阅读说明：本技术 一种具有同侧推拉电子效应的环脒基荧光分子及其制备方法 (Cyclic amidine-based fluorescent molecule with ipsilateral push-pull electronic effect and preparation method thereof ) 是由 洪亮 李国锋 赵漫 于 2019-09-05 设计创作，主要内容包括：本发明所述的具有同侧推拉电子效应的环脒基荧光分子,所述荧光分子的结构式为：<Image he="176" wi="380" file="DDA0002192507800000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>所述环脒基荧光分子含有同时具有推电子基团(EDG)和拉电子基团(EWG)的脒基结构,从而构建了具有10π电子结构的新型骨架分子,在该结构中,推电子基团和拉电子基团在π电子同侧,这种结构具有大斯托克斯位移(约为100nm)、优异的酸碱稳定性,在pH值为2.8-11.4范围内荧光性质稳定,同时所述荧光分子不具有明显的细胞毒性,具有广阔的生物学应用前景。还公开了该荧光分子的制备方法,该方法工艺简单,条件温和,适宜于工业化批量生产。(The cyclic amidine-based fluorescent molecule with the ipsilateral push-pull electronic effect has the structural formula as follows: the cyclic amidine-based fluorescent molecule contains an amidino structure simultaneously provided with an Electron Donating Group (EDG) and an Electron Withdrawing Group (EWG), so that a novel framework molecule with a 10 pi electronic structure is constructed, in the structure, the electron donating group and the electron withdrawing group are on the same side of pi electrons, the structure has large Stokes shift (about 100nm), excellent acid-base stability and stable fluorescence property within the pH value of 2.8-11.4, and meanwhile, the fluorescent molecule does not have obvious cytotoxicity and has a wide biological application prospect. Also discloses a preparation method of the fluorescent molecule, which has simple process and mild conditions and is suitable for industrial batch production.)

一种具有同侧推拉电子效应的环脒基荧光分子及其制备方法

技术领域

本发明属于生化检测技术领域，涉及一种荧光分子探针及其制备方法，具体地说涉及一种具有同侧推拉电子效应的环脒基荧光分子及其制备方法。

背景技术

随着生命科学研究的快速发展，荧光分子探针在细胞免疫学、分子生物学、分子遗传学等方面应用越来越广泛，已经成为生命科学研究的重要工具之一。在众多荧光分子探针材料中，有机小分子荧光染料由于具有灵敏度高、结构多样、特异性良好，在化学和生物学领域中得到了广泛的应用，特别是低分子量有机荧光团，其细胞渗透性好、对生命系统干扰小、灵敏度高、响应速度快，在光学成像和分析感测中具有优于蛋白质探针的显著优势而被重点关注。常用的荧光分子探针材料主要有：6-丙酰基-2-(N,N-二甲胺基)萘(PRODAN)、香豆素(AMCA)、荧光素(FITC)、二氟化硼-2-二-吡咯甲烷(BODIPY)、硝基苯并-2-氧杂-1,3二唑(NBD)、花青素(Cy3)等荧光染料。

有机荧光染料一般含有较大的共轭体系，这是因为大共轭体系的离域π电子更容易被激发跃迁至激发态而产生荧光。因此，发展大共轭体系分子的合成策略可以作为新型荧光染料发现的切入点。在共轭体系的适当位置引入推电子基团(EDG)和拉电子基团(EWG)将形成具有“推-拉”结构的分子内转移化合物，这类化合物的π电子具有较好的离域性，在基态下就可形成具有一定极性的偶极子，且在光激发下这种极性将增强。例如：Prodan母体萘的荧光很微弱，而在它的对位分别引入推电子基团和拉电子基团，吸收波长红移并且荧光强度显著增加。在传统的“推-拉”电子型荧光分子中，推电子基团(EDG)和拉电子基团(EWG)往往分布在π电子结构的两侧(如图1所示)。

目前，荧光探针的合成研究大多集中在对具有经典“核心”染料如香豆素、荧光素、BODIPY或花青素结构进行修饰的开发。这种基于结构修饰的改造策略强调了“核心”荧光团在染料精制和改性中固有模块性的重要性，但也揭示了这种策略在回避核心骨架固有缺陷性问题上的局限性。比如荧光素、罗丹明等氧杂蒽类荧光染料，由于醌和螺内酯结构之间的互变异构，具有pH依赖性的缺点，这一缺点限制了其在特定环境下的灵敏度，也限制了其在酸性合成环境下的应用。此外，荧光素、罗丹明、恶嗪和花青素等荧光染料显示出小于30nm的斯托克斯位移，这种激发光谱和发射光谱之间的严重串扰通常会导致较差的信噪比和由于生物样品反向散射引起自淬灭。

