无血清培养基及扩增造血干细胞的方法
阅读说明：本技术 无血清培养基及扩增造血干细胞的方法 (Serum-free medium and method for expanding hematopoietic stem cells ) 是由 罗玮瑜 曾佩娸 余昭勋 于 2018-06-05 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种无血清培养基及扩增造血干细胞的方法。所述无血清培养基包括无血清基础培养基、细胞激素、脐带间质干细胞条件培养基以及辅助成分。所述细胞激素包括干细胞因子、血小板生成素以及造血生长因子Flt3配体。所述脐带间质干细胞条件培养基源自于经培养的人类脐带间质干细胞。所述辅助成分包括维生素C、维生素E、或是维生素C及维生素E的组合。(The invention provides a serum-free culture medium and a method for amplifying hematopoietic stem cells. The serum-free culture medium comprises a serum-free basal culture medium, cell hormones, a cord mesenchymal stem cell conditioned medium and auxiliary components. The cytokines include stem cell factor, thrombopoietin, and hematopoietic growth factor Flt3 ligand. The umbilical cord mesenchymal stem cell conditioned medium is derived from cultured human umbilical cord mesenchymal stem cells. The auxiliary component comprises vitamin C, vitamin E, or the combination of vitamin C and vitamin E.)
技术领域
本发明涉及一种无血清培养基，尤其涉及一种无血清培养基及扩增造血干细胞的方法。
背景技术
脐带血移植(umbilical cord blood transplantation；UBCT)是一种新的治疗方法，可用以治疗以前无法被治愈的疾病。然而，成人中的脐带血移植受限于每个移植个体中可用的少量原始造血干细胞(hematopoietic stem cells；HSC)。少量的原始造血干细胞会导致移植后的植入(engraftment)被延迟。目前，运用离体(ex vivo)的方式扩增脐带血前驱细胞的尝试并不是很成功。离体扩增的方式通常会导致成熟的造血干细胞进行扩增，而未成熟的造血干细胞不进行扩增。此外，脐带血造血干细胞的离体扩增可能会导致促进细胞凋亡，破坏骨髓归巢(marrow homing)和启动细胞周期(cell cycling)等缺陷。
造血干细胞的离体扩增的困难点在于，对原始造血干细胞生长和增殖的各种条件因子的需求。早期的研究表明，造血干细胞的离体生长需要血清中存在的其他组织所产生的细胞激素和造血生长因子。这些因子包括例如红血球生成素、第3型白介素(interleukin-3；IL-3)、粒细胞巨噬细胞聚落刺激因子(granulocyte macrophage-colonystimulating factor；GM-CSF)、粒细胞聚落刺激因子(granulocyte-colony stimulatingfactor；G-CSF)、干细胞因子(stem cell factor；SCF)以及第11型白介素(interleukin-11；IL-11)等。
由于对各种复杂因子的要求，难以产生足够的造血干细胞数目并且避免起始细胞群的分化。从体外(in vitro)的研究发现，细胞培养基中的造血干细胞的自我更新和分化是难以控制的。现有运用细胞激素(cytokines)的方法并无法有效地且可靠地帮助未成熟干细胞在培养基中的扩增，这表明还需要运用其他(除了细胞激素以外的)因子来帮助扩增。
