阅读说明：本技术 流感病毒基质蛋白m1的单克隆抗体及其应用 (Monoclonal antibody of influenza virus matrix protein M1 and application thereof ) 是由 蒲娟 佟琪 宗亚楠 王明暘 曲润康 刘金华 于 2019-09-25 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物技术领域,具体涉及流感病毒基质蛋白M1的单克隆抗体及其应用。本发明提供流感病毒基质蛋白M1的单克隆抗体,所述单克隆抗体包含重链可变区和轻链可变区,所述重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1-3所示；所述轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4-6所示。该单克隆抗体能够特异识别并结合多种亚型的流感病毒基质蛋白M1、在流感病毒亚型间具有广谱适用性,同时具有较高的特异性和敏感性,可以很好地应用于免疫印迹实验、间接免疫荧光实验以及免疫沉淀等技术,具有较高的应用价值。(The invention relates to the technical field of biology, in particular to a monoclonal antibody of influenza virus matrix protein M1 and application thereof. The invention provides a monoclonal antibody of influenza virus matrix protein M1, which comprises a heavy chain variable region and a light chain variable region, wherein the amino acid sequences of CDR1, CDR2 and CDR3 of the heavy chain variable region are respectively shown in SEQ ID NO. 1-3; the amino acid sequences of CDR1, CDR2 and CDR3 of the light chain variable region are respectively shown in SEQ ID NO. 4-6. The monoclonal antibody can specifically recognize and combine influenza virus matrix protein M1 of various subtypes, has broad-spectrum applicability among influenza virus subtypes, has high specificity and sensitivity, can be well applied to technologies such as immunoblotting experiments, indirect immunofluorescence experiments, immunoprecipitation and the like, and has high application value.)

流感病毒基质蛋白M1的单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及流感病毒基质蛋白M1的单克隆抗体、分泌产生流感病毒基质蛋白M1的单克隆抗体的杂交瘤细胞及其应用。

背景技术

抗体技术主要分为单克隆抗体技术和多克隆抗体技术。抗原由多个抗原决定簇决定，由一种抗原决定簇刺激机体，一个B淋巴细胞接受该抗原产生的抗体称之为单克隆抗体。由多种抗原决定簇刺激机体，相应地就产生多种多样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体。相比较于单克隆抗体，多克隆抗体可能存在多种亚型，导致特异性较差。在使用多克隆抗体进行免疫实验时，会产生背景值，对实验结果造成不同程度的影响。单克隆抗体所具备的特异性和敏感性高的特点使其广泛应用于分子实验以及临床诊断中。

流感病毒的M1蛋白是其病毒粒子中含量最为丰富的蛋白，M1蛋白能够维持流感病毒粒子形态结构的完整，在病毒基因组的复制转录、病毒的组装出芽中发挥着重要的作用。此外，M1蛋白在流感病毒各亚型之间高度保守。因此，开发能够特异性识别多种亚型流感病毒M1蛋白的广谱性单克隆抗体，将有利于流感的诊断以及分子机制的深入探究，具有重要意义。

发明内容

为解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的是提供一种具有较高的敏感性和特异性的、能够特异性结合多种亚型流感病毒基质蛋白M1的广谱型单克隆抗体以及产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供流感病毒基质蛋白M1的单克隆抗体，所述单克隆抗体包含重链可变区和轻链可变区，能够特异性结合流感病毒基质蛋白M1，所述重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1-3所示；所述轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4-6所示。

优选地，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列为如下任一种：

(1)如SEQ ID NO.7所示；

(2)如SEQ ID NO.7所示的序列经一个或多个氨基酸的缺失、替换或***得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列；

(3)与如SEQ ID NO.7所示的序列具有至少70％同源性且具有相同功能蛋白的氨基酸序列；所述同源性优选为至少85％；更优选为至少95％。

所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列为如下任一种：

(1)如SEQ ID NO.8所示；

(2)如SEQ ID NO.8所示的序列经一个或多个氨基酸的缺失、替换或***得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列；

