阅读说明：本技术 与禽法氏囊病毒vp2蛋白特异性结合的多肽序列及其应用 (Polypeptide sequence specifically combined with avian bursal disease virus VP2 protein and application thereof ) 是由 刘运超 张改平 陈玉梅 王方雨 尚延丽 魏蔷 冯华 刘东民 邢广旭 邓瑞广 于 2019-10-08 设计创作，主要内容包括：本发明涉及与禽法氏囊病毒VP2蛋白特异性结合的多肽序列及其应用,属于分子生物学领域。本发明借助于计算机辅助设计,在禽法氏囊病毒VP2蛋白晶体结构的基础上,通过分子对接虚拟筛选技术,搜寻虚拟多肽数据库中与靶标蛋白结合模式与亲和力最佳的多肽配体,其多肽序列为SERWDN,即IBDVL9-15。本发明利用表达纯化的IBDV VP2蛋白分别进行ELISA和局域表面等离子体共振试验,结果表明,IBDVL9-15多肽能够与IBDV VP2蛋白有良好的结合能力,借助本发明设计而成的多肽,可用于对IBDV VP2抗原进行快速检测和分离纯化。(The invention relates to a polypeptide sequence specifically combined with avian bursal disease virus VP2 protein and application thereof, belonging to the field of molecular biology. The invention searches a polypeptide ligand with the best binding mode and affinity with a target protein in a virtual polypeptide database by a molecular docking virtual screening technology on the basis of the crystal structure of the avian bursal disease virus VP2 protein by means of computer-aided design, wherein the polypeptide sequence is SERWDN, namely IBDVL 9-15. The invention respectively carries out ELISA and local surface plasma resonance tests by utilizing the expressed and purified IBDV VP2 protein, and the result shows that the IBDV L9-15 polypeptide can have good binding capacity with IBDV VP2 protein, and the polypeptide designed by the invention can be used for carrying out rapid detection, separation and purification on IBDV VP2 antigen.)

与禽法氏囊病毒VP2蛋白特异性结合的多肽序列及其应用

技术领域

本发明涉及与禽法氏囊病毒VP2蛋白特异性结合的多肽序列及其应用，属于分子生物学领域。

背景技术

基于蛋白的三维结构和电荷分布特性，采用分子虚拟对接技术筛选亲和肽已经成为多肽类配体和药物理性设计的重要技术手段。该方法主要是借助于计算机软件的快速运算，实现小分子多肽在靶标蛋白活性位点上的逐一对接，这些小分子多肽来自于事先准备好的虚拟肽库，然后经过连续优化靶标蛋白的空间构象、氨基酸残基侧链等方面，找到小分子多肽与靶标蛋白最优的结合构象，计算出小分子多肽与生物大分子蛋白相结合的方式与亲和力，并且对结果进行打分，根据打分结果挑选出最佳配体，然后将最佳配体进行体外实验验证和筛选。

鸡传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease,IBD)是由传染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease virus,IBDV)引起的一种严重危害雏鸡免疫器官，致使雏鸡免疫失败，造成B淋巴细胞严重受损的高发性、高接触性的病毒性传染病。该病于上世纪八十年代开始在我国广泛流行，给我国的养禽业带来巨大经济损失。其主要特征是IBDV侵袭雏鸡的中枢免疫器官法氏囊，IBDV在法氏囊B淋巴细胞中大量增殖，对法氏囊B淋巴细胞造成严重杀伤，从而导致严重的免疫抑制，鸡群机体免疫力下降，使疫苗免疫失效，给禽养殖业的疫病防控带来巨大挑战。VP2蛋白位于病毒粒子的外表面，是IBDV的主要结构蛋白，其蛋白分子量约为37～40kDa，占结构蛋白总量的51％。VP2不仅是IBDV的主要宿主免疫保护性抗原，也是IBDV基因组A节段发生抗原变异的主要区域。因此，VP2蛋白对IBDV的抗原性和毒力的变异具有重要作用，和病毒的细胞嗜性、致病性、细胞凋亡等密切相关。VP2蛋白是唯一的衣壳蛋白，含有中和性抗原表位，可刺激机体产生中和抗体。因此目前研发的亚单位疫苗主要以VP2蛋白作为主要抗原基因。

发明内容

本发明借助于计算机辅助设计，在禽法氏囊病毒VP2蛋白晶体结构的基础上，通过分子对接虚拟筛选技术，搜寻虚拟多肽数据库中与靶标蛋白结合模式与亲和力最佳的多肽配体，其多肽序列为SEQ ID NO.1：SERWDN，即IBDVL9-15。固相合成法合成多肽IBDVL9-15，利用表达纯化的IBDV VP2蛋白分别进行ELISA和局域表面等离子体共振(LSPR)试验，结果表明，IBDVL9-15多肽能够与IBDV VP2蛋白有良好的结合能力，由此证明，借助本发明设计而成的多肽，可用于对IBDV VP2抗原进行快速检测和分离纯化。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种与禽法氏囊病毒VP2蛋白特异性结合的多肽序列，所述的多肽序列为SERWDN。

