)；钙盐(硝酸钙684mg/L)；微量元素(硫酸锰22.5mg/L、硫酸锌8.6mg/L、硼酸 6.2mg/L、硫酸铜0.25mg/L、钼酸钠0.25mg/L)；铁盐(硫酸亚铁27.8mg/L、乙二胺四乙酸37.3mg/L)；3/5有机四样(盐酸硫胺素1mg/L、盐酸吡哆锌0.5mg/L、烟酸0.5mg/L、甘氨酸2mg/L)；肌醇(100mg/L)；本发明所述改良培养基，是指相较于正常的WPM培养基，有机四样的含量只有普通的3/5。

根据实际需要，还可以进行悬浮体系的继代：将步骤(3)中的正常生长的愈伤组织在培养完成后，使用40～60目不锈钢筛过滤掉原液体培养基，并用无菌纸吸去水分，转移至新鲜的3/5有机的改良WPM培养基中培养，形成稳定的悬浮培养体系，分离得到悬浮培养细胞Ⅱ(用180～200目不锈钢筛过滤，180～200 目以上组织即为本发明所需的适宜悬浮培养体系的小颗粒愈伤组织，记为悬浮培养细胞Ⅱ)；

所述培养基为3/5有机的改良WPM培养基与细胞生长素的组合：3/5有机的改良WPM培养基+1.0～2.0mg/L ZT+0.1～0.2mg/L NAA+28～42g/L蔗糖；

培养条件为：25±2℃，暗培养，培养时长7～10d，培养基pH值为4.8～5.2，摇床转速为120～160rpm/min，培养基体积为40～50mL，接种量为20～40g/L。

进一步的，根据实际需要，还可以对培养悬浮培养体系进行改良，然后继续培养，包括两种方法：

方法一为：

悬浮培养细胞Ⅰ过180～200目筛，保留筛子上部的组织，用无菌滤纸吸干水分，接种至3/5有机的改良WPM培养基中，继续培养；

所述培养基为WPM固体基本培养基与细胞生长素的组合：3/5有机的改良 WPM培养基+1.0～2.0mg/L ZT+0.1～0.2mg/L NAA+28～42g/L蔗糖；

培养条件为：25±2℃，暗培养，培养时长10～20d，培养基pH值为4.8～5.2，摇床转速为120～160rpm/min，培养基体积为40～50mL，接种量为20～40g/L。

方法二为：

将悬浮培养细胞Ⅱ过180～200目筛，保留筛子上部的组织，用无菌滤纸吸干水分，接种至3/5有机的改良WPM培养基中，继续培养；

所述培养基为3/5有机的改良WPM培养基与细胞生长素的组合：WPM(3/5 有机)+1.0～2.0mg/L ZT+0.1～0.2mg/L NAA+28～42g/L蔗糖；

培养条件为：25±2℃，暗培养，培养时长10～20d，培养基pH值为4.8～5.2，摇床转速为120～160rpm/min，培养基体积为40～50mL，接种量为20～40g/L。

本发明所述WPM是指WPM固体培养基，6-BA是指6-苄氨基腺嘌呤，2,4-D 是指2,4-二氯苯氧乙酸，ZT是指玉米素，NAA是指α-萘乙酸。

评价樟叶越桔悬浮培养情况的指标是生物量；生物量是指悬浮培养中的愈伤细胞在滤去培养基，烘干去除水分后的净重，生物量可以反映不同的激素配比条件和培养基条件对悬浮培养体系生长情况的影响。

本发明的有益效果为：

(1)本发明所述方法选择合适的激素的配比，诱导培养出来的愈伤组织呈现半透明的黄色，无褐化现象，质量好，质地蓬松、胚性强的细胞，适宜悬浮培养。

(2)本发明所述方法愈伤组织的增殖培养时间的限定，得到呈现暗黄色，半透明，自行分散成近粉末状的愈伤颗粒，该愈伤颗粒能成功在液体中生存，转移至液体培养基后即自行分散，培养基呈浅黄色混浊，愈伤细胞会附在培养瓶内壁上但不会结块；传代后细胞维持悬浮状态，无明显褐化情况；其余状态下转移至液体中培养的细胞，传代后培养基清澈，无悬浮细胞。

(3)本发明选择植物生长素ZT加入培养基中，不仅利于愈伤组织的增殖，也可以让愈伤细胞在液体培养基中正常生长。

附图说明

图1为实施例1中A条件下诱导的愈伤组织情况。

图2为实施例1中愈伤组织的增殖情况。

图3为实施例3建立的悬浮培养体系的生长情况。

图4为实施例4悬浮培养细胞生长曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例本发明作进一步的详细说明，对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围并不限于所述内容。

实施例1

(1)樟叶越桔叶片的处理：切取樟叶越桔生长健壮、无木质化、叶片大小适中的组培苗的幼嫩叶片，将叶片的正面或者背面划上条形伤口，将叶片的背面紧贴培养基生长；接种于WPM诱导培养基上，可在两个月左右长出愈伤组织，且愈伤组织呈现出半透明，活性较强的优良状态。

