阅读说明：本技术 抗cd97单克隆抗体、其可变区与恒定区序列及应用 (anti-CD 97 monoclonal antibody, variable region and constant region sequence and application thereof ) 是由 尹金龙 师冰洋 吴海刚 于 2019-10-29 设计创作，主要内容包括：本发明涉及抗CD97单克隆抗体、其可变区与恒定区序列及应用,属于生物技术领域。本发明抗CD97单克隆抗体的可变区序列包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的重链和核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的轻链序列。本发明所述可变区序列制备得到的抗CD97单克隆抗体能够与CD97特异性结合,可用于与CD97表达量过量、失控等有关的疾病(如脑瘤)治疗药物的制备。(The invention relates to an anti-CD 97 monoclonal antibody, a variable region and constant region sequence and application thereof, belonging to the technical field of biology. The variable region sequence of the anti-CD 97 monoclonal antibody comprises a heavy chain with a nucleotide sequence shown as SEQ ID NO. 1 and a light chain with a nucleotide sequence shown as SEQ ID NO. 2. The anti-CD 97 monoclonal antibody prepared by the variable region sequence can be specifically combined with CD97, and can be used for preparing medicaments for treating diseases (such as brain tumor) related to excessive expression quantity, uncontrolled control and the like of CD 97.)

抗CD97单克隆抗体、其可变区与恒定区序列及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及具有特异性结合CD97生物活性的抗CD97单克隆抗体、其可变区与恒定区序列及抗脑瘤的应用。

背景技术

恶性脑胶质瘤是临床上最常见的一类脑部肿瘤，其发病率在脑部肿瘤中高达60％。多形性胶质母细胞瘤(Glioblastoma,GBM)是恶性脑胶质瘤中恶性程度最高的类型。我国的恶性脑胶质瘤发病率为1-4/100。脑胶质瘤干细胞(GSC)具有一般干细胞的特性，即自我更新能力、可分化性，其在脑胶质瘤的侵袭、耐药、放射线抵抗性等中扮演决定性的作用。

CD97是一种含有七次跨膜结构的二聚体糖蛋白，其分子量在75～85kDa之间，主要在巨噬细胞/单核细胞、粒细胞表面持续表达，而其他血液细胞中尚未发现高表达。CD97的生物学功能，主要集中在类风湿滑膜中导致炎症发生(Arthritis and Rheumatism,1999,42(4):650-658.)、作为甲状腺癌去分化指标(CancerResearch,1997,57(9):1798-1806.)、调控表皮细胞粘附性和侵袭性(Blood,2005,105(7):2836-2844.)等。根据临床样本分析，在脑胶质瘤中，CD97高表达能够显著性增强其侵袭性、降低患者生存率(PloS One,2013,8(4):e62765.)，显示出其作为脑胶质瘤干细胞潜在生物靶标的特性。

抗体是一种由淋巴B细胞分泌的蛋白分子，由两条相同的重链、轻链所组成，轻链和重链又包含可变区和恒定区。通过抗体与抗原的特异性结合，可以实现抗原分子的活性中和、最终实现疾病治疗的目的。但目前并没有一种具有治疗性质的抗CD97单克隆抗体。

发明内容

本发明的目的在于提供抗CD97单克隆抗体、其可变区与恒定区序列及应用。本发明所述可变区序列制备得到的抗CD97单克隆抗体能够与CD97特异性结合，可用于与CD97表达量过量、失控等有关的疾病(如脑瘤)治疗药物的制备。

本发明提供了抗CD97单克隆抗体的可变区序列，所述可变区序列包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的重链和核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的轻链序列。

本发明还提供了抗CD97单克隆抗体的恒定区序列，所述恒定区序列包括核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的重链和核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的轻链序列。

本发明还提供了一种基于上述技术方案所述可变区序列的抗CD97嵌合抗原受体CD97-scfv，所述CD97-scfv的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

