苦楝组织培养染色体加倍快速繁殖方法
阅读说明：本技术 苦楝组织培养染色体加倍快速繁殖方法 (Chinaberry tissue culture chromosome doubling rapid propagation method ) 是由 杨超伟 吴创业 高福玲 寿园园 顺玉恒 彭万喜 杨彩琴 范建力 岳华峰 杨绍彬 于 2019-10-23 设计创作，主要内容包括：本发明公开苦楝组织培养染色体加倍快速繁殖方法,包括如下步骤：(1)外植体选取及清洗；(2)外植体消毒；(3)初代培养；(4)继代增殖培养；(5)生根培养；(6)炼苗移栽。本发明通过在初代培养基中加入IAA和二氯喹啉酸,并且采用间断式低温超声诱导培养,获得了染色体加倍的植株。(The invention discloses a rapid propagation method of neem by chromosome doubling in tissue culture, which comprises the following steps: (1) selecting and cleaning explants; (2) sterilizing explants; (3) primary culture; (4) subculture multiplication culture; (5) rooting culture; (6) hardening and transplanting the seedlings. The invention obtains the plant with doubled chromosomes by adding IAA and quinclorac into the primary culture medium and adopting discontinuous low-temperature ultrasonic induction culture.)
技术领域
本发明涉及组织培养技术领域。具体地说是苦楝组织培养染色体加倍快速繁殖方法。
背景技术
苦楝为楝科落叶乔木植物，作为河南地区的乡土树种，能够吸收二氧化硫等有毒有害气体，同时可以防治农业害虫。并且，苦楝耐烟尘污染，可种植于工厂矿区等地方作为绿化树种。为此，有必要发挥苦楝的优点，进行规模化种植苦楝，起到绿化、治污及防虫等多重作用。
现有技术中有针对苦楝进行染色体加倍的方法，以期获得植株健壮粗大的多倍体苦楝树。但是，一般染色体加倍多用秋水仙素，而秋水仙素剧毒且昂贵，市场上公开购买非常困难，并且实际使用中存在很大的安全隐患，难以在种植户中规模化推广应用。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种简便易行且能够在种植户中进行市场化推广应用的苦楝组织培养染色体加倍快速繁殖方法。
为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
苦楝组织培养染色体加倍快速繁殖方法，包括如下步骤：
(1)外植体选取及清洗；
(2)外植体消毒；
(3)初代培养：在WPM培养基中加入蔗糖、琼脂、TDZ、IAA和/或二氯喹啉酸，并调节pH为5.5-6.5，制成初代培养基；蔗糖的浓度为30-45g/L、琼脂的浓度为6-8g/L、TDZ的浓度为0.2-0.4mg/L、IAA的浓度为0.2-0.4mg/L、二氯喹啉酸的浓度为0.05-0.1mg/L；将外植体接种到初代培养基，避光、温度为20-25℃条件下进行培养，每隔10-15天进行一次低温诱导培养，为一个培养周期，共计6-10个培养周期；
(4)继代增殖培养；
(5)生根培养；
(6)炼苗移栽。
上述苦楝组织培养染色体加倍快速繁殖方法，在步骤(1)中：选取苦楝嫩枝，去叶留芽，浸泡于200-500倍洗洁精溶液中1-5min，然后使用医用脱脂棉蘸取所述洗洁精溶液仔细擦洗枝条表皮，重复2-3次，最后用无菌水冲洗干净。