所述培养条件为：25±2℃，光照强度控制在30-50μmol/m²·s(光照条件可选择此范围之内的任意值)，培养时间为60d；所述的培养基为WPM基本培养基与细胞生长素的组合：WPM+1.0～2.0mg/L 6-BA+0.05～1.0mg/L NAA+1.0～2.0 mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+5g/L琼脂；(培养基的成分如表1所示)。

表1不同激素配比对愈伤组织诱导的情况

通过表1可以看出：在不同激素的配比均能诱导出樟叶越桔愈伤组织，但愈伤组织的质地和质量相差较大；质地较硬、不蓬松的愈伤组织是不适宜悬浮培养的，本实施例中的激素配比下诱导出来的愈伤组织呈现半透明的黄色，无褐化现象，质量好，质地蓬松、胚性强的细胞(A组的形貌如图1所示)。

(2)愈伤组织的增殖：挑选浅黄色、半透明、无褐化生、长良好的愈伤组织，切成较小的块，如愈伤足够蓬松可轻轻掰下大小适宜的愈伤组织，以减少切面损伤，以减少后期褐化现象；转移至WPM增殖培养基中(转移至新培养基时保持愈伤组织原有的上下相位)。

所述的培养条件为：25±2℃，暗培养，培养时长90d；所述培养基为WPM 基本培养基与细胞生长素的组合：WPM+1.0～2.0mg/L ZT(此处可取1.0～2.0中的任意值，本实施例选1.5mg/L)+0.2～0.6mg/L NAA(此处可取0.2～0.6中的任意值，本实施例选0.4mg/L)+30g/L蔗糖+5g/L琼脂。

在试验过程中，将多种状态的愈伤组织转移至液体中，证实了只有在呈现暗黄色、半透明、自行分散成近粉末状的愈伤颗粒才能成功在液体中生存(即A、 B、C组中的愈伤组织)，转移至液体培养基后即自行分散，培养基呈浅黄色混浊，愈伤细胞会附在培养瓶内壁上但不会结块；传代后细胞维持悬浮状态，无明显褐化情况；其余状态下转移至液体中培养的细胞，传代后培养基清澈，无悬浮细胞(如图2所示)。

(3)悬浮体系的建立：挑选呈现暗黄色，半透明，自行分散成近粉末状的愈伤组织转移至液体培养基中，培养1周后用50目不锈钢筛过滤，去掉大颗粒的愈伤组织；筛选后的小颗粒愈伤组织用无菌水充分清洗后，转移至新鲜的液体培养基中培养。

所述的培养条件为：25±2℃，暗培养，培养基pH值为4.8～5.2，摇床转速为150rpm/min，培养时长14d；所述培养基为3/5有机的改良WPM培养基与细胞生长素的组合：3/5有机的改良WPM培养基+1.5～2.5mg/L ZT+0.3～0.6mg/L NAA+40g/L蔗糖。

表2悬浮培养激素配比对悬浮细胞生长情况的影响

编号	1	2	3	4	5	6	7
								ZT(mg/mL)	0.5	1.0	1.0	1.5	1.5	1.5	0
NAA(mg/mL)	0.0375	0.05	0.2	0.1	0.15	0.1125	0
								生物量(g)	0.2778	0.3488	0.3378	0.2957	0.3744	0.3667	0.3115

通过表2可以看出，当培养基添加量为1.5mg/L ZT与0.15mg/L NAA时，可以让愈伤细胞在液体培养基中正常生长，且生物量增长最大。

本实施例所得樟叶越桔悬浮培养情况的生物量为0.3744g。

实施例2

(1)樟叶越桔叶片的处理：切取樟叶越桔生长健壮、无木质化、叶片大小适中的组培苗的幼嫩叶片，将叶片的正面或者背面划上条形伤口，将叶片的背面紧贴培养基生长；接种于WPM诱导培养基上，可在两个月左右长出愈伤组织，且愈伤组织呈现出半透明，活性较强的优良状态。

所述培养条件为：25±2℃，光照强度30-50μmol/m²·s，培养时间为60d；所述的培养基为WPM基本培养基与细胞生长素的组合：WPM+2.0mg/L 6-BA+0.05mg/L NAA+2.0mg/L2,4-D+50g/L蔗糖+5g/L琼脂。

(2)愈伤组织的增殖：挑选浅黄色、半透明、无褐化生、长良好的愈伤组织，切成较小的块，如愈伤足够蓬松可轻轻掰下大小适宜的愈伤组织，以减少切面损伤，以减少后期褐化现象；转移至WPM增殖培养基中(转移至新培养基时保持愈伤组织原有的上下相位)。

所述的培养条件为：25±2℃，暗培养，培养时长90d；所述培养基为WPM 基本培养基与细胞生长素的组合：WPM+1.5mg/L ZT+0.4mg/L NAA+40g/L蔗糖+5 g/L琼脂。

(3)悬浮体系的建立：挑选生长旺盛的疏松态浅黄色半透明愈伤组织转移至液体培养基中，培养2周后用60目不锈钢筛过滤，去掉大颗粒的愈伤组织；筛选后的小颗粒愈伤组织用无菌水充分清洗后，转移至新鲜的液体培养基中培养，形成稳定的悬浮培养体系，分离得到悬浮培养细胞Ⅰ。