所述的的多肽序列，包括以所述的多肽序列为核心，任何对该多肽序列所进行的相应调整或修饰；修饰材料包括但不限制在纳米材料、荧光材料、酶类、生物素及特定的蛋白质上。

所述的多肽序列在禽法氏囊病毒VP2蛋白的快速检测、纯化和疫苗中的应用。

将所述的多肽序列用于禽法氏囊病毒VP2蛋白的鉴定，其中包括但不局限于酶联免疫吸附试验(ELISA)检测。

所述的多肽序列在对禽法氏囊病毒VP2蛋白抗原进行定量和定性检测中的应用。

本发明的有益效果：

1、本发明基于禽法氏囊病毒VP2蛋白的晶体结构(PDB ID:2DF7)，通过分子对接虚拟筛选技术，获得一条与禽法氏囊病毒VP2蛋白特异性结合的多肽序列，其多肽序列为SERWDN，即IBDVL9-15。固相合成法合成多肽IBDVL9-15，并与禽法氏囊病毒VP2蛋白进行亲和力鉴定，IBDVL9-15序列与人工表达的IBDV VP2蛋白之间相互作用的平衡解离常数K_D为4.37×10^-6M，即4.37uM，说明亲和力较好。

2、由于IBDV VP2蛋白纯化技术的局限性，很难获得针对IBDV VP2蛋白的抗体，本发明设计得到的IBDVL9-15序列很好地解决了这一难题，实现快速人工合成与低成本检测。

3、本发明设计而成的IBDVL9-15序列与人工表达IBDV VP2蛋白、天然IBDV均可以结合，与其它病毒蛋白均不发生交叉性反应，特异性较好。

4、与传统的噬菌体筛选多肽库相比，本发明具有简单，快速及成本低的特点；通过分子对接虚拟筛选技术，可为实现IBDV VP2蛋白结构功能解析提供较好的理论指导。

5、本发明与人工表达纯化的蛋白进行免疫来获得针对蛋白抗体的过程相比，具有操作简单，省时省力，费用低等优点；通过对筛选IBDVL9-15序列进行标记，可实现对IBDVVP2蛋白进行定性和定量的快速检测。

附图说明

图1为IBDVL9-15序列与Cap蛋白的对接结果展示。

图2为IBDVL9-15序列与人工表达IBDV VP2蛋白的LSPR亲和力鉴定结果。

其中，纵坐标代表传感器所检测到的信号值；横坐标代表样品在传感器中相互作用的时间。

图3为IBDVL9-15序列与人工表达IBDV VP2蛋白的ELISA鉴定结果。

图4为IBDVL9-15序列与人工接种IBDV的ELISA鉴定结果。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

实施例1分子对接及虚拟肽库的筛选

1、VP2蛋白晶体结构的准备

借助计算机辅助设计软件对IBDV VP2蛋白的氨基酸序列和晶体结构进行分析，选定其第8～438氨基酸残基作为设定的对接区域，进行分子对接。

2、虚拟多肽库的设计

本发明采用逐个氨基酸残基延长的方式，首先将评分最高的几种氨基酸库逐个与靶标蛋白的结构实施对接，依据对接情况选择最佳的氨基酸残基为核心，再依次增加相应的氨基酸数量直至达到最佳的对接结果为止。虚拟多肽库生成的肽序列以2～9位氨基酸残基为宜。

3、对接结果的评断

使用分子对接软件，综合评估多肽与蛋白结合的自由能、氢链、范得华力等力学参数，并结合禽法氏囊病毒VP2蛋白的晶体结构(PDB ID:2DF7)综合考虑多肽分子对VP2蛋白稳定性、功能的影响，以此为依据，筛选具有最好的亲和力、最高稳定性的多肽序列，得到多肽分子IBDVL9-15，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1：SERWDN，其与IBDV VP2对接的相互作用位置结果见图1。

实施例2IBDVL9-15序列与人工表达VP2蛋白的亲和力鉴定

1、首先是VP2蛋白芯片的制备，采用EDC/NHS法将IBDV VP2蛋白(5μg/mL)，共价耦合到LSPR的羧基芯片上。当LSPR的Single≥500pm时，表明VP2蛋白偶联成功。该传感器就可以用于测量IBDV VP2蛋白与IBDVL9-15序列之间的相互作用。

2、其次是运行传感器以获得稳定的信号基线，开始以150μL/min的最高流速运行PBS缓冲液(pH 7.4)直至该传感器的信号基线达到平稳，然后，将流速降至20μL/min，准备上样。