(3)与如SEQ ID NO.8所示的序列具有至少70％同源性且具有相同功能蛋白的氨基酸序列。所述同源性优选为至少85％；更优选为至少95％。

本发明所述的单克隆抗体能够特异性结合多种亚型流感病毒基质蛋白M1，其抗原识别区位于M1蛋白的169-252位氨基酸区域内。

更优选地，所述单克隆抗体的亚型为轻链为κ链的IgG1。

具体地，所述单克隆抗体的重链的氨基酸序列为如下任一种：

(1)如SEQ ID NO.9所示；

(2)如SEQ ID NO.9所示的序列经一个或多个氨基酸的缺失、替换或***得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列；

(3)与如SEQ ID NO.9所示的序列具有至少70％同源性且具有相同功能蛋白的氨基酸序列。所述同源性优选为至少85％；更优选为至少95％。

所述单克隆抗体的轻链的氨基酸序列为如下任一种：

(1)如SEQ ID NO.10所示；

(2)如SEQ ID NO.10所示的序列经一个或多个氨基酸的缺失、替换或***得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列；

(3)与如SEQ ID NO.10所示的序列具有至少70％同源性且具有相同功能蛋白的氨基酸序列。所述同源性优选为至少85％；更优选为至少95％。

第二方面，本发明提供产生所述流感病毒基质蛋白M1的单克隆抗体的杂交瘤细胞。

第三方面，本发明提供编码所述流感病毒基质蛋白M1的单克隆抗体的核酸。

优选地，编码所述单克隆抗体的重链的核酸序列如SEQ ID NO.11所示或为其互补序列；编码所述单克隆抗体的轻链的核酸序列如SEQ ID NO.12所示或为其互补序列。

第四方面，本发明提供一种标记复合物，其为由所述流感病毒基质蛋白M1的单克隆抗体经生物化学标记得到。

优选地，所述生物化学标记为选自酶标记、生物素标记、荧光染料标记、化学发光染料标记、放射性标记中的一种或多种。

第五方面，本发明提供所述流感病毒基质蛋白M1的单克隆抗体或所述杂交瘤细胞或所述流感病毒基质蛋白M1的单克隆抗体的标记复合物在制备检测流感病毒或流感病毒基质蛋白M1的试剂盒中的应用。

第六方面，本发明提供本发明提供所述流感病毒基质蛋白M1的单克隆抗体或所述杂交瘤细胞或所述流感病毒基质蛋白M1的单克隆抗体的标记复合物在制备检测流感病毒抗体的试剂盒中的应用。

第七方方面，本发明提供所述流感病毒基质蛋白M1的单克隆抗体或所述杂交瘤细胞或所述流感病毒基质蛋白M1的单克隆抗体的标记复合物在制备用于预防或治疗流感病毒的药物中的应用。

第八方面，本发明提供所述流感病毒基质蛋白M1的单克隆抗体或所述杂交瘤细胞或所述流感病毒基质蛋白M1的单克隆抗体的标记复合物在流感病毒疫苗质量控制中的应用。

第九方面，本发明提供包含所述流感病毒基质蛋白M1的单克隆抗体的药物。

上述药物除包含所述流感病毒基质蛋白M1的单克隆抗体外，还可包含其它活性成分或药学领域允许的辅料。

第十方面，本发明提供流感病毒的检测试剂盒，其包含所述流感病毒基质蛋白M1的单克隆抗体或所述流感病毒基质蛋白M1的单克隆抗体的标记复合物。

上述流感病毒的检测试剂盒除包含所述流感病毒基质蛋白M1的单克隆抗体或所述流感病毒基质蛋白M1的单克隆抗体的标记复合物外，还可包含检测所需的其它试剂或材料，包括但不限于缓冲液、二抗等。

本发明的有益效果在于：本发明提供的流感病毒基质蛋白M1的单克隆抗体能够特异识别并结合多种亚型的流感病毒M1蛋白、在流感病毒亚型间具有广谱性，在流感病毒与其它病毒间具有高度特异性，同时具有较高的敏感性，因此，可以很好地应用于免疫印迹实验(Western Blot，最大稀释倍数可达到8×10⁴倍)、间接免疫荧光实验(IFA，最大稀释倍数可达5×10⁵倍)以及免疫沉淀(IP，最小使用量仅为1μg)技术等，具有较高的应用价值；同时也为流感病毒致病机制的深入研究奠定了技术基础。