所述的培养条件为：25±2℃，暗培养，培养基pH值为4.8～5.2，摇床转速为160rpm/min，培养时长14d；所述培养基为3/5有机的改良WPM培养基与细胞生长素的组合：3/5有机的改良WPM培养基+2.0mg/L ZT+0.5mg/L NAA+30g/L蔗糖。

(4)将步骤(3)中的正常生长的愈伤组织在培养完成后，使用60目不锈钢筛过滤掉原液体培养基，并用无菌纸吸去水分，转移至新鲜的3/5有机的改良 WPM培养基中培养，形成稳定的悬浮培养体系，分离得到悬浮培养细胞Ⅱ；

所述培养基为3/5有机的改良WPM培养基与细胞生长素的组合：3/5有机的改良WPM培养基+1.5mg/L ZT+0.1mg/L NAA+28g/L蔗糖；

培养条件为：25±2℃，暗培养，培养时长10d，培养基pH值为5.2，摇床转速为160rpm/min，培养基体积为50mL，接种量为40g/L。

本实施例得到的悬浮培养体系生长稳定，细胞活力较好，褐化不明显。

实施例3

本实施例所有步骤和实施例2相同，不同在于：将实施例2得到的悬浮培养细胞Ⅱ过200目筛滤去培养基，保留筛子上部的组织，用无菌滤纸吸干水分，接种至3/5有机的改良WPM培养基中，继续培养。

所述培养基为WPM基本培养基与细胞生长素的组合：WPM(3/5有机) +1.0～2.0mg/L ZT+0.1～0.2mg/L NAA+28～42g/L蔗糖。

培养条件为：25±2℃，暗培养，培养时长14d，培养基pH值为4.8～5.2，摇床转速为150rpm/min，培养基体积为50mL，接种量为40g/L。

表3不同培养基对悬浮培养系的影响

培养基种类	生物量(g)
		1/5有机	0.3452
3/5有机	0.3600
		普通	0.3271
2倍大量	0.3532

由表3可以看出培养体系在3/5有机组的生物量积累最大，故选择改良培养基为WPM(3/5有机)，在WPM(3/5有机)条件下悬浮培养体系生长稳定，如图3所示。

本实施例得到的悬浮培养体系生长稳定，细胞活力较好，褐化不明显。

实施例4

(1)樟叶越桔叶片的处理：切取樟叶越桔生长健壮、无木质化、叶片大小适中的组培苗的幼嫩叶片，将叶片的正面或者背面划上条形伤口，将叶片的背面紧贴培养基生长；接种于WPM诱导培养基上，可在两个月左右长出愈伤组织，且愈伤组织呈现出半透明，活性较强的优良状态。

所述培养条件为：25±2℃，光照强度30-50μmol/m²·s，培养时间为60d；所述的培养基为WPM基本培养基与细胞生长素的组合：WPM+1.6mg/L 6-BA+0.8mg/L NAA+1.6mg/L 2,4-D+35g/L蔗糖+5g/L琼脂。

(2)愈伤组织的增殖：挑选浅黄色、半透明、无褐化生、长良好的愈伤组织，切成较小的块，如愈伤足够蓬松可轻轻掰下大小适宜的愈伤组织，以减少切面损伤，以减少后期褐化现象；转移至WPM增殖培养基中(转移至新培养基时保持愈伤组织原有的上下相位)。

所述的培养条件为：25±2℃，暗培养，培养时长90d。所述培养基为WPM 基本培养基与细胞生长素的组合：WPM+1.6mg/L ZT+0.4mg/L NAA+40g/L蔗糖 +5g/L琼脂。

(3)悬浮体系的建立：挑选生长旺盛的疏松态浅黄色半透明愈伤组织转移至液体培养基中，培养2周后用40目不锈钢筛过滤，去掉大颗粒的愈伤组织；筛选后的小颗粒愈伤组织用无菌水充分清洗后，转移至新鲜的液体培养基中培养。

所述的培养条件为：25±2℃，暗培养，培养基pH值为4.8～5.2，摇床转速为140rpm/min，培养时长14d；所述培养基为WPM基本培养基与细胞生长素的组合：WPM+2.0mg/L ZT+0.4mg/L NAA+32g/L蔗糖。

(4)悬浮培养细胞Ⅰ过200目筛，保留筛子上部的组织，用无菌滤纸吸干水分，接种至3/5有机的改良WPM培养基中，继续培养；

所述培养基为WPM固体基本培养基与细胞生长素的组合：WPM(3/5有机) +1.5mg/LZT+0.15mg/L NAA+30g/L蔗糖；

培养条件为：25±2℃，暗培养，培养时长14d，培养基pH值为4.8～5.2，摇床转速为140rpm/min，培养基体积为50mL，接种量为40g/L。

本实施例得到的悬浮培养体系生长稳定，褐化不明显，可稳定进行多次继代 (如图4所示)，适宜进行其他试验操作。