3、使用PBS缓冲液将固相合成，并在氨基端生物素化修饰的IBDVL9-15干粉预先配制成设定好的浓度，然后从低浓度开始依次向传感器中注入300μL的IBDVL9-15溶液，每次注入样品均采用20μL/min的流速与传感器相互作用5min，最后用PBS缓冲液在20μL/min的流速下冲洗5min。以得到的不同浓度IBDVL9-15溶液与IBDV VP2蛋白相互作用的结合与解离曲线为依据，进行IBDVL9-15序列与IBDV VP2蛋白相结合的亲和力分析(见图2)。图中曲线从上到下对应的IBDVL9-15溶液的浓度依次为：107.5uM、53.75uM、13.44uM、6.72uM、3.36uM、0.84uM。

结果表明，IBDVL9-15序列与人工表达的IBDV VP2蛋白具有较好的亲和性结合，两者之间相互作用的平衡解离常数K_D为4.37×10^-6M，即4.37uM。

实施例3IBDVL9-15多肽与人工表达IBDV VP2蛋白的ELISA鉴定

1、将纯化的IBDV VP2蛋白用CBS溶液(pH9.6)稀释成10μg/mL，以50μL/孔的体积加入到ELISA 96孔板中；以同样方式将不同病毒表达纯化的蛋白，即猪瘟病毒E2蛋白(CSFV-E2)、猪圆环病毒2型cap蛋白(PCV2-cap)和1％牛血清白蛋白(BSA)、PBS缓冲液进行ELISA96孔板包被，作为对照，4℃过夜包被。

2、在用1％的BSA液封闭之前，ELISA板用PBST缓冲液洗涤5次。每次洗涤项ELISA板的反应孔中加满PBST，静置1min，随后弃去孔内PBST，重复5次。随后，向ELSIA板反应孔中加入1％的BSA，置于37℃温箱，静置1h。

3、使用PBS缓冲液将固相合成的IBDVL9-15多肽稀释成1μg/mL的工作浓度，以50μL/孔的体积加入到上述ELISA板中混匀，置于37℃温箱，静置30min，用PBST缓冲液洗涤ELISA板5次。

4、使用PBS缓冲液将辣根过氧化物酶标记的亲和素(SA-HRP)稀释1000倍，以50μL/孔的体积加入到ELISA板中混匀，置于37℃温箱，静置30min。同样，用PBST缓冲液洗涤ELISA板5次。

5、取100μL/孔的TMB显色液加入到ELISA板中，充分混匀后，室温条件下，显色10min。

6、取50μL/孔的2M的硫酸液加入到上述酶标板中终止显色反应，并在450nm波长下测量各孔的ELISA信号值，分析其结果。

结果表明，IBDVL9-15序列与人工表达IBDV VP2蛋白具有较好的亲和性与特异性结合，并且与其它病毒蛋白不发生反应(见图3)。

实施例4IBDVL9-15序列与人工接种IBDV的ELISA鉴定

(1)将感染IBDV的DT40细胞培养液进行超声破碎，然后进行ELISA板包被；以同样方式将不同病毒培养液，即猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和未感染的DT40细胞培养液进行酶标板包被，作为对照。其中，包被抗原均采用CBS缓冲液进行稀释，以50μL/孔的体积加入ELISA板中，4℃过夜包被。

(2)1％的BSA液封闭之前，ELISA板用PBST缓冲液洗涤5次，置于37℃温箱，静置1h。

(3)使用PBS缓冲液将固相合成的IBDVL9-15干粉稀释成1μg/mL的工作浓度，以50μL/孔的体积加入到上述ELISA板中混匀，置于37℃温箱，静置30min。PBST缓冲液洗涤ELISA板5次。

(4)使用PBS缓冲液将辣根过氧化物酶标记的亲和素(SA-HRP)稀释1000倍，以50μL/孔的体积加入到ELISA板中混匀，置于37℃温箱，静置30min。同样，用PBST缓冲液洗涤ELISA板5次。

(5)取100μL/孔的TMB显色液加入到ELISA板中，充分混匀后，室温条件下，显色10min。

(6)取50μL/孔的2M的硫酸液加入到上述酶标板中终止显色反应，并在450nm波长下测量各孔的ELISA信号值，分析其结果。

比较分析禽法氏囊病毒VP2蛋白(IBDV-VP2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和未感染的DT40细胞培养液与合成多肽IBDVL9-15的ELISA反应OD值。结果表明，IBDVL9-15序列与DT40细胞培养IBDV病毒液具有较好的亲和性与特异性结合，并且与其它病毒培养液不发生反应(见图4)。

序列表

<110> 河南省农业科学院 河南中泽生物工程有限公司

<120> 与禽法氏囊病毒VP2蛋白特异性结合的多肽序列及其应用

<130> 分子对接虚拟筛选技术

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 1

Ser Glu Arg Trp Asp Asn

1 5