阅读说明：本技术 干细胞扩增培养基及干细胞培养方法 (Stem cell amplification culture medium and stem cell culture method ) 是由 孙筱放 何丽娜 程怡 刘能青 谢英俊 于 2019-09-29 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种干细胞扩增培养基及干细胞培养方法,其成分包括基础培养基、干细胞因子、血小板生成素、FMS样酪氨酸激酶3配体、白细胞介素-6,其中,干细胞因子的终浓度为90ng/mL～110ng/mL,血小板生成素的终浓度为10ng/mL～30ng/mL,FMS样酪氨酸激酶3配体的终浓度为90ng/mL～110ng/mL,白细胞介素-6的终浓度为10ng/mL～30ng/mL。利用所述扩增干细胞培养基培养脐带血造血干细胞能呈现明显的细胞扩增效果,细胞表面CD34+表也显著提高,细胞扩增时细胞状态较为稳定,保持其多向分化的能力,所述培养基是一种经济、高效的培养体系。(The invention relates to a stem cell amplification culture medium and a stem cell culture method, which comprises a basal culture medium, stem cell factors, thrombopoietin, FMS-like tyrosine kinase 3 ligand and interleukin-6, wherein the final concentration of the stem cell factors is 90 ng/mL-110 ng/mL, the final concentration of the thrombopoietin is 10 ng/mL-30 ng/mL, the final concentration of the FMS-like tyrosine kinase 3 ligand is 90 ng/mL-110 ng/mL, and the final concentration of the interleukin-6 is 10 ng/mL-30 ng/mL. The umbilical cord blood hematopoietic stem cells cultured by the culture medium for the expanded stem cells can show obvious cell expansion effect, the CD34+ surface on the cell surface is also obviously improved, the cell state is more stable during cell expansion, the multidirectional differentiation capability of the cells is maintained, and the culture medium is an economic and efficient culture system.)

干细胞扩增培养基及干细胞培养方法

技术领域

本发明属于生物工程和生物医药技术领域，具体涉及一种干细胞扩增培养基及干细胞培养方法。

背景技术

造血干细胞是一群具有自我更新及多向分化潜能的细胞，其在保持干细胞相对稳定的同时又可以增殖分化成造血系统中的各系细胞，因其具有重建造血系统及免疫系统的功能，在治疗血液类疾病及免疫缺陷疾病方面发挥着举足轻重的作用，造血干细胞移植是目前治疗上述疾病最有效的方法。脐带血是除骨髓和外周血干细胞外的另一种重要造血干细胞来源，它的优点主要表现在来源充足、具有较高的增殖和扩增潜能、采集不影响供者、受巨细胞病毒和EB病毒污染机会小，移植后免疫排斥发生率低于成年供者的骨髓移植、可以通过建立脐血库随时提供移植所需要的HLA相合的干细胞。虽然脐带血造血干细胞具有上述优势，但是由于一份脐带血所含的细胞数量有限，这大大限制了其在临床上的广泛应用。体外扩增造血干细胞是解决脐带血这一缺陷的重要方法，因而建立和优化脐带血造血干细胞的体外扩增方案尤为重要，以期为临床的广泛应用奠定基础。

在以前的研究中，利用脐带血中的造血干细胞进行过大量的扩增尝试实验，但是并没有理想的结果。其中传统的方式采用血液中的细胞因子来培养脐带血干细胞，但是细胞分化严重，纯度明显降低，无法在临床进行干细胞移植。后来一些研究慢慢转入研究骨髓造血干细胞微环境中的一些信号分子，配体等来有效扩增CD34+造血干细胞/祖细胞，避免外援因子引起的干细胞的分化老化以及自我更新抑制问题。还有一些研究外加DLL1、DSL1等蛋白分子来刺激造血干细胞微环境中的信号分子来适度的扩增造血干细胞。但是上述技术带来的效果仅仅是细微的改善，仍然面临着高效扩增脐带血CD34+细胞的难题。

最近，有相关研究引入多种外援细胞因子至培养基中，通过协同作用提供更有利于干细胞增殖生长的适宜环境，提供定向的干细胞信号刺激，保持相应的细胞表型。研究中较常用的细胞因子有干细胞因子、单核细胞趋化因子、白细胞介素-1β，但其对干细胞的扩增倍数低，并且使用的量均不统一，造血干细胞纯度不高。