发明内容

为此，本发明正是要解决上述技术问题，从而提出一种同时含有推电子基团(EDG)和拉电子基团(EWG)的具有同侧推拉电子效应的环脒基荧光分子及其制备方法。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：

本发明提供一种具有同侧推拉电子效应的环脒基荧光分子，所述荧光分子的结构式为：其中，R¹为接在10π电子环5、6、7、8位的氢、氟、氯、溴、碘、甲氧基、羟基、二乙胺、哌啶、四氢吡咯、硝基、芳基或氰基，R²为无取代基或具有1-4个取代基的五元芳环或六元芳环、含氮杂环、含氧杂环或含硫杂环，所述R³为对甲苯磺酰基、甲磺酰基、烷基、无取代基或具有1-4个取代基的五元芳环或六元芳环、含氮杂环、含氧杂环或含硫杂环。

作为优选，所述荧光分子由N-磺酰基***苯甲醛与芳基胺反应得到。

作为优选，所述荧光分子具有10π共轭电子结构。

作为优选，所述10π共轭电子结构由6π电环化反应得到。

作为优选，所述荧光分子为

本发明还提供一种制备所述的具有同侧推拉电子效应的环脒基荧光分子的方法，其包括如下步骤：

S1、按照1:1～5的摩尔比将N-磺酰基***苯甲醛与芳基胺混合后，加入溶剂，在密封的条件下于110～140℃下搅拌2～10h，冷却至室温，得到预产物；

S2、将所述预产物过硅胶柱纯化处理，得到所述环脒基荧光分子。

作为优选，所述步骤S1中，冷却至室温之前，还包括通过薄层色谱指示反应完成的步骤。

作为优选，所述步骤S2中，所述硅胶柱的洗脱体系为二氯乙烷-甲醇体系，所述二氯乙烷与甲醇的体积比为20:1～10:1。

作为优选，所述步骤S1中，反应温度为120℃，搅拌时间为4h。

作为优选，所述溶剂为氯仿、四氯化碳、甲苯、二氯乙烷、1,2-二氯乙烷、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、甲醇、乙醇、异丙醇、叔丁醇、四氢呋喃或1,4-二氧六环的一种

本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：

(1)本发明所述的具有同侧推拉电子效应的环脒基荧光分子，所述荧光分子的结构式为：所述环脒基荧光分子含有同时具有推电子基团(EDG)和拉电子基团(EWG)的脒基结构，从而构建了具有10π电子结构的新型骨架分子，在该结构中，推电子基团和拉电子基团在π电子同侧，这种结构具有大斯托克斯位移(约为100nm)、优异的酸碱稳定性，在pH值为2.8-11.4范围内荧光性质稳定，同时所述荧光分子不具有明显的细胞毒性，具有广阔的生物学应用前景。

(2)本发明所述的具有同侧推拉电子效应的环脒基荧光分子的制备方法，其制备工艺简单，条件温和，适宜于工业化批量生产。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中