大多数的原始造血干细胞通常在其细胞膜上具有CD34的存在。CD34为功能未知的表面醣蛋白。带有CD34抗原的细胞被认为是造成多谱系植入(multi-lineageengraftment)的原因。虽然CD34存在于大多数增殖性细胞上，但CD34在其它细胞上却很少出现，例如，在收集到的单核细胞(mononuclear cells；MNC)中，仅约1％发现有CD34的存在。由于增殖性造血干细胞是CD34+的细胞，因此，从CD34+的细胞开始的造血扩张具有较大的潜力。然而，由于缺乏可能提供细胞激素和其他刺激因子的辅助细胞，单独从CD34+细胞的造血扩张开始将不会成功。因此，造血干细胞的扩增通常在是在血清和其他组织作为饲养层(feeder layers)的存在下来进行。
然而，血清的运用是不理想的，因其会造成可能的污染和不利的免疫反应。因此，目前在积极地寻找无血清(serum-free)的替代品。例如，在美国专利US5,405,772中公开了一种用于培养造血干细胞和骨髓基质细胞的无血清或血清耗尽(serum-depleted)的培养基，且在美国专利US6,733,746中公开了用于扩增CD34+造血干细胞和骨髓谱系(myeloidlineage)细胞的无血清培养基。
尽管这些技术已经为造血干细胞的扩增提供了有用的培养基，但目前仍需要更好的培养基和扩增造血干细胞的方法。
发明内容
本发明提供一种无血清培养基，其可用于扩增造血干细胞。
本发明的一实施例中，提供一种用于扩增造血干细胞的无血清培养基。所述无血清培养基包括无血清基础培养基、细胞激素、脐带间质干细胞条件培养基(umbilical cordmesenchymal stem cell conditioned medium)以及辅助成分。所述细胞激素包括干细胞因子(SCF)、血小板生成素(thrombopoietin；TPO)以及造血生长因子Fms相关酪氨酸激酶3配体(hematopoietic growth factor Fms-related tyrosine kinase 3ligand；Flt3L)。所述脐带间质干细胞条件培养基源自于经培养的人类脐带间质干细胞。所述辅助成分包括维生素C、维生素E、或是维生素C及维生素E的组合。
根据本发明的一些实施例，所述无血清基础培养基可以是任何适合细胞培养的无血清基础培养基。在所属领域中已知道有许多合适的培养基。例如，在美国专利US5,405,772中公开了一种用于培养造血干细胞和骨髓基质细胞的无血清或血清耗尽(serum-depleted)的培养基。在美国专利US6,733,746中公开了用于扩增CD34+造血干细胞和骨髓谱系(myeloid lineage)细胞的无血清培养基。在美国专利US8,762,074中公开了一种确认无血清真核细胞培养基补充物的最佳组成的方法。这些专利的公开内容通过引用的方式完整并入。在这些现有技术参考文献中所公开的基础培养基可以与本发明的实施例一起使用。
在本发明的一些实施例中，所述辅助成分为维生素C。
在本发明的一些实施例中，所述辅助成分为维生素E。
在本发明的一些实施例中，所述辅助成分包括维生素C及维生素E的组合。
在本发明的一些实施例中，所述辅助成分还包括***(estradiol；E2)。
在本发明的一些实施例中，所述脐带间质干细胞条件培养基是通过包括以下步骤的方法所制备：(a)在细胞培养基中培养人类脐带间质干细胞；以及(b)分离所述细胞培养基以获得条件培养基。
在本发明的一些实施例中，所述脐带间质干细胞条件培养基的制备方法还包括步骤(c)：将所述条件培养基运用5千道尔顿至10千道尔顿的阻断性薄膜(cut-off membrane)进行浓缩以得到经浓缩脐带间质干细胞条件培养基。
在本发明的一些实施例中，在所述步骤(c)中，所述脐带间质干细胞条件培养基是浓缩7倍至12倍。
在本发明的一些实施例中，所述脐带间质干细胞条件培养基是浓缩至100mg/ml的蛋白质浓度。所述脐带间质干细胞条件培养基可以浓缩至理想的蛋白质浓度，例如，50-200mg/ml，较佳是100-150mg/ml(例如100mg/ml、110mg/ml、120mg/ml、130mg/ml、140mg/ml或150mg/ml)。