附图说明

图1为本发明实施例2中单克隆抗体2C5用于Western blot检测的特异性分析结果，其中，泳道1：未感染病毒的细胞裂解物样品；泳道2-5：依次为感染了H9N2、H7N9、H5N1、H1N1亚型流感病毒的细胞裂解物样品。

图2为本发明实施例2中单克隆抗体2C5用于Western blot检测的敏感性的分析结果，其中，泳道1为感染病毒细胞的裂解物，泳道2为未感染病毒的细胞裂解液。

图3为本发明实施例3中单克隆抗体2C5用于IFA检测的特异性的分析结果，其中，A、B、C、D分别为用H9N2、H7N9、H5N1、H1N1亚型的流感病毒进行感染，以单克隆抗体2C5作为一抗的检测结果，E为未感染病毒的阴性对照孔。

图4为本发明实施例3中单克隆抗体2C5用于IFA检测的敏感性的分析结果，其中，A、B、C、D、E、F分别为单克隆抗体2C5的稀释度依次为1:1×10³、1:5×10³、1:1×10⁴、1:5×10⁴、1:1×10⁵、1:5×10⁵的检测结果。

图5为本发明实施例4中单克隆抗体2C5用于IP实验检测的特异性的分析结果；其中，H1、H5、H7和H9分别代表单抗2C5从感染了不同病毒样品中所富集出来的M1蛋白，Input为感染病毒的细胞裂解样品，M1为流感病毒M1蛋白，Actin为内参蛋白Actin。

图6为本发明实施例4中单克隆抗体2C5用于IP实验检测的敏感性的分析结果；其中，IP为单抗2C5从感染了不同病毒样品中所富集出来的M1蛋白，Input为感染病毒的细胞裂解样品，M1为流感病毒M1蛋白，Actin为内参蛋白Actin。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1杂交瘤细胞系2C5及其产生的流感病毒M1蛋白单克隆抗体的获得

1、免疫原的制备

用于免疫小鼠的免疫原为采用原核表达系统表达的携带GST标签的重组流感病毒M1蛋白，具体制备方法如下：

(1)M1蛋白原核表达载体的构建

以一株H9亚型的流感病毒的M1基因的序列为模板，采用如下引物PCR扩增M1蛋白编码基因，连接至pGEX-1ZT载体。

上游引物：5’-CTGGTTCCGCGTGGATCCGGATCCATGAGTCTTCTAACCGAGGT-3’(含有BamHⅠ酶切位点)

下游引物：5’-GGCCGCGATATCAAGCTTAAGCTTTCACTTGAACCGCTGCAGTT-3’(含有HindIII酶切位点)

(2)M1蛋白的原核表达

将上述构建的M1蛋白的原核表达载体转化至Trans T1感受态细胞，经筛选获得阳性菌株，并进行测序，测序正确后，进行质粒的提取。

(3)M1蛋白免疫原的制备

将上述构建成功的阳性质粒转入大肠杆菌BL21的感受态细胞中后诱导其表达蛋白，将表达在上清中的可溶性蛋白进行纯化后免疫小鼠。

2、动物免疫

取上述制备的免疫原免疫6周龄的BALB/c小鼠，具体免疫方法如下：首次免疫，抗原与水溶佐剂按照体积比9:1进行混合，混合均匀后，于小鼠颈背部皮下多点注射，100μg/只；首次免疫后三周，对小鼠进行二免，方法与首次免疫相同；二免后两周，对小鼠进行三免，方法同首次免疫；三免后一周，对小鼠进行眼静脉采血，分离血清，以HIS标签M1蛋白包被酶标板以间接ELISA方法对小鼠的血清效价进行检测。效价达到融合要求后，在融合前三天对小鼠进行加强免疫(直接使用上述制备的M1蛋白免疫原对小鼠进行腹腔注射，50μg/只)。经过三次免疫后，选择血清抗体效价达到标准的小鼠进行加强免疫。