图1是现有技术中具有推拉电子效应的有机荧光染料的示意图；

图2是本发明实施例所述的具有同侧推拉电子效应的环脒基荧光分子的示意图；

图3是本发明实施例1所述的具有同侧推拉电子效应的环脒基荧光分子的¹H NMR谱图；

图4是本发明实施例1所述的具有同侧推拉电子效应的环脒基荧光分子的¹³C NMR谱图；

图5是本发明实施例1所述的具有同侧推拉电子效应的环脒基荧光分子的吸收和发射光谱；

图6是本发明实施例1所述的具有同侧推拉电子效应的环脒基荧光分子在不同pH下的荧光光谱图；

图7是本发明实施例1所述的具有同侧推拉电子效应的环脒基荧光分子的细胞毒性测试图；

图8是本发明实施例2所述的具有同侧推拉电子效应的环脒基荧光分子的¹H NMR谱图；

图9是本发明实施例2所述的具有同侧推拉电子效应的环脒基荧光分子的¹³C NMR谱图；

图10是本发明实施例2所述的具有同侧推拉电子效应的环脒基荧光分子的吸收和发射光谱；

图11是本发明实施例3所述的具有同侧推拉电子效应的环脒基荧光分子的¹H NMR谱图；

图12是本发明实施例3所述的具有同侧推拉电子效应的环脒基荧光分子的¹³C NMR谱图；

图13是本发明实施例3所述的具有同侧推拉电子效应的环脒基荧光分子的吸收和发射光谱；

图14是本发明实施例4所述的具有同侧推拉电子效应的环脒基荧光分子的¹H NMR谱图；

图15是本发明实施例4所述的具有同侧推拉电子效应的环脒基荧光分子的¹³C NMR谱图；

图16是本发明实施例4所述的具有同侧推拉电子效应的环脒基荧光分子的吸收和发射光谱。

具体实施方式

实施例1

本实施例提供一种具有同侧推拉电子效应的环脒基荧光分子，其结构式为：其中，R¹接在10π电子环5、6、7、8位的氢、氟、氯、溴、碘、甲氧基、羟基、二乙胺、哌啶、四氢吡咯、硝基、芳基或氰基中的一种，R²为无取代基或具有1-4个取代基的五元芳环或者为无取代基或具有1-4个取代基的六元芳环、含氮杂环、含氧杂环或含硫杂环，所述R³为对甲苯磺酰基、甲磺酰基、烷基、无取代基或具有1-4个取代基的五元芳环或者为无取代基或具有1-4个取代基的六元芳环、含氮杂环、含氧杂环或含硫杂环。

所述荧光分子由芳基上不同取代的***苯甲醛1与芳基胺2反应得到，其反应式为：

所述芳基上不同取代的***苯甲醛1作为起始原料，与不同的芳基胺2反应，经过6π电环化反应，实现了具有10π共轭电子结构荧光分子的合成。通过考察反应的催化剂、溶剂、温度，确保6π电环化反应的顺利进行。经过条件的不断优化改进，建立合成目标产物的最佳反应条件；并以此为基础，实现不同芳基胺都能适用的新反应策略，利用该合成策略，合成了具有不同位置不同取代基效应的荧光分子库，均表现出了优异的光学性质。

具体地，本实施例中，所述R²为R³为对甲苯磺酰基(Ts)，所述荧光分子的结构式为：

还提供了一种环脒基荧光分子的制备方法：

S1、将0.1mmol N-磺酰基***苯甲醛与0.12mmol苯胺置于封管中，加入2mL CHCl₃溶剂，将封管密闭，并置于120℃下搅拌4h，通过薄层色谱(TLC)指示反应完成后，将产物冷却至室温。

S2、通过硅胶柱纯化步骤S1得到的产物，所述硅胶柱的洗脱体系为二氯乙烷-甲醇体系，所述二氯乙烷(DCM)与甲醇(MeOH)的体积比为20:1-10:1，本实施例中为DCM:MeOH＝15:1，得到黄色固体荧光分子产物。

所述荧光分子产物的核磁共振(NMR)谱图如图3-4所示，具体测试数据如下：

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ8.44(s,1H),7.93(s,1H),7.67(d,J＝8.2Hz,2H),7.58(d,J＝8.5Hz,1H),7.51(d,J＝5.1Hz,2H),7.49–7.42(m,3H),7.35–7.28(m,2H),7.22–7.15(m,1H),7.12(d,J＝8.0Hz,2H),2.33(s,3H)。

¹³C NMR(100MHz,CDCl₃):δ152.5,142.7,141.8,141.6,141.3,141.1,134.2,129.6,129.4,128.9,127.9,126.6,126.2,125.7,125.4,120.0,111.4,21.4。

所述荧光分子产物的红外(IR)谱图中，吸收峰的位置分别位于：2923,1640,1601,1494,1471,1367,1274,1262,1131,1080,951,763cm^-1。