在本发明的一些实施例中，在所述脐带间质干细胞条件培养基中的蛋白质成分的分子量大于5千道尔顿。这可以是例如使用阻断分子量为5千道尔顿的薄膜通过透析或是超微过滤的方式来实现。
在本发明的一些实施例中，所述细胞激素还包括第3型白介素(interleukin 3；IL-3)及第6型白介素(interleukin 6；IL-6)。
在本发明的一些实施例中，所述细胞激素还包括粒细胞聚落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor；G-CSF)。
在本发明的一些实施例中，无血清基础培养基的主要组成包括人类白蛋白(humanalbumin)、白蛋白相关蛋白和肽、胰岛素、盐类、多醣、氨基酸、维生素、含有酚红(phenol-red)、L-谷氨酰胺(L-glutamine)和β-巯乙醇(β-mercaptoethanol)的缓冲液。
在本发明的一些实施例中，无血清基础培养基可以是无血清干细胞生长培养基(serum-free stem cell growth medium；SCGM)或X-VIVO 15。
在本发明的另一实施例中，揭示了一种扩增造血干细胞的方法。所述方法包括以下步骤。提供一种无血清培养基。所述无血清培养基是通过将无血清基础培养基与细胞激素、脐带间质干细胞条件培养基以及辅助成分进行混合所制备而成，其中所述细胞激素包括干细胞因子、血小板生成素以及造血生长因子Fms相关酪氨酸激酶3配体，所述脐带间质干细胞条件培养基源自于经培养的人类脐带间质干细胞，且所述辅助成分包括维生素C、维生素E、或是维生素C及维生素E的组合。在所述无血清培养基中将造血干细胞培养第一段时间。
在本发明的一些实施例中，所述的扩增造血干细胞的方法还包括在第一段时间后补充(replenishing)50-80％的无血清培养基，并继续培养第二段时间。
在本发明的一些实施例中，是将造血干细胞培养第一段时间(例如1-20天)，然后补充50-80％的无血清培养基并继续培养第二段时间(例如1-20天)。这种补充和清理可被重复多次。
基于上述，由于本发明的无血清培养基至少包含无血清基础培养基、细胞激素、脐带间质干细胞条件培养基以及辅助成分，因此，可以改善造血干细胞的扩增。
为让本发明的上述特征和优点能更明显易懂，下文特举实施例，并配合附图作详细说明如下。
附图说明
提供附图以进一步理解本发明，并且，附图被结合在本说明书中并构成其一部分。附图示出了本发明的实施例，并且与本文一起用于解释本发明的原理。
图1A及图1B显示了在饲养层存在下使用特定的生长培养基的造血干细胞扩增的结果。
图2A及图2B显示了通过评估添加4种辅助成分至含有饲养层的生长培养基对造血干细胞扩增所造成的影响的结果。
图3A及图3B显示了通过使用脐带间质干细胞条件培养基代替饲养层对造血干细胞扩增所造成的影响的结果。
图4A及图4B显示了通过使用经浓缩脐带间质干细胞条件培养基代替饲养层对造血干细胞扩增所造成的影响的结果。
图5A及图5B显示了通过评估添加4种辅助成分至经浓缩脐带间质干细胞条件培养基对造血干细胞扩增所造成的影响的结果。
图6A及图6B显示在造血干细胞扩增中比较聚落形成单位扩增倍数以及累积CD34+细胞扩增倍数的结果。
图7A及图7B显示了通过评估***(E2)、维生素C及维生素E的组合下对造血干细胞扩增所造成的影响的结果。
图8A及图8B显示了通过评估维生素C对造血干细胞扩增所造成的影响的结果。
图9A及图9B显示了通过评估维生素E对造血干细胞扩增所造成的影响的结果。
图10A及图10B显示了通过评估维生素C及维生素E的组合下对造血干细胞扩增所造成的影响的结果。
图11A及图11B显示了通过补充培养基对造血干细胞扩增所造成的影响的结果。
图12A及图12B显示了通过使用不同组合的细胞激素对造血干细胞扩增所造成的影响的结果。
图13显示了CD34+细胞相对于总细胞扩增的相对扩增。
图14显示了在造血干细胞扩增中评估红细胞谱系聚落形成单位的百分比。
附图标记说明：
S1、S3-2、S3-3、QC：组别