优选的是，所述CD97-scfv的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的序列。

本发明还提供了包含上述技术方案所述抗CD97嵌合抗原受体CD97-scfv的T淋巴细胞。

本发明还提供了基于上述技术方案所述可变区序列或上述技术方案所述恒定区序列或上述技术方案所述抗CD97嵌合抗原受体CD97-scfv制备得到的抗CD97单克隆抗体。

本发明还提供了上述技术方案所述可变区序列或上述技术方案所述恒定区序列或上述技术方案所述抗CD97嵌合抗原受体CD97-scfv或上述技术方案所述T淋巴细胞或上述技术方案所述抗CD97单克隆抗体在制备预防和/或治疗由CD97表达过量、失控所致疾病的药物中的应用。

优选的是，所述疾病包括脑瘤。

本发明提供了抗CD97单克隆抗体恒定区、可变区序列。CD97，相比其他传统生物学靶点，其与脑胶质瘤侵袭性密切相关的特异性生物学靶点，通过抑制其活性，能够降低脑胶质瘤干细胞的侵袭性、抑制肿瘤增殖并提高患者生存率。本发明所述可变区序列制备得到的抗CD97单克隆抗体能够与CD97特异性结合，可用于与CD97表达量过量、失控等有关的疾病(如脑瘤)治疗药物的制备。试验结果表明，干扰或者沉默CD97蛋白能够显著性抑制脑胶质瘤干细胞的增殖(图3)。

附图说明

图1为本发明提供的CD97单克隆抗体轻链、重链质粒示意图；其中，图1-1为CD97单克隆抗体轻链示意图，图1-2为CD97单克隆抗体重链质粒示意图；

图2为本发明提供的CD97抗体与CD97蛋白结合力测试结果图；其中，图2-1为抗原-抗体结合力测试结果，图2-2为抗原-抗体结合力测试拟合结果；

图3为沉默CD97后胶质瘤干细胞系的增殖被显著性地抑制；其中，图3A为流式细胞术表征CD97干扰RNA转染至脑胶质瘤干细胞系83中效率图；图3B为蛋白印迹(WB)结果；图3C为蛋白印迹(WB)结果；图3D为CD97被沉默对脑胶质瘤干细胞系83的增殖抑制结果；图3E为CD97被沉默对脑胶质瘤干细胞系CSC2的增殖抑制结果；图3F为CD97被沉默对脑胶质瘤干细胞系528的增殖抑制结果。

具体实施方式

本发明提供了抗CD97单克隆抗体的可变区序列，所述可变区序列包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的重链和核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的轻链序列。

本发明还提供了抗CD97单克隆抗体的恒定区序列，所述恒定区序列包括核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的重链和核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的轻链序列。

本发明优选使用pUC质粒进行轻链和重链的表达，如图1所示，pUC质粒JK4-P-L(图1-1)表达抗体轻链片段，表达位点从KnpI(1486)至Xba I(2193)。pUC质粒JK4-P-H(图1-2)表达抗体重链片段，表达位点从KnpI(1486)至Xba I(2880)。本发明还提供了一种基于上述技术方案所述可变区序列的抗CD97嵌合抗原受体CD97-scfv，所述CD97-scfv的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示：

其中，前部分加下划线的(第1到第321位)为轻链可变区，非倾斜无下划线的(第322到第375位)为linker，倾斜且加下划线的(第376到第735位)为重链可变区。

在本发明中，所述CD97-scfv的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的序列。

其中，前部分加下划线的(第1到第107位)为轻链可变区，非倾斜无下划线的(第108到第125位)为linker，倾斜且加下划线的(第126到第245位)为重链可变区。

本发明还提供了包含上述技术方案所述抗CD97嵌合抗原受体CD97-scfv的T淋巴细胞。

本发明还提供了基于上述技术方案所述可变区序列或上述技术方案所述恒定区序列或上述技术方案所述抗CD97嵌合抗原受体CD97-scfv制备得到的抗CD97单克隆抗体。

本发明还提供了上述技术方案所述可变区序列或上述技术方案所述恒定区序列或上述技术方案所述抗CD97嵌合抗原受体CD97-scfv或上述技术方案所述T淋巴细胞或上述技术方案所述抗CD97单克隆抗体在制备预防和/或治疗由CD97表达过量、失控所致疾病的药物中的应用。