发明内容

基于此，本发明提供了一种扩增干细胞的培养基，该培养基能明显提高CD34+造血干细胞的扩增倍数，并且保持其稳定性。

具体技术方案如下：

一种干细胞扩增培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的细胞因子，所述细胞因子包括干细胞因子、血小板生成素、FMS样酪氨酸激酶3配体和白细胞介素-6，其中，

所述干细胞因子的终浓度为90ng/mL～110ng/mL；

所述血小板生成素的终浓度为10ng/mL～30ng/mL；

所述FMS样酪氨酸激酶3配体的终浓度为90ng/mL～110ng/mL；

所述白细胞介素-6的终浓度为10ng/mL～30ng/mL。

在其中一个实施例中，所述基础培养基为无血清IMDM或StemSpan SFEMII培养基。

在其中一个实施例中，还包括添加在所述基础培养基中的芳香烃受体拮抗剂。

在其中一个实施例中，所述芳香烃受体拮抗剂为小分子化合物StemRegenin1，所述StemRegenin 1的终浓度为0.5μM～2μM。

在其中一个实施例中，其中，

所述干细胞因子的终浓度为100ng/mL；

所述血小板生成素的终浓度为20ng/mL；

所述FMS样酪氨酸激酶3配体的终浓度为100ng/mL；

所述白细胞介素-6的终浓度为20ng/mL。

同时，本发明还提供了一种干细胞扩增培养基培养干细胞的方法，包括以下步骤：

(1)血液离心，得单个核细胞；

(2)磁珠分选步骤(1)所得单个核细胞，得干细胞；

(3)用所述的干细胞扩增培养基培养步骤(2)中的干细胞。

在其中一个实施例中，所述干细胞为CD34+造血干细胞。

在其中一个实施例中，所述血液来源于脐带血、骨髓或外周血。

在其中一个实施例中，所述步骤(1)中离心操作为Ficoll淋巴分离液密度梯度离心。

在其中一个实施例中，所述步骤(3)中培养的干细胞的浓度为1×10⁵个细胞/mL～2×10⁵个细胞/mL。

本发明的干细胞扩增培养基及干细胞培养方法具有以下优点和有益效果：

本发明的发明人通过大量实验研究发现，通过将干细胞因子、血小板生成素、FMS样酪氨酸激酶3配体和白细胞介素-6等细胞因子合理复配加至基础培养基中能明显的扩增脐带血造血干细胞，并且细胞因子之间产生增效协同的作用。相对于传统的干细胞培养基，血小板生成素及白细胞介素-6的使用浓度更低，但是脐带血造血干细胞能呈现更加明显的细胞扩增效果，CD34+表达率也显著提高，扩增时并未出现明显的细胞分化而发生老化，制备的干细胞扩增培养基是一种既经济又高效的培养体系。

附图说明

图1为实施例7在不同时间点的(A)细胞数量和(B)扩增倍数图；

图2为实施例7在不同时间点的细胞形态图；

图3为实施例7中细胞表面CD34+的表达图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明提供了一种干细胞扩增培养基，其组分中包括基础培养基和添加在基础培养基中的细胞因子，细胞因子包括干细胞因子、血小板生成素、FMS样酪氨酸激酶3配体和白细胞介素-6，其中，

干细胞因子的终浓度为90ng/mL～110ng/mL；

血小板生成素的终浓度为10ng/mL～30ng/mL；

FMS样酪氨酸激酶3配体的终浓度为90ng/mL～110ng/mL；

白细胞介素-6的终浓度为10ng/mL～30ng/mL。

在一个具体示例中，基础培养基为无血清IMDM或StemSpan SFEMII培养基，优选为无血清StemSpan SFEMII培养基。无血清StemSpan SFEMII培养基能提供干细胞良好的生长条件，使用该基础培养基在一定程度上能进一步提高干细胞的扩增效率。