PC：阳性对照组
SCGM：无血清干细胞生长培养基
IMDM：基础细胞培养基
X-Vivo 15：无血清基础培养基
CTK6/CTK*6：6种不同的细胞激素
SP：辅助成分
SP3：3种辅助成分
SP4：4种辅助成分
UCM：脐带间质干细胞条件培养基
SF-UCM：无血清脐带间质干细胞条件培养基
c-SF-UCM：经浓缩脐带间质干细胞条件培养基
E2：***
Vit.C：维生素C
Vit.E：维生素E
TF：运铁蛋白
具体实施方式
以下将详细参考本发明的较佳实施例，其示例在附图中示出。尽可能地，在附图及描述中将使用相同的标号来表示相同或是相似的部分。
本发明实施例是有关于无血清培养基及扩增造血干细胞(HSC)的方法。根据本发明的实施例，用于造血干细胞扩增的培养基不需要血清或其他辅助组织/细胞(例如饲养层)。相反地，所需的因子被替换为特定的组分。
本发明实施例是以特定的培养基和因子为基础。本实施方式的无血清培养基至少包括无血清基础培养基、细胞激素、脐带间质干细胞条件培养基以及辅助成分。这些组分将在下文中做进一步详细描述。
无血清基础培养基
为了避免可能的污染和不利的免疫反应，基础培养基应该是不含血清的(无血清)，并且不含其他组织或细胞。根据本发明的实施例，用于扩增造血干细胞(HSC)的合适的无血清基础培养基可以是基于任何合适的市售培养基。例如，以下市售培养基已经过测试。
X-VIVOTM 15是适用于造血细胞培养的化学上确定的无血清培养基，其可从龙沙(Lonza；瑞士)获得。
不同的SCGMTM(stem cell growth medium；干细胞生长培养基)可适用于各种细胞类型。举例来说，人类骨髓干细胞生长培养基可从Sigma-Aldrich获得。在实验例中，无血清SCGM是从CellGenix(编号20802-0500)获得，其主要组成包括人类白蛋白(humanalbumin)、白蛋白相关蛋白和肽(例如，视网醇结合蛋白(retinol-binding protein 4)、α-2-醣蛋白1(alpha-2-glycoprotein 1)、甲状腺素运载蛋白(Transthyretin)、血红素结合球蛋白α(Haptoglobinα)、角蛋白前驱物(hornerin precursor))、胰岛素、盐类、多醣、氨基酸、维生素、含有酚红(phenol-red)、L-谷氨酰胺(L-glutamine)和β-巯乙醇(β-mercaptoethanol)的缓冲液。
Iscove's Modified Dulbecco's Media(IMDM)是非常适合用于快速增殖的高密度细胞培养的高浓度合成培养基。IMDM可以从许多商业来源获得，例如从ThermoFisherScientific。然而，IMDM是合成的基础细胞培养基，其通常需要添加血清和其他生长激素以用于细胞生长。在实验例中，IMDM可以用作为阳性对照以与上述用于评估细胞扩增的无血清基础培养基进行比较。
根据本发明的实施例，用于造血干细胞扩增的培养基可以例如包括市售可得的特定无血清基础培养基(serum-free base medium；SFM)，例如上述的SCGM。基于此无血清基础培养基(例如SCGM)，可加入选定的化学物质和细胞激素以及来自脐带间质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells；UC-MSC)的条件培养基来作为评估。
细胞激素
在细胞扩增实验中，可以使用6种不同的细胞激素(称为“细胞激素*6”或“CTK*6”)。所述6种细胞激素包括重组人类干细胞因子(recombinant human stem cell factor；rh SCF)、重组人类血小板生成素(recombinant human thrombopeietin；rh TPO)、重组人类造血生长因子Fms相关酪氨酸激酶3配体(recombinant human hematopoietic growthfactor Fms-related tyrosine kinase 3ligand；Flt3L)、重组人类第3型白介素(recombinant human interleukin 3；rh IL-3)、重组人类第6型白介素(recombinanthuman interleukin 6；rh IL-6)以及重组人类粒细胞聚落刺激因子(recombinant humangranulocyte colony stimulating factor；rh G-CSF)。