在本发明中，所述疾病包括脑瘤。

下面结合具体实施例对本发明所述的抗CD97单克隆抗体、其可变区与恒定区序列及应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

CD97-His(11280-H08H)与CD97抗体(Mouse Mab)结合常数是采用ProteOn XPR36生物传感器进行测量，芯片采用GLC(Bio-Rad,Hercules,CA)，温度为25℃。CD97(170RU)利用偶联剂(400mM EDC与100mM SNHS经1：1混合溶，1/500稀释)偶联至配体通道，时间为3分钟，浓度为15μg/mL，缓冲溶液为10mM的乙酸钠溶液(pH＝4.5)，最后用1M的乙醇胺盐酸溶液封闭剩余活化的位点。芯片表面采用IgG稀释缓冲溶液进行洗涤，重新处理。实验流动相采用PBST(pH＝7.4)。

纯化后的CD97鼠抗通过“one-shotkinetic”模式在3分钟之内注射，采用0.8333nM、1.67nM、3.33nM、6.67nM四个浓度进行测试。CD97抗体与CD97蛋白结合力测试结果如图2和表1所示，其中，图2-1为抗原-抗体结合力测试结果，图2-2为抗原-抗体结合力测试拟合结果(图中曲线由下到上分别对应0.8333nM、1.67nM、3.33nM、6.67nM四个浓度)，可见，本序列所获得单克隆CD97抗体与CD97抗原分子具有优异的结合能力。干扰或者沉默CD97蛋白能够显著性抑制脑胶质瘤干细胞的增殖，结果如图3所示，其中图3A为流式细胞术表征CD97干扰RNA转染至脑胶质瘤干细胞系83中效率；图3B为蛋白印迹(WB)结果，结果表明脑胶质瘤干细胞系CSC2转染CD97干扰RNA后，CD97被沉默；图3C为蛋白印迹(WB)结果，结果表明脑胶质瘤干细胞系528转染CD97干扰RNA后，CD97被沉默；图3D显示CD97被沉默能够显著抑制脑胶质瘤干细胞系83的增殖；图3E显示CD97被沉默能够显著抑制脑胶质瘤干细胞系CSC2的增殖；图3F显示CD97被沉默能够显著抑制脑胶质瘤干细胞系528的增殖。

表1.CD97抗体与CD97蛋白结合力测试结果

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 河南大学

<120> 抗CD97单克隆抗体、其可变区与恒定区序列及应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 381

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggagtcac agtctcaggt ctttgtatac atgttgctgt ggttgtctgg tgttgatgga 60

gacattgtga tgacccagtc tcaaaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 120

gtcacctgca aggccagtca gaatgtgggt attaatgtag tctggtatca acagaaacca 180

gggcaatctc ctaaagcact gatttactcg gcatcctacc ggttcagtgg agtccctgat 240

cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcaa tgtgcagtct 300

gaagacttgg cagagttttt ctgtcagcaa tataacagct ctcctctcac gttcggtgct 360

gggaccaagc tggagctgaa a 381

<210> 2

<211> 417

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgggatgga gctgggtcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt ccactcccag 60

gtacaactgc agcagcctgg ggctgagctg gtgaagcctg gggcctcagt gaagatgtcc 120

tgcaaggctt ctggctacac atttaccagt tacaatattc actgggtaaa gcagacacct 180

ggacagggcc tggaatggat tggagctatt tctccaggaa atggtgatac ttcctacaat 240

cggaagttca aaggcaaggc cacattgact gcagacatat cctccagcac agcctacctg 300

cagctcagca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt tctgtgcaag gttctacggt 360

ggtagctact ggtacttcga tgtctggggc gcagggacca cggtcaccgt ctcctca 417

<210> 3

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgggctgatg ctgcaccaac tgtatccatc ttcccaccat ccagtgagca gttaacatct 60