3、杂交瘤细胞的获得

取上述加强免疫后的小鼠脾细胞与sp2/0细胞进行融合。使用原核系统表达的携带HIS标签的重组M1蛋白作为抗原建立用于筛选杂交瘤细胞的间接ELISA方法，在细胞融合后10-14天进行筛选。经过3次对阳性杂交瘤细胞的筛选以及亚克隆后，获得一株可以稳定分泌M1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，将其命名为2C5。

4、杂交瘤细胞2C5分泌单克隆抗体的效价检测

为了测定杂交瘤细胞2C5分泌单克隆抗体的效价，使用上述步骤3中建立的间接ELISA方法进行抗体效价的检测；同时制备免疫小鼠的腹水作为对照。将腹水从1:400按照4倍倍比稀释到1:3.277×10⁷倍，将杂交瘤细胞上清从1:100按照两倍倍比到1:5.12×10⁴倍，以杂交瘤细胞2C5分泌的单克隆抗体作为一抗进行间接ELISA实验以测定其抗体效价。结果表明，杂交瘤细胞上清的抗体效价可达到1:5.12×10⁴；小鼠腹水的抗体效价可达到1:3.277×10⁷。

5、杂交瘤细胞2C5分泌单克隆抗体的特异性检测

为了验证上述步骤4制备的杂交瘤细胞2C5分泌单克隆抗体以及小鼠腹水单克隆抗体是否为针对流感病毒M1蛋白的特异性抗体，将H9N2、H7N9、H5N1、H1N1亚型流感病病毒，新城疫病毒(LaSota)、腺病毒和正常鸡胚尿囊液加入上样缓冲液煮样品后，将M1蛋白单克隆抗体2C5使用一抗稀释液稀释2000倍后作为一抗孵育，使用Western blot方法检测流感病毒M1蛋白的单克隆抗体的特异性。结果表明，单克隆抗体2C5能够特异性地识别H9N2、H7N9、H5N1、H1N1四种亚型的流感病毒，特异性较好。

6、单克隆抗体2C5的抗原识别区域鉴定

为了鉴定杂交瘤细胞2C5分泌的单克隆抗体以及小鼠腹水单克隆抗体的抗原识别区域是否在同一位置，以基质蛋白M1的第85位以及168位氨基酸为截点，将M1基因分成两段，分别构建截短表达载体pGEX-1ZT-M1-*1(1-168aa)、pGEX-1ZT-M1-*2(85-252aa)，并诱导两个截短表达载体表达截短的M1蛋白，并将其作为抗原，分别以鼠源针对GST标签的单克隆抗体(商品化)以及单克隆抗体2C5作为一抗，进行Western blot检测。结果表明，鼠源GST单克隆抗体以及2C5单克隆抗体的抗原识别区位于同一区域，均位于M1蛋白的169-252位氨基酸区域。

7、2C5单克隆抗体的亚型鉴定

使用SBA Clonotyping System-HRP试剂盒对该抗体的原亚型进行鉴定，结果显示，2C5单克隆抗体的亚型为轻链为κ链的IgG1。

实施例2单克隆抗体2C5在免疫印迹(Western blot)中的应用

1、单克隆抗体2C5用于Western blot检测的特异性鉴定

(1)A549细胞铺细胞板：在进行Western blot实验前24h左右将A549细胞从大细胞瓶中传至12孔板，计算好实验所需的细胞孔数，同时多铺一孔细胞用于计数，注意观察。待细胞长至细胞孔80％-90％时，将细胞孔中的培养液轻轻移除，使用PBS轻轻洗涤细胞一次，弃去洗液；

(2)病毒的稀释：将H9N2、H7N9、H5N1、H1N1亚型病毒的尿囊液从-80℃冰箱中取出置于4℃化开，使用细胞计数仪按照常规细胞计数的方式进行细胞计数，按照MOI＝0.2对所需病毒的感染量进行计算，按照计算结果对病毒进行稀释；

(3)感染病毒：将稀释完成的病毒液加入到洗涤好的12孔细胞板中，放置于37℃、5％CO₂培养箱中进行培养，待病毒吸附1h后，将细胞孔中的液体换成含有0.2μg/mL TPCK胰酶及1％双抗无血清DMEM培养基；