在本发明的一实施例中，所述重组人类干细胞因子的浓度是在20-300ng/ml的范围，较佳为20-100ng/ml，更佳为20-50ng/ml。所述重组人类血小板生成素的浓度是在10-100ng/ml的范围，较佳为20-100ng/ml，更佳为20-50ng/ml。所述重组人类造血生长因子Fms相关酪氨酸激酶3配体的浓度是在50-300ng/ml的范围，较佳为50-100ng/ml，更佳为50-80ng/ml。所述重组人类第3型白介素的浓度是在1-20ng/ml的范围，较佳为5-15ng/ml，更佳为10-15ng/ml。所述重组人类第6型白介素的浓度是在10-100ng/ml的范围，较佳为10-50ng/ml，更佳为10-30ng/ml。所述重组人类粒细胞聚落刺激因子的浓度是在1-100ng/ml的范围，较佳为1-50ng/ml，更佳为1-20ng/ml。
在一个较佳的实施例中，所述重组人类干细胞因子的浓度为20ng/ml。所述重组人类血小板生成素的浓度为20ng/ml。所述重组人类造血生长因子Fms相关酪氨酸激酶3配体的浓度为50ng/ml。所述重组人类第3型白介素的浓度为10ng/ml。所述重组人类第6型白介素的浓度为10ng/ml。所述重组人类粒细胞聚落刺激因子的浓度为1ng/ml。
脐带间质干细胞条件培养基
根据本发明的一些实施例中，所述脐带间质干细胞条件培养基是源自于经培养的人类脐带间质干细胞。在本发明的一实施例中，脐带间质干细胞条件培养基是通过包括以下步骤的方法所制备：(a)在无血清细胞培养基(例如无血清SCGM)中培养人类脐带间质干细胞3-5天；以及(b)分离无血清细胞培养基以获得无血清脐带间质干细胞条件培养基(以下称为“SF-UCM”)。
所得到的SF-UCM可通过以下步骤(c)来进一步浓缩：将所述条件培养基(SF-UCM)运用5千道尔顿至10千道尔顿的阻断性薄膜进行浓缩以得到经浓缩脐带间质干细胞条件培养基(以下称为“con.SF-UCM”或是“c-SF-UCM”)。
在本发明的一实施例中，所述步骤(b)包括在500g和16℃的条件下离心脐带间质干细胞及细胞培养基10分钟，然后收集上清液以获得条件培养基，并将沉淀物丢弃。在一些其它实施例中，上述步骤(c)是用于获得经浓缩脐带间质干细胞条件培养基。举例来说，在步骤(c)中，是将步骤(b)所得到的条件培养基(SF-UCM)通过使用5千道尔顿至10千道尔顿(较佳为5千道尔顿)的阻断性薄膜进行浓缩以获得(按体积)浓缩7-12倍的条件培养基。在一些实施例中，所述脐带间质干细胞条件培养基较佳是在步骤(c)(按体积)浓缩10倍。所述经浓缩条件培养基是使用0.22μm过滤器进行过滤，收集滤液以获得期望的经浓缩脐带间质干细胞条件培养基(c-SF-UCM)。在一些实施例中，所述脐带间质干细胞条件培养基是浓缩至50-200mg/ml的蛋白质浓度，较佳是浓缩至100-150mg/ml。在一个较佳实施例中，c-SF-UCM的蛋白质浓度为100mg/ml。在一些其它实施例中，是将脐带间质干细胞条件培养基进行浓缩，以获得包含分子量大于5千道尔顿的蛋白质成分的条件培养基。
在一个示例性实施例中，通过蛋白质体分析(proteomic analysis)鉴定包括在脐带间质干细胞条件培养基中的蛋白质成分可以例如包括造血干细胞增殖相关蛋白、造血干细胞归巢相关蛋白、免疫调节相关蛋白、神经元发育相关蛋白、代谢过程相关蛋白、细胞组成份相关蛋白、囊泡运输蛋白、SCGM培养基组分和一些其他未注释的组分。举例来说，鉴定出的主要91种蛋白详列于下述表1中，其中，下表并未列出48种SCGM培养基组分和35种未注释组分。
表1：在经浓缩脐带间质干细胞条件培养基中通过蛋白质体分析鉴定出的蛋白质列表