在一个具体示例中，干细胞扩增培养基还包括添加在基础培养基中的芳香烃受体拮抗剂。

进一步地，芳香烃受体拮抗剂为小分子化合物StemRegenin 1。通过添加小分子StemRegenin 1，能促进人造血干细胞的大量扩增和自我更新。

优选地，StemRegenin 1的终浓度为0.5μM～2μM。

在一个具体示例中，其中，

干细胞因子的终浓度优选是100ng/mL；

血小板生成素的终浓度优选是20ng/mL；

FMS样酪氨酸激酶3配体的终浓度优选是100ng/mL；

白细胞介素-6的终浓度优选是20ng/mL。

上述细胞因子中，干细胞因子可通过锚定并且表达于造血干细胞表面的酪氨酸受体c-kit而发挥作用，c-kit的表达将引起造血干细胞的扩增。血小板生成素可刺激巨核细胞增殖分化，调节并维持早期造血干细胞的增殖及自我更新。FMS样酪氨酸激酶3配体以其特异性TKR结合向细胞内传递信号，诱导造血干细胞的增殖，同时显著减少造血干细胞的凋亡,并改善和提高造血干细胞体外生存能力。

本发明还提供了一种利用干细胞扩增培养基培养干细胞的方法，包括以下步骤：

(1)血液离心，得单个核细胞；

(2)磁珠分选步骤(1)所得单个核细胞，得干细胞；

(3)用所述的干细胞扩增培养基培养步骤(2)中的干细胞。

在一个具体示例中，干细胞选用CD34+造血干细胞。

优选地，血液来源于脐带血、骨髓或外周血。

在一个具体示例中，离心操作为Ficoll淋巴分离液密度梯度离心。

在一个具体示例中，干细胞扩增培养基培养的干细胞的浓度为1×10⁵个细胞/mL～2×10⁵个细胞/mL。

以下结合具体实施例对本发明的干细胞扩增培养基及干细胞培养方法做进一步详细的说明。

以下实施例所用的无血清StemSpan SFEMII基础培养基，生产厂商为stemcell，货架号为09655；干细胞因子，生产厂商为PeproTech，货架号为300-07；血小板生成素，生产厂商为PeproTech，货架号为300-18；FMS样酪氨酸激酶3配体，生产厂商为PeproTech，货架号为300-19；白细胞介素-6，生产厂商为PeproTech，货架号为200-06；StemRegenin 1，生产厂商为CellagenTech，货架号为C7710；Ficoll淋巴分离液，生产厂商为Stemcell，货架号为07851。

可理解，在其他实施例中，所用的基础培养基和细胞因子不限于此。

以下实施例和对比例使用的细胞纯化过程如下：

1、脐带血单个核细胞的提取

(1)将新鲜获得的脐带血与PBS以1:1的体积比混匀后，再缓慢加入含0.5倍体积的Ficoll淋巴分离液中，注意不要破坏分离界面；

(2)将上述脐带血混合液梯度离心30分钟，离心速度为800g/min，待分层后，用吸管小心吸取其中的白膜层细胞至新的离心管中，用PBS洗涤细胞3次，裂红后即可得到单个核细胞。

2、脐血CD34+造血干细胞的纯化

将分离得到的单个核细胞计数，以每10⁸个细胞加入300μL磁珠分选缓冲液、100μLFcR封闭剂，100μL CD34磁珠的比例进行细胞混合，然后4℃下避光孵育30分钟，然后加入10mL磁珠分选缓冲液进行洗涤，离心10分钟后去上清，加入500μL磁珠分选缓冲液重悬细胞准备磁珠分选，提前用500μL磁珠分选缓冲液湿润分离柱，将合适型号的分离柱安放在磁珠分选器上，然后将上述细胞悬液缓慢加入分离柱中，最后用缓冲液洗柱子3次，取下分离柱用1mL缓冲液将分离柱中的细胞冲洗至离心管中，即为CD34+造血干细胞。

实施例1

1、扩增干细胞培养基的配制

将细胞因子干细胞因子、血小板生成素、FMS样酪氨酸激酶3配体、白细胞介素-6、StemRegenin 1加入无血清StemSpan SFEMII基础培养基中，得到包含上述细胞因子终浓度分别为90ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、20ng/mL、1μM的扩增干细胞的培养基，置于4℃下备用。

2、细胞培养

将CD34+造血干细胞接种于35mm细胞培养皿中，接种密度为1×10⁵cells/mL，加入上述扩增干细胞培养基2mL，于37℃、5％CO₂培养条件下培养，根据细胞培养状态，每隔2天补加500μL新鲜的扩增干细胞培养基。