上述苦楝组织培养染色体加倍快速繁殖方法，在步骤(2)中：将外植体浸泡于体积分数为75％的医用酒精中5-10s，取出后再用医用脱脂棉蘸取所述医用酒精仔细擦洗枝条表皮，再用无菌水冲洗2-3次；剪成1-2cm长的茎段后，再在体积分数为75％的医用酒精中浸泡10-20s，然后用无菌水冲洗2-3次；然后再置于浓度为0.1wt％-1wt％的HgCl2溶液中5-10min，最后用无菌水冲洗干净。
上述苦楝组织培养染色体加倍快速繁殖方法，在步骤(4)中：在WPM培养基中加入蔗糖、琼脂、NAA和6-BA，并调节pH为5.5-6.5，制成继代增殖培养基；蔗糖的浓度为30-45g/L、琼脂的浓度为6-8g/L、NAA的浓度为1-2mg/L、6-BA的浓度为1-2mg/L；将经过步骤(3)培养后的外植体接种到继代增殖培养基上，在温度为25℃的条件下培养60天。
上述苦楝组织培养染色体加倍快速繁殖方法，在步骤(5)中：在WPM培养基中加入蔗糖、琼脂、NAA和IBA，并调节pH为5.5-6.5，制成生根培养基；蔗糖的浓度为15-30g/L、琼脂的浓度为6-8g/L、NAA的浓度为0.1-0.5mg/L、IBA的浓度为0.1-1mg/L；将经过步骤(4)培养后得到的组培苗接种到生根培养基上，在温度为25℃的条件下培养90天。
上述苦楝组织培养染色体加倍快速繁殖方法，在步骤(6)中：移栽前对组培生根苗进行炼苗，炼苗后移栽入腐殖土和蛭石组成的栽培基质中。
上述苦楝组织培养染色体加倍快速繁殖方法，在步骤(3)中：低温诱导培养条件如下：4℃条件下培养12h。
上述苦楝组织培养染色体加倍快速繁殖方法，在步骤(3)中：在低温诱导培养时：每隔4h超声一次，超声时间为1-5min。
上述苦楝组织培养染色体加倍快速繁殖方法，在步骤(3)中：超声频率为20-40KHz，超声功率为50-100W。
上述苦楝组织培养染色体加倍快速繁殖方法，在步骤(3)中：每次低温诱导培养后，向培养基中加入吲哚乙酸钾，加量为每升培养基加入0.05-0.1mg。
本发明的技术方案取得了如下有益的技术效果：通过在初代培养基中加入IAA和二氯喹啉酸，同时采用间断式低温超声诱导培养，辅以吲哚乙酸钾诱导，可以大幅度地提高植株加倍率。本发明的培养条件简单易行，所用试剂能够方便地从市场上公开购买到，可以在苦楝种植户中进行市场化推广应用。
具体实施方式
实施例1
本实施例苦楝组织培养染色体加倍快速繁殖方法包括如下步骤：
(1)外植体选取及清洗；选取苦楝嫩枝，去叶留芽，浸泡于200倍洗洁精溶液(立白洗洁精，1mL洗洁精兑200mL自来水)中5min，然后使用医用脱脂棉蘸取所述洗洁精溶液仔细擦洗枝条表皮，重复3次，最后用无菌水冲洗干净。
(2)外植体消毒；将外植体浸泡于体积分数为75％的医用酒精中10s，取出后再用医用脱脂棉蘸取所述医用酒精仔细擦洗枝条表皮，再用无菌水冲洗2-3次；剪成1-2cm长的茎段后，再在体积分数为75％的医用酒精中浸泡15s，然后用无菌水冲洗2-3次；然后再置于浓度为0.5wt％的HgCl2溶液中5min，最后用无菌水冲洗干净。
(3)初代培养：在WPM培养基中加入蔗糖、琼脂、TDZ、IAA和二氯喹啉酸，并调节pH为6.5，制成初代培养基；蔗糖的浓度为35g/L、琼脂的浓度为7g/L、TDZ的浓度为0.3mg/L、IAA的浓度为0.4mg/L、二氯喹啉酸的浓度为0.1mg/L；将外植体接种到初代培养基，避光、温度为25℃条件下进行培养，每隔10天进行一次低温诱导培养，为一个培养周期，共计6个培养周期；低温诱导培养条件如下：4℃条件下培养12h。
(4)继代增殖培养；在WPM培养基中加入蔗糖、琼脂、NAA和6-BA，并调节pH为6.5，制成继代增殖培养基；蔗糖的浓度为35g/L、琼脂的浓度为7g/L、NAA的浓度为1mg/L、6-BA的浓度为1mg/L；将经过步骤(3)培养后的外植体接种到继代增殖培养基上，在温度为25℃的条件下培养60天。