(4)收样：使用Sample Buffer裂解上述细胞样品，瞬时离心后使用细胞超声仪将细胞样品进行超声，离心收集上清，同时用PBS重悬沉淀；

(5)Western blot鉴定：

配胶：提前洗干净玻璃板、梳子、胶条的等。按照配方先配制10％分离胶，用水封住胶面，待分离胶凝固后，倒掉水加入5％浓缩胶，插上合适的梳子，待胶凝固后，将其置于电泳槽中组装好电泳槽中，向内层电泳槽中加满新配置的电泳液，拨出梳子后，外层电泳槽补满电泳液；

煮样：分别取上述20μL步骤(4)中制备的超声裂解后上清以及PBS沉淀重悬液，加入4μL 6×蛋白上样缓冲液，100℃金属浴煮样10min；

上样：加入10μL蛋白样品至上样孔中，另外在样品孔的两侧各加入10μL蛋白Marker；

(4)电泳：将电泳仪的程序设置为恒压65V电泳30min，恒压120V电泳1h，恒压55V；注意观察电泳至溴酚蓝跑出胶底部后，完成电泳，轻轻取出蛋白胶，同时使用蒸馏水冲洗蛋白胶以去除残留的电泳液；

(5)转印：提前将滤纸、海绵浸泡于预冷过的转印液中，待电泳结束后，小心卸下胶块，参考蛋白胶上的Marker，根据目的蛋白的大小进行切胶，同时测量出蛋白胶的长宽以裁剪合适大小的PVDF膜，将PVDF膜浸于无水甲醇中进行活化；在转印夹中按照海绵、4层滤纸、蛋白胶、PVDF膜、4层滤纸、海绵的顺序依次铺放好，注意每一层均需要用玻璃棒赶尽气泡，最后将转印夹夹好放于转印槽中，倒入足量转印液，250mA恒流转印1h；

(6)封闭：待转印完成后，取出PVDF膜，观察PVDF膜上是否有清晰的Marker条带来判断转膜是否成功。将膜放置于5％脱脂乳中，水平摇床上室温封闭1h或4℃过夜；

(7)一抗的孵育：封闭完成后，将PVDF膜用PBST迅速涮洗干净，将干净的膜放置于用一抗稀释液稀释过的鼠源GST单抗以及实施例1制备的单克隆抗体2C5中，于4℃水平摇床上孵育过夜；

(8)二抗的孵育：一抗孵育完成后回收一抗，使用PBST洗膜三次，每次5min，然后加入5％脱脂乳10000倍稀释HRP标记的山羊抗小鼠IgG，水平摇床室温孵育1h；

(9)显色：孵育完二抗后，使用PBST洗膜三次，每次10min，提前开启Tanon 5200全自动化学发光图像曝光仪。洗膜完成后，在PVDF膜上加上适量显色液直至完全覆盖膜表面，避光显色2min；

(10)曝光：用镊子将PVDF膜从发光液中取出，将膜放置于曝光仪中曝光，曝光时间按照蛋白表达量的多少而定，保存曝光图片并分析结果。

2、单克隆抗体2C5用于Western blot检测的敏感性测定

按照上述1中的方法进行感染病毒并进行Western blot鉴定，将单克隆抗体2C5分别按照1:1×10³、1:2×10³、1:4×10³、1:8×10³、1:1×10⁴、1:4×10⁴、1:8×10⁴、1:1×10⁵稀释后，作为一抗进行孵育，对单克隆抗体2C5的敏感性进行检测。

3、实验结果

上述Western blot特异性检测结果显示，单克隆抗体2C5可以与H9N2、H7N9、H5N1、H1N1四种亚型流感病毒的M1蛋白发生特异性结合(图1)，且不与其他细胞成分反应，表明单克隆抗体2C5在Western blot检测中可以广谱地识别多种亚型的流感病毒M1蛋白，特异性良好。

上述Western blot敏感性检测结果表明，当单克隆抗体2C5稀释到1×10⁵倍时不能结合M1蛋白，表明单克隆抗体2C5应用于Western blot检测的最大稀释度为1:8×10⁴(图2)。