实施例2

1、扩增干细胞培养基的配制

将细胞因子干细胞因子、血小板生成素、FMS样酪氨酸激酶3配体、白细胞介素-6、StemRegenin 1加入无血清StemSpan SFEMII基础培养基中，得到包含上述细胞因子终浓度分别为100ng/mL、20ng/mL、90ng/mL、20ng/mL、1μM的扩增干细胞的培养基，置于4℃下备用。

2、细胞培养

将CD34+造血干细胞接种于35mm细胞培养皿中，接种密度为1×10⁵cells/mL，加入上述扩增干细胞培养基2mL，于37℃、5％CO₂培养条件下培养，根据细胞培养状态，每隔2天补加500μL新鲜的扩增干细胞培养基。

实施例3

1、扩增干细胞培养基的配制

将细胞因子干细胞因子、血小板生成素、FMS样酪氨酸激酶3配体、白细胞介素-6、StemRegenin 1加入无血清StemSpan SFEMII基础培养基中，得到包含上述细胞因子终浓度分别为100ng/mL、30ng/mL、100ng/mL、20ng/mL、1μM的扩增干细胞的培养基，置于4℃下备用。

2、细胞培养

将CD34+造血干细胞接种于35mm细胞培养皿中，接种密度为1×10⁵cells/mL，加入上述扩增干细胞培养基2mL，于37℃、5％CO₂培养条件下培养，根据细胞培养状态，每隔2天补加500μL新鲜的扩增干细胞培养基。

实施例4

1、扩增干细胞培养基的配制

将细胞因子干细胞因子、血小板生成素、FMS样酪氨酸激酶3配体、白细胞介素-6、StemRegenin 1加入无血清StemSpan SFEMII基础培养基中，得到包含上述细胞因子终浓度分别为100ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、30ng/mL、1μM的扩增干细胞的培养基，置于4℃下备用。

2、细胞培养

将CD34+造血干细胞接种于35mm细胞培养皿中，接种密度为1×10⁵cells/mL，加入上述扩增干细胞培养基2mL，于37℃、5％CO₂培养条件下培养，根据细胞培养状态，每隔2天补加500μL新鲜的扩增干细胞培养基。

实施例5

1、扩增干细胞培养基的配制

将细胞因子干细胞因子、血小板生成素、FMS样酪氨酸激酶3配体、白细胞介素-6、StemRegenin 1加入无血清StemSpan SFEMII基础培养基中，得到包含上述细胞因子终浓度分别为100ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、20ng/mL、0.5μM的扩增干细胞的培养基，置于4℃下备用。

2、细胞培养

将CD34+造血干细胞接种于35mm细胞培养皿中，接种密度为1×10⁵cells/mL，加入上述扩增干细胞培养基2mL，于37℃、5％CO₂培养条件下培养，根据细胞培养状态，每隔2天补加500μL新鲜的扩增干细胞培养基。

实施例6

1、扩增干细胞培养基的配制

将细胞因子干细胞因子、血小板生成素、FMS样酪氨酸激酶3配体、白细胞介素-6、StemRegenin 1加入无血清StemSpan SFEMII基础培养基中，得到包含上述细胞因子终浓度分别为110ng/mL、30ng/mL、110ng/mL、30ng/mL、2μM的扩增干细胞的培养基，置于4℃下备用。

2、细胞培养

将CD34+造血干细胞接种于35mm细胞培养皿中，接种密度为1×10⁵cells/mL，加入上述扩增干细胞培养基2mL，于37℃、5％CO₂培养条件下培养，根据细胞培养状态，每隔2天补加500μL新鲜的扩增干细胞培养基。

实施例7

1、扩增干细胞培养基的配制

将细胞因子干细胞因子、血小板生成素、FMS样酪氨酸激酶3配体、白细胞介素-6、StemRegenin 1加入无血清StemSpan SFEMII基础培养基中，得到包含上述细胞因子终浓度分别为100ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、20ng/mL、1μM的扩增干细胞的培养基，置于4℃下备用。

2、细胞培养

将CD34+造血干细胞接种于35mm细胞培养皿中，接种密度为1×10⁵cells/mL，加入上述扩增干细胞培养基2mL，于37℃、5％CO₂培养条件下培养，根据细胞培养状态，每隔2天补加500μL新鲜的扩增干细胞培养基。