(5)生根培养；在WPM培养基中加入蔗糖、琼脂、NAA和IBA，并调节pH为6.5，制成生根培养基；蔗糖的浓度为17.5g/L、琼脂的浓度为7g/L、NAA的浓度为0.2mg/L、IBA的浓度为0.5mg/L；将经过步骤(4)培养后得到的组培苗接种到生根培养基上，在温度为25℃的条件下培养90天。
(6)炼苗移栽：移栽前对组培生根苗进行炼苗，炼苗后移栽入腐殖土和蛭石组成的栽培基质中。选取生根的苦楝植株，取茎尖和根尖，观察染色体数目，统计加倍的植株数目，平均植株加倍率为12.1％。
实施例2
本实施例苦楝组织培养染色体加倍快速繁殖方法包括如下步骤：
(1)外植体选取及清洗；选取苦楝嫩枝，去叶留芽，浸泡于200倍洗洁精溶液(立白洗洁精，1mL洗洁精兑200mL自来水)中5min，然后使用医用脱脂棉蘸取所述洗洁精溶液仔细擦洗枝条表皮，重复3次，最后用无菌水冲洗干净。
(2)外植体消毒；将外植体浸泡于体积分数为75％的医用酒精中10s，取出后再用医用脱脂棉蘸取所述医用酒精仔细擦洗枝条表皮，再用无菌水冲洗2-3次；剪成1-2cm长的茎段后，再在体积分数为75％的医用酒精中浸泡15s，然后用无菌水冲洗2-3次；然后再置于浓度为0.5wt％的HgCl2溶液中5min，最后用无菌水冲洗干净。
(3)初代培养：在WPM培养基中加入蔗糖、琼脂、TDZ、IAA和二氯喹啉酸，并调节pH为6.5，制成初代培养基；蔗糖的浓度为35g/L、琼脂的浓度为7g/L、TDZ的浓度为0.3mg/L、IAA的浓度为0.4mg/L、二氯喹啉酸的浓度为0.1mg/L；将外植体接种到初代培养基，避光、温度为25℃条件下进行培养，每隔10天进行一次低温诱导培养，为一个培养周期，共计6个培养周期。低温诱导培养条件如下：4℃条件下培养12h；并且在低温诱导培养的同时：每隔4h超声一次，超声时间为2min，超声频率为28KHz，超声功率为50W。
(4)继代增殖培养；在WPM培养基中加入蔗糖、琼脂、NAA和6-BA，并调节pH为6.5，制成继代增殖培养基；蔗糖的浓度为35g/L、琼脂的浓度为7g/L、NAA的浓度为1mg/L、6-BA的浓度为1mg/L；将经过步骤(3)培养后的外植体接种到继代增殖培养基上，在温度为25℃的条件下培养60天。
(5)生根培养；在WPM培养基中加入蔗糖、琼脂、NAA和IBA，并调节pH为6.5，制成生根培养基；蔗糖的浓度为17.5g/L、琼脂的浓度为7g/L、NAA的浓度为0.2mg/L、IBA的浓度为0.5mg/L；将经过步骤(4)培养后得到的组培苗接种到生根培养基上，在温度为25℃的条件下培养90天。
6)炼苗移栽：移栽前对组培生根苗进行炼苗，炼苗后移栽入腐殖土和蛭石组成的栽培基质中。选取生根的苦楝植株，取茎尖和根尖，观察染色体数目，统计加倍的植株数目，平均植株加倍率为36.7％。
实施例3
本实施例苦楝组织培养染色体加倍快速繁殖方法包括如下步骤：
(1)外植体选取及清洗；选取苦楝嫩枝，去叶留芽，浸泡于200倍洗洁精溶液(立白洗洁精，1mL洗洁精兑200mL自来水)中5min，然后使用医用脱脂棉蘸取所述洗洁精溶液仔细擦洗枝条表皮，重复3次，最后用无菌水冲洗干净。
(2)外植体消毒；将外植体浸泡于体积分数为75％的医用酒精中10s，取出后再用医用脱脂棉蘸取所述医用酒精仔细擦洗枝条表皮，再用无菌水冲洗2-3次；剪成1-2cm长的茎段后，再在体积分数为75％的医用酒精中浸泡15s，然后用无菌水冲洗2-3次；然后再置于浓度为0.5wt％的HgCl2溶液中5min，最后用无菌水冲洗干净。
(3)初代培养：在WPM培养基中加入蔗糖、琼脂、TDZ、IAA和二氯喹啉酸，并调节pH为6.5，制成初代培养基；蔗糖的浓度为35g/L、琼脂的浓度为7g/L、TDZ的浓度为0.3mg/L、IAA的浓度为0.4mg/L、二氯喹啉酸的浓度为0.1mg/L；将外植体接种到初代培养基，避光、温度为25℃条件下进行培养，每隔10天进行一次低温诱导培养，为一个培养周期，共计6个培养周期。低温诱导培养条件如下：4℃条件下培养12h；并且在低温诱导培养的同时：每隔4h超声一次，超声时间为2min，超声频率为28KHz，超声功率为50W。每次低温诱导培养后，向培养基中加入吲哚乙酸钾，加量为每升培养基加入0.1mg。