在一些实施例中，所述脐带间质干细胞条件培养基包括选自以下群组中的至少一种的造血干细胞扩增相关蛋白：富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(SPARC)、卵泡抑素相关蛋白1、金属蛋白酶抑制剂1、巨噬细胞聚落刺激因子1受器、骨膜蛋白、半乳糖凝集素1、CD166抗原、远端上游元素结合蛋白1、或是上述的组合。
辅助成分
在本文的一些实施例中，可使用多种补充成分于无血清培养基中，包括维生素C、维生素E、***(E2)以及运铁蛋白(transferrin；TF)。在以前的研究中，已经将维生素C和维生素E作为医学营养疗法提供给成人造血干细胞移植患者，以最小化预处理条件所诱导之毒性(Nutr.Clin.Pract.,October 2012,27:655-660)。
在本文中，术语“维生素C”(Vit.C)是指合成的或天然的L-抗坏血酸(L-ascorbicacid)，其生物可利用的形式或其衍生物。在一实施例中，维生素C的浓度是在50-375μM的范围，较佳为100-300μM，更佳为200-300μM。在一个优选的实施例中，维生素C的浓度为250μM。
在本文中，术语“维生素E”(Vit.E)是指合成的或天然的所有生育酚(tocopherols)(即全部空间形式的α-，β-及γ-生育酚)，其生物可利用的形式或其衍生物。在一实施例中，为了本发明的目的，α-生育酚为较佳。在一实施例中，维生素E的浓度是在2-20μM的范围，较佳为2-15μM，更佳为2-10μM。在一较佳实施例中，维生素E的浓度为2μM。
在一实施例中，***(E2)的浓度是在10-9-10-8M的范围。在一较佳实施例中，***的浓度为10-9M。
在一实施例中，运铁蛋白的浓度是在10-100μg/ml的范围，较佳为10-80μg/ml，更佳为10-50μg/ml。在一较佳实施例中，运铁蛋白的浓度为30μg/ml。
实验例
以下实验例将用于评估可能影响到造血干细胞扩增的各种不同的因素。
实验例1：造血干细胞培养基的评估
为了评估用于造血干细胞(HSC)体外扩增的各种培养基，是使用含有必要细胞激素的IMDM、5％的脐带血清(cord serum；CS)以及饲养层作为对照。两种培养基(SCGM和X-VIVO15)是在不存在血清的情况下(但存在相同的细胞激素和饲养层时)进行测试，以查看它们是否可以被用作为无血清培养基。详细的实验步骤如下。
在第-1天，于T-12.5容器中接种脐带间质干细胞(UC-MSC)，使其在完全培养基(complete culture medium)(含有10％人类脐带血清和DMEM)中作为饲养细胞进行培养。在第0天，将CD34+造血干细胞解冻并与上述UC-MSC饲养细胞在细胞密度为2.5×104细胞/ml下共同培养12天，并配合使用以下不同的培养基：(1)阳性对照组(PC)：含5％脐带血清、6种细胞激素及氢化可体松(hydrocortisone；10-6M)的IMDM；(2)SCGM组：含6种细胞激素及氢化可体松(10-6M)的无血清干细胞生长培养基SCGM；以及，(3)X-VIVO 15组：含有6种细胞激素及氢化可体松(10-6M)的无血清基础培养基X-VIVO15。在12天的培养期间，每4天补充50％的培养基和新制备的UC-MSC饲养细胞，且使细胞(包括CD34+细胞)维持在2.5至5×104细胞/ml的细胞密度。上述所使用的6种细胞激素包括重组人类干细胞因子(rh SCF；20ng/ml)、重组人类血小板生成素(rh TPO；20ng/ml)、重组人类造血生长因子Fms相关酪氨酸激酶3配体(rh Flt3L；50ng/ml)、重组人类第3型白介素(rh IL-3；10ng/ml)、重组人类第6型白介素(rh IL-6；10ng/ml)以及重组人类粒细胞聚落刺激因子(rh G-CSF；1ng/ml)。在第12天，计算累积的总细胞扩增倍数和CD34+(ISHAGE)扩增倍数，实验结果如图1A及图1B所示。CD34+的细胞是根据国际血液治疗和移植工程学会(International Society ofHematotherapy and Graft Engineering；ISHAGE)的准则而进行定量(Sutherland etal.,J.Hematother.,1996,Jun:5(3):213-26)。