对比例1

1、扩增干细胞培养基的配制

将细胞因子干细胞因子、血小板生成素、FMS样酪氨酸激酶3配体、白细胞介素-6加入无血清StemSpan SFEMII基础培养基中，得到包含上述细胞因子终浓度分别为100ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、20ng/mL的扩增干细胞的培养基，置于4℃下备用。

2、细胞培养

将CD34+造血干细胞接种于35mm细胞培养皿中，接种密度为1×10⁵cells/mL，加入上述扩增干细胞培养基2mL，于37℃、5％CO₂培养条件下培养，根据细胞培养状态，每隔2天补加500μL新鲜的扩增干细胞培养基。

对比例2

1、扩增干细胞培养基的配制

将细胞因子干细胞因子、血小板生成素、FMS样酪氨酸激酶3配体、StemRegenin 1加入无血清StemSpan SFEMII基础培养基中，得到包含上述细胞因子终浓度分别为100ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、1μM的扩增干细胞的培养基，置于4℃下备用。

2、细胞培养

将CD34+造血干细胞接种于35mm细胞培养皿中，接种密度为1×10⁵cells/mL，加入上述扩增干细胞培养基2mL，于37℃、5％CO₂培养条件下培养，根据细胞培养状态，每隔2天补加500μL新鲜的扩增干细胞培养基。

对比例3

1、扩增干细胞培养基的配制

将细胞因子干细胞因子、血小板生成素、FMS样酪氨酸激酶3配体、白细胞介素-6加入10％FBS的IMDM基础培养基中，得到包含上述细胞因子终浓度分别为100ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、50ng/mL的扩增干细胞的培养基，置于4℃下备用。

2、细胞培养

将CD34+造血干细胞接种于35mm细胞培养皿中，接种密度为1×10⁵cells/mL，加入上述扩增干细胞培养基2mL，于37℃、5％CO₂培养条件下培养，根据细胞培养状态，每隔2天补加500μL新鲜的扩增干细胞培养基。

对比例4

无血清StemSpan SFEMII基础培养基中不加入细胞因子，其他实验条件和对比例3相同。

细胞扩增评价试验

台盼蓝染色法计数细胞：对实施例1～7和对比例1～4分别在1-7天利用台盼蓝染色法计数细胞量及存活率，细胞混匀后取10μL悬液与10μL台盼蓝充分混匀，取10μL加入计数器，上机检测获取细胞数量及存活率。同时在细胞培养1-7天拍照记录细胞形态变化。

流式细胞仪分析干细胞CD34+表达

收集细胞悬液后用PBS洗1次，计数细胞，取5×10⁵个细胞用于流式细胞仪检测，细胞离心后弃上清，加入100μL PBS及5μL CD34+流式抗体，4℃孵育30分钟后用PBS洗2次，加入500μL PBS重悬细胞，然后上机检测。

以上实施例1～7和对比例1～4中的细胞在培养一周后细胞的数量、扩增倍数以及CD34+表达率见表1。

表1

由表1实施例1～7以及对比例1～4的结果可知，利用本发明所述方法得到的扩增干细胞培养基培养脐带血CD34+造血干细胞能达到106倍的扩增倍数，其中CD34+的表达率高达88.6％，相对于传统的血小板生成素和白细胞介素-6的用量更少，但是扩增倍数显著提高。由实施例7和对比例1比较可知，StemRegenin 1对细胞的扩增倍数和干细胞CD34+表达率影响较大，由实施例7和对比例2对比可知，白细胞介素-6对细胞的增殖效应影响较大，但是对干细胞CD34+的表达率影响较小。对比例3的结果表明传统方法配制的高浓度的细胞因子并没有显著提高干细胞的扩增倍数，CD34+表达率也不高。从图1反应了本发明采用实施例7所述的扩增培养基培养脐带血造血干细胞在第三天开始呈现加速的扩增过程，并通过扫描电子显微镜观察(图2)到前两天的培养过程中细胞密度较稀疏，第3，5，7天呈现更浓密的状态，并且整个过程中细胞的形貌没有发生改变，通过流式细胞仪定量分析显示(图3)，干细胞CD34+表达率为88.606％。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。