ggaggtgcct cagtcgtgtg cttcttgaac aacttctacc ccaaagacat caatgtcaag 120

tggaagattg atggcagtga acgacaaaat ggcgtcctga acagttggac tgatcaggac 180

agcaaagaca gcacctacag catgagcagc accctcacgt tgaccaagga cgagtatgaa 240

cgacataaca gctatacctg tgaggccact cacaagacat caacttcacc cattgtcaag 300

agcttcaaca ggaatgagtg ctaa 324

<210> 4

<211> 975

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gccaaaacga cacccccatc tgtctatcca ctggcccctg gatctgctgc ccaaactaac 60

tccatggtga ccctgggatg cctggtcaag ggctatttcc ctgagccagt gacagtgacc 120

tggaactctg gatccctgtc cagcggtgtg cacaccttcc cagctgtcct gcagtctgac 180

ctctacactc tgagcagctc agtgactgtc ccctccagca cctggcccag cgagaccgtc 240

acctgcaacg ttgcccaccc ggccagcagc accaaggtgg acaagaaaat tgtgcccagg 300

gattgtggtt gtaagccttg catatgtaca gtcccagaag tatcatctgt cttcatcttc 360

cccccaaagc ccaaggatgt gctcaccatt actctgactc ctaaggtcac gtgtgttgtg 420

gtagacatca gcaaggatga tcccgaggtc cagttcagct ggtttgtaga tgatgtggag 480

gtgcacacag ctcagacgca accccgggag gagcagttca acagcacttt ccgctcagtc 540

agtgaacttc ccatcatgca ccaggactgg ctcaatggca aggagttcaa atgcagggtc 600

aacagtgcag ctttccctgc ccccatcgag aaaaccatct ccaaaaccaa aggcagaccg 660

aaggctccac aggtgtacac cattccacct cccaaggagc agatggccaa ggataaagtc 720

agtctgacct gcatgataac agacttcttc cctgaagaca ttactgtgga gtggcagtgg 780

aatgggcagc cagcggagaa ctacaagaac actcagccca tcatggacac agatggctct 840

tacttcgtct acagcaagct caatgtgcag aagagcaact gggaggcagg aaatactttc 900

acctgctctg tgttacatga gggcctgcac aaccaccata ctgagaagag cctctcccac 960

tctcctggta aataa 975

<210> 5

<211> 735

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gacattgtga tgacccagtc tcaaaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60

gtcacctgca aggccagtca gaatgtgggt attaatgtag tctggtatca acagaaacca 120

gggcaatctc ctaaagcact gatttactcg gcatcctacc ggttcagtgg agtccctgat 180

cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcaa tgtgcagtct 240

gaagacttgg cagagttttt ctgtcagcaa tataacagct ctcctctcac gttcggtgct 300

gggaccaagc tggagctgaa atctagtggt ggcggtggtt cgggcggtgg tggaggtggt 360

agttctagat cttcccaggt acaactgcag cagcctgggg ctgagctggt gaagcctggg 420

gcctcagtga agatgtcctg caaggcttct ggctacacat ttaccagtta caatattcac 480

tgggtaaagc agacacctgg acagggcctg gaatggattg gagctatttc tccaggaaat 540

ggtgatactt cctacaatcg gaagttcaaa ggcaaggcca cattgactgc agacatatcc 600

tccagcacag cctacctgca gctcagcagc ctgacatctg aggactctgc ggtctatttc 660

tgtgcaaggt tctacggtgg tagctactgg tacttcgatg tctggggcgc agggaccacg 720

gtcaccgtct cctca 735

<210> 6

<211> 245

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Ile Asn

20 25 30

Val Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Glu Phe Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Ser Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Ser Ser Gly Gly Gly

100 105 110

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Gln Val Gln

115 120 125

Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys

130 135 140

Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Ile His

145 150 155 160

Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile

165 170 175

Ser Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Arg Lys Phe Lys Gly Lys

180 185 190

Ala Thr Leu Thr Ala Asp Ile Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Leu

195 200 205

Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Phe

210 215 220

Tyr Gly Gly Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr

225 230 235 240

Val Thr Val Ser Ser

245