实施例3单克隆抗体2C5在间接免疫荧光(IFA)中的应用

1、单克隆抗体2C5用于IFA检测的特异性鉴定

(1)按照实施例2中的感染病毒的方法将H9N2、H7N9、H5N1、H1N1四种亚型的流感病毒感染MDCK细胞；

(2)洗涤：轻轻甩去孔中的培养液，使用PBS清洗一遍，动作轻柔避免细胞脱落，弃去孔中的PBS；

(3)固定：每孔中加入适量的按照无水乙醇：丙酮＝3：2比例配成的固定液，室温固定20min；

(4)洗涤：将孔中的固定液甩干，使用PBS洗涤3遍，每洗一遍就将其放在摇床上震荡洗涤3-5min；

(5)封闭：每孔加入适量5％脱脂乳制成的封闭液，放置于37℃恒温培养箱中封闭1h，使用PBS洗涤3遍，每洗一遍就将其放在摇床上震荡洗涤3-5min；

(6)一抗孵育：只用PBS将单克隆抗体2C5稀释1000倍，每孔加入适量稀释好的一抗，4℃过夜；

(7)洗涤：同步骤(4)；

(8)二抗孵育：将FITC标记的羊抗小鼠IgG用PBS稀释400倍，每孔加入适量稀释好的二抗，使用锡箔纸避光，37℃温箱孵育1h；

(9)洗涤：弃去孔内液体，使用PBST洗涤3遍，每洗一遍就将其放在摇床上震荡洗涤3-5min；

(10)观察结果：在荧光显微镜下观察细胞的情况，与阳性对照对比，有较为明亮的绿色荧光则将其判定为阳性。

2、单克隆抗体2C5的IFA敏感性的测定

按照上述1中的方法进行间接免疫荧光鉴定，将单克隆抗体2C5分别按照1:1×10³、1:5×10³、1:1×10⁴、1:5×10⁴、1:1×10⁵、1:5×10⁵稀释后，作为一抗进行孵育，对M1单抗的敏感性进行检测。

3、实验结果

上述IFA特异性检测结果显示，感染病毒的细胞孔中由于病毒M1蛋白与单克隆抗体2C5发生特异性结合而能够产生较为清晰的荧光，未感染病毒的细胞则由于单克隆抗体2C5不与其他的细胞成分反应而未出现明显荧光(图3)，表明单克隆抗体2C5可以应用于间接免疫荧光实验，具有较高的特异性。

上述IFA敏感性检测结果显示，随着一抗的稀释度不断增加，细胞孔中产生的荧光数量逐渐较少，亮度逐渐降低，当单克隆抗体2C5稀释至1:5×10⁵时，细胞孔中仅能产生微弱的少许荧光，表明单克隆抗体2C5应用于间接免疫荧光的最大稀释度为1:5×10⁵(图4)。

实施例4单克隆抗体2C5在免疫沉淀(IP)中的应用

1、单克隆抗体2C5用于IP检测的特异性鉴定

(1)细胞裂解液的准备：提前打开4℃离心机预冷，将DTT、蛋白酶抑制剂(PIC)、PMSF从-20℃拿出来化开。将每1mL Lysis Buffer中加入10μL DTT、10μL PIC、10μL PMSF，获得细胞裂解液。

(2)制备细胞裂解物：按照实施例2中感染病毒的方法进行H9N2、H7N9、H5N1、H1N1亚型病毒的感染；感染24h后，进行细胞裂解物的制备。弃去细胞板中的DMEM培养基，使用PBS清洗一遍后，弃去PBS洗液，在细胞孔中加入适量的1×细胞裂解液，细胞板放在冰上孵育5分钟。从细胞孔中刮下细胞，把提取物用移液枪转移到1.5mL的无菌离心管中，在冰上对细胞裂解物进行超声裂解，超声完成后，4℃14,000×g离心10分钟，将离心后的上清转移到新的EP管中。该上清液即为细胞裂解样品，若当天不进行实验，可以将样品暂时保存于-80℃。

(4)孵育Beads：取出20μL步骤(3)制备的细胞裂解样品作为input，将其煮样后保存于-80℃。在体系中补齐500μL左右的Lysis Buffer，每管加入10μL Beads以及单克隆抗体2C5(对照中加入鼠源IgG)，在4℃孵育3-4h。