(4)继代增殖培养；在WPM培养基中加入蔗糖、琼脂、NAA和6-BA，并调节pH为6.5，制成继代增殖培养基；蔗糖的浓度为35g/L、琼脂的浓度为7g/L、NAA的浓度为1mg/L、6-BA的浓度为1mg/L；将经过步骤(3)培养后的外植体接种到继代增殖培养基上，在温度为25℃的条件下培养60天。
(5)生根培养；在WPM培养基中加入蔗糖、琼脂、NAA和IBA，并调节pH为6.5，制成生根培养基；蔗糖的浓度为17.5g/L、琼脂的浓度为7g/L、NAA的浓度为0.2mg/L、IBA的浓度为0.5mg/L；将经过步骤(4)培养后得到的组培苗接种到生根培养基上，在温度为25℃的条件下培养90天。
6)炼苗移栽：移栽前对组培生根苗进行炼苗，炼苗后移栽入腐殖土和蛭石组成的栽培基质中。选取生根的苦楝植株，取茎尖和根尖，观察染色体数目，统计加倍的植株数目，平均植株加倍率为57.4％。
对比例1
本实施例苦楝组织培养染色体加倍快速繁殖方法包括如下步骤：
(1)外植体选取及清洗；选取苦楝嫩枝，去叶留芽，浸泡于200倍洗洁精溶液(立白洗洁精，1mL洗洁精兑200mL自来水)中5min，然后使用医用脱脂棉蘸取所述洗洁精溶液仔细擦洗枝条表皮，重复3次，最后用无菌水冲洗干净。
(2)外植体消毒；将外植体浸泡于体积分数为75％的医用酒精中10s，取出后再用医用脱脂棉蘸取所述医用酒精仔细擦洗枝条表皮，再用无菌水冲洗2-3次；剪成1-2cm长的茎段后，再在体积分数为75％的医用酒精中浸泡15s，然后用无菌水冲洗2-3次；然后再置于浓度为0.5wt％的HgCl2溶液中5min，最后用无菌水冲洗干净。
(3)初代培养：在WPM培养基中加入蔗糖、琼脂、TDZ和IAA，并调节pH为6.5，制成初代培养基；蔗糖的浓度为35g/L、琼脂的浓度为7g/L、TDZ的浓度为0.3mg/L、IAA的浓度为0.4mg/L、二氯喹啉酸的浓度为0.1mg/L；将外植体接种到初代培养基，避光、温度为25℃条件下进行培养，每隔10天进行一次低温诱导培养，为一个培养周期，共计6个培养周期。低温诱导培养条件如下：4℃条件下培养12h；并且在低温诱导培养的同时：每隔4h超声一次，超声时间为2min，超声频率为28KHz，超声功率为50W。每次低温诱导培养后，向培养基中加入吲哚乙酸钾，加量为每升培养基加入0.1mg。
(4)继代增殖培养；在WPM培养基中加入蔗糖、琼脂、NAA和6-BA，并调节pH为6.5，制成继代增殖培养基；蔗糖的浓度为35g/L、琼脂的浓度为7g/L、NAA的浓度为1mg/L、6-BA的浓度为1mg/L；将经过步骤(3)培养后的外植体接种到继代增殖培养基上，在温度为25℃的条件下培养60天。
(5)生根培养；在WPM培养基中加入蔗糖、琼脂、NAA和IBA，并调节pH为6.5，制成生根培养基；蔗糖的浓度为17.5g/L、琼脂的浓度为7g/L、NAA的浓度为0.2mg/L、IBA的浓度为0.5mg/L；将经过步骤(4)培养后得到的组培苗接种到生根培养基上，在温度为25℃的条件下培养90天。
6)炼苗移栽：移栽前对组培生根苗进行炼苗，炼苗后移栽入腐殖土和蛭石组成的栽培基质中。选取生根的苦楝植株，取茎尖和根尖，观察染色体数目，统计加倍的植株数目，平均植株加倍率为16.3％。
由实施例1至实施例3及对比例1可以看出：在初代培养中进行染色体诱导，初代培养基中加入IAA和二氯喹啉酸，在培养过程中进行间断式低温诱导，同时在低温诱导过程中辅以超声及吲哚乙酸钾诱导，可以起到协同诱导作用，大幅度提高植株加倍率。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本专利申请权利要求的保护范围之中。