所述荧光分子的高分辨率质谱HRMS(ESI)测试结果为：C₂₂H₁₈N₂O₂S+H,Calc:375.1162,Found:375.1148。

所述荧光分子的吸收和发射光谱如图5所示，由图可见，所述荧光分子具有大的斯托克斯位移。

所述荧光分子在不同pH条件下的荧光光谱如图6所示，由图可见，所述荧光分子在pH值为2.83-11.37之间，荧光强度相近，说明其具有高酸碱稳定性。

所述荧光分子的细胞毒性测试结果如图7所示，由图可见，所述荧光分子具有低细胞毒性，适用于生物学应用。

实施例2

本实施例提供一种具有同侧推拉电子效应的环脒基荧光分子，其结构式为：其由N-磺酰基***苯甲醛与邻甲苯胺制备而得，其制备方法与实施例1基本相同。

本实施例中所述的环脒基荧光分子的NMR谱图如图8-9所示，测试数据如下：

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ8.34(s,1H),8.02(s,1H),7.67(d,J＝8.2Hz,2H),7.63–7.48(m,3H),7.44(dd,J＝10.8,4.1Hz,1H),7.41–7.32(m,2H),7.25–7.08(m,4H),2.34(s,3H),2.02(s,3H)。

¹³C NMR(100MHz,CDCl₃):δ152.6,142.0,142.0,141.5,141.2,141.0,134.3,134.0,131.2,129.9,128.8,127.7,127.2,126.4,126.2,125.9,125.3,120.0,111.5,21.3,17.6。

所述荧光分子产物的红外(IR)谱图中，吸收峰的位置分别位于：2922,1640,1600,1468,1367,1269,1131,1081,950,763cm^-1。

所述荧光分子的高分辨率质谱HRMS(ESI)测试结果为：C₂₃H₂₀N₂O₂S+H,Calc:389.1318,Found:389.1318。

所述荧光分子的吸收和发射光谱如图10所示，由图可见，所述荧光分子具有大的斯托克斯位移。

实施例3

本实施例提供一种具有同侧推拉电子效应的环脒基荧光分子，其结构式为：其由N-磺酰基***苯甲醛与制备而得，其制备方法与实施例1基本相同。

本实施例中所述的环脒基荧光分子的NMR谱图如图11-12所示，测试数据如下：

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ8.45(s,1H),7.95(s,1H),7.74(d,J＝8.2Hz,2H),7.59(d,J＝8.6Hz,1H),7.52(d,J＝3.4Hz,2H),7.38(dt,J＝11.8,4.1Hz,6H),7.25–7.18(m,1H),7.11(ddd,J＝9.8,8.4,4.9Hz,3H),7.00(t,J＝2.2Hz,1H),6.92(dd,J＝7.8,1.2Hz,1H),4.97(s,2H),2.36–2.26(m,3H)。

¹³C NMR(100MHz,CDCl₃):δ159.3,152.4,142.6,141.8,141.5,141.1,136.3,134.1,130.2,128.9 128.7,128.2,127.9,127.6,126.2,125.8,125.3,119.9119.0,116.4,113.4,111.4,70.4,21.3。

所述荧光分子产物的红外(IR)谱图中，吸收峰的位置分别位于：2922,1640,1601,1469,1367,1131,1080,953cm^-1。

所述荧光分子的高分辨率质谱HRMS(ESI)测试结果为：C₂₉H₂₄N₂O₃S+H,Calc:481.1580,Found:481.1580。

所述荧光分子的吸收和发射光谱如图13所示，由图可见，所述荧光分子具有大的斯托克斯位移。

实施例4

本实施例提供一种具有同侧推拉电子效应的环脒基荧光分子，其结构式为：其由N-磺酰基***苯甲醛与制备而得，其制备方法与实施例1基本相同。

本实施例中所述的环脒基荧光分子的NMR谱图如图14-15所示，测试数据如下：

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ8.42(d,J＝2.2Hz,1H),8.01(d,J＝5.7Hz,1H),7.79–7.70(m,2H),7.63–7.48(m,3H),7.46–7.32(m,2H),7.25–7.13(m,4H),7.13–7.06(m,1H),2.46(s,3H),2.36(s,3H)；

¹³C NMR(100MHz,CDCl₃):δ152.5,142.2,142.2,141.9,141.4,141.1,140.8,134.2,129.6,128.9,127.7,127.3,126.2,125.9,125.4,124.0,122.9,119.9,111.6,21.4,15.5。

所述荧光分子产物的红外(IR)谱图中，吸收峰的位置分别位于：3056,1639,1600,1467,1366,1265,1130,1080,951cm^-1。

所述荧光分子的高分辨率质谱HRMS(ESI)测试结果为：C₂₃H₂₀N₂O₂S₂+H,Calc:421.1039,Found:421.1039。

所述荧光分子的吸收和发射光谱如图16所示，由图可见，所述荧光分子具有大的斯托克斯位移。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。