(5)洗Beads：提前打开4℃离心机；将样品从在冰上静置3min，使用4℃离心机3000rpm离心3min。使用1mL枪吸取上清注意不要吸到Beads。使用提前配置好的洗液(1mLLysis Buffer中加入5μL DTT)加到样品中，上下颠倒3min，按照洗涤、静置、离心的顺序，重复3次。

(6)在冰上放置3min后，4℃，3000rpm离心3min，小心使用枪吸出上清，在样品中加入终浓度为1×上样缓冲液，金属浴煮样品10min使其变性，瞬离后将通过单抗2C5富集出的蛋白样品及input取出进行Western Blot鉴定。

(7)Western Blot鉴定：使用实施例2中的方法进行Western Blot。

2、单克隆抗体2C5用于IP检测的敏感性测定

按照上述1中的方法进行免疫沉淀实验，在H9N2、H7N9、H5N1、H1N1四组细胞样品中分别加入10μg、5μg、1μg、0.5μg的单克隆抗体2C5进行孵育，以检测单克隆抗体2C5应用于IP实验的最小剂量。

3、实验结果

(1)特异性：单克隆抗体2C5可以与细胞样品中的M1蛋白结合，并使用免疫印迹的方式将M1蛋白检测出来，说明实施例1所制备的单克隆抗体2C5可以应用于IP实验检测流感病毒M1蛋白(图5)。

(2)敏感性：当加入单克隆抗体2C5的剂量为0.5μg时无法检测到富集的M1蛋白条带，说明单克隆抗体2C5应用于IP实验的最小剂量为1μg(图6)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 流感病毒基质蛋白M1的单克隆抗体及其应用

<130> KHP191113227.7

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr Gly

1 5

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ile Trp Gly Asp Gly Ile Thr

1 5

<210> 3

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ala Arg Glu Tyr Asp Gly Asp Ser Ala Trp Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr

1 5 10

<210> 5

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Leu Ala Ser

1

<210> 6

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Gln His Ser Arg Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys

1 5 10 15

<210> 7

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Ile Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr

20 25 30

Gly Val Asn Trp Leu Arg Gln Pro Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Met Ile Trp Gly Asp Gly Ile Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Gly Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Glu Tyr Asp Gly Asp Ser Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 8

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg

85 90 95

Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Asp Leu Lys

100 105 110

<210> 9

<211> 462

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Met Ala Val Leu Gly Leu Leu Phe Cys Leu Gly Thr Phe Pro Ser Cys

1 5 10 15

Ile Leu Ser Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala

20 25 30

Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Ile Val Ser Gly Phe Ser Leu

35 40 45

Thr Gly Tyr Gly Val Asn Trp Leu Arg Gln Pro Pro Glu Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Leu Gly Met Ile Trp Gly Asp Gly Ile Thr Asp Tyr Asn Ser

65 70 75 80

Ala Leu Lys Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln

85 90 95

Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Gly Asp Thr Ala Arg Tyr

100 105 110

Tyr Cys Ala Arg Glu Tyr Asp Gly Asp Ser Ala Trp Phe Ala Tyr Trp

115 120 125

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro

130 135 140

Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met

145 150 155 160

Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

165 170 175

Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro

180 185 190

Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val

195 200 205

Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His

210 215 220

Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys

225 230 235 240

Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe

245 250 255

Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro

260 265 270

Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val

275 280 285

Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr

290 295 300

Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu

305 310 315 320

Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys

325 330 335

Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

340 345 350

Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro

355 360 365

Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile

370 375 380

Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly

385 390 395 400

Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp

405 410 415

Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp

420 425 430

Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His

435 440 445

Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

450 455 460

<210> 10

<211> 233

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Met Val Leu Met Leu Leu Leu Leu Trp Val Pro Gly Ser Thr Gly Asp

1 5 10 15

Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln

20 25 30

Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly

35 40 45

Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys

50 55 60

Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg

65 70 75 80

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro

85 90 95

Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg Glu

100 105 110

Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Asp Leu Lys Arg Ala

115 120 125

Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu

130 135 140

Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro

145 150 155 160

Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn

165 170 175

Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr

180 185 190

Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His

195 200 205

Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile

210 215 220

Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

225 230

<210> 11

<211> 1389

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atggctgtct tggggctgct cttctgcctg ggaacattcc caagctgtat cctttcccag 60

gtgcagctga aggagtcagg tcctggcctg gtggcgccct cacagagcct gtccatcaca 120

tgcatcgtgt caggattctc attaaccggc tatggtgtaa actggcttcg ccagcctcca 180

gaaaagggtc tggagtggct gggaatgata tggggtgatg gaatcacaga ctataattca 240

gctctcaaat ccagactgag catcagcaag gacaactcca agagccaagt tttcttaaaa 300

atgaacagtc tgcaaactgg tgacacagcc aggtactact gtgccagaga gtatgatggt 360

gactccgcct ggtttgctta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc tgcagccaaa 420

acgacacccc catctgtcta tccactggcc cctggatctg ctgcccaaac taactccatg 480

gtgaccctgg gatgcctggt caagggctat ttccctgagc cagtgacagt gacctggaac 540

tctggatccc tgtccagcgg tgtgcacacc ttcccagctg tcctgcagtc tgacctctac 600

actctgagca gctcagtgac tgtcccctcc agcacctggc ccagcgagac cgtcacctgc 660

aacgttgccc acccggccag cagcaccaag gtggacaaga aaattgtgcc cagggattgt 720

ggttgtaagc cttgcatatg tacagtccca gaagtatcat ctgtcttcat cttcccccca 780

aagcccaagg atgtgctcac cattactctg actcctaagg tcacgtgtgt tgtggtagac 840

atcagcaagg atgatcccga ggtccagttc agctggtttg tagatgatgt ggaggtgcac 900

acagctcaga cgcaaccccg ggaggagcag ttcaacagca ctttccgctc agtcagtgaa 960

cttcccatca tgcaccagga ctggctcaat ggcaaggagt tcaaatgcag ggtcaacagt 1020

gcagctttcc ctgcccccat cgagaaaacc atctccaaaa ccaaaggcag accgaaggct 1080

ccacaggtgt acaccattcc acctcccaag gagcagatgg ccaaggataa agtcagtctg 1140

acctgcatga taacagactt cttccctgaa gacattactg tggagtggca gtggaatggg 1200

cagccagcgg agaactacaa gaacactcag cccatcatgg acacagatgg ctcttacttc 1260

gtctacagca agctcaatgt gcagaagagc aactgggagg caggaaatac tttcacctgc 1320

tctgtgttac atgagggcct gcacaaccac catactgaga agagcctctc ccactctcct 1380

ggtaaataa 1389

<210> 12

<211> 702

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atggtcctta tgttactgct gctatgggtt ccaggttcca ctggtgacat tgtgctgaca 60

cagtctcctg cttccttagc tgtatctctg gggcagaggg ccaccatctc atgcagggcc 120

agtaaaagtg tcagtacatc tggctatagt tatctgcact ggtaccaaca gaaaccagga 180

cagccaccca aactcctcat ctatcttgca tccaacctag aatctggggt ccctgccagg 240

ttcagtggca gtgggtctgg gacagacttc accctcaaca tccatcctgt ggaggaggag 300

gatgctgcaa cctattactg tcagcacagt agggagcttc ctctcacgtt cggtgctggg 360

accaagctgg acctgaaacg ggctgatgct gcaccaactg tatccatctt cccaccatcc 420

agtgagcagt taacatctgg aggtgcctca gtcgtgtgct tcttgaacaa cttctacccc 480

aaagacatca atgtcaagtg gaagattgat ggcagtgaac gacaaaatgg cgtcctgaac 540

agttggactg atcaggacag caaagacagc acctacagca tgagcagcac cctcacgttg 600

accaaggacg agtatgaacg acataacagc tatacctgtg aggccactca caagacatca 660

acttcaccca ttgtcaagag cttcaacagg aatgagtgct aa 702

<210> 13

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ctggttccgc gtggatccgg atccatgagt cttctaaccg aggt 44

<210> 14

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ggccgcgata tcaagcttaa gctttcactt gaaccgctgc agtt 44