如图1A及图1B所示，在所测试的培养基当中，在血清不存在的情况下，SCGM与对照组IMDM相比，其能够更好的支持造血干细胞的扩增，而X-VIVO 15则不太有效。此外，在饲养层存在的情况下，SCGM是一种对于总细胞的扩增有良好功效的无血清培养基，且对于CD34+细胞的扩增更是如此。目前已知大多数的增殖性造血干细胞为CD34+细胞。因此，维持CD34+细胞的扩增能力比起维持总细胞的生长更为重要。基于此，选择SCGM作为本发明的无血清培养基的基础培养基。
如上所述，造血干细胞的体外生长需要各种细胞激素和由其它细胞或组织所贡献的因子。一个假设是，真正的造血干细胞本质上是固定的组织细胞，它们与其它支持的组织/细胞一起存在，并且由这些支持组织/细胞提供的微环境使造血干细胞自我更新，而不分化和成熟。由这方面来说，基质细胞(stromal cell)可提供由细胞激素、细胞外基质蛋白质和黏附分子所传导的广泛的环境信号，其可用以控制造血祖细胞(hematopoieticprogenitor)和干细胞的增殖、存活和分化。因此，在造血干细胞的体外生长中，含有基质细胞的饲养层可用以提供任何这些因子。
然而，使用组织或细胞作为饲养层是不理想的，因其可能引入污染或引起不利的免疫反应。本发明的发明人员经实验发现，来自脐带间质干细胞的条件培养基能够替代饲养层来支持造血干细胞的体外扩增。在后面的例子中将详尽解释支持这些论述的实验。
实验例2：辅助成分的效果评估
本实验例评估了添加4种辅助成分到含有饲养层的培养基的效果。具体实验步骤如下。
在第-1天，于T-12.5容器中接种脐带间质干细胞(UC-MSC)，使其在完全培养基(complete culture medium)(含有10％人类脐带血清和DMEM)中作为饲养细胞进行培养。在第0天，将CD34+造血干细胞解冻并与上述UC-MSC饲养细胞在细胞密度为2.5×104细胞/ml下共同培养12天，并配合使用以下不同的培养基：(1)阳性对照组(PC)：含5％脐带血清、6种细胞激素及氢化可体松的IMDM；(2)SCGM组：含6种细胞激素及氢化可体松的SCGM；以及，(3)SCGM+SP4组：含有6种细胞激素、氢化可体松与4种辅助成分的SCGM。在本实验例中所使用的6种细胞激素及氢化可体松与实验例1中所使用的相同。所述4种辅助成分(也可简称为SP4或辅助成分*4)包括维生素C(250μM)、维生素E(2μM)、***(10-9M)和运铁蛋白(30μg/ml)。在12天的培养期间，每4天补充50％的培养基和新制备的UC-MSC饲养细胞，且使细胞(包括CD34+细胞)维持在2.5-5×104细胞/ml的细胞密度。在第12天，计算累积的总细胞扩增倍数和CD34+(ISHAGE)扩增倍数，实验结果如图2A及图2B所示。
如图2A及图2B所示，在饲养层存在的情况下，这4种辅助成分对总细胞扩增和CD34+细胞的扩增没有任何显著影响。可能的原因是，在饲养层存在的情况下，饲养层所分泌的某些因子与4种辅助成分具有相似的效果。因此，在这些因子存在的基础上，再加入4种辅助成分并无法进一步提高细胞的扩增。
实验例3：运用无血清脐带间质干细胞条件培养基替换饲养层
为了测试饲养层的潜在替代物，我们测试了源自于脐带间质干细胞(UC-MSC)的无血清脐带间质干细胞条件培养基(SF-UCM)的效果。所述无血清脐带间质干细胞条件培养基例如是由上述所提到的方法来制备。所述方法包括以下步骤：(a)在无血清细胞培养基中(例如无血清SCGM)培养脐带间质干细胞；以及(b)分离出所述条件培养基。运用脐带间质干细胞条件培养基替换饲养层的实验结果如图3A及图3B所示。
在图3A及图3B中，阳性对照组(PC)为上述的IMDM。图3A及图3B所示的PC及S1组是通过以下方式进行生长：在第0天，将CD34+造血干细胞解冻并与上述UC-MSC饲养细胞在细胞密度为2.5×104细胞/ml下共同培养12天，并配合使用含有6种细胞激素及氢化可体松的5％脐带血清/IMDM培养基作为阳性对照组(PC)，或是配合使用含有6种细胞激素、氢化可体松与4种辅助成分的SCGM作为S1组。
S3-2组是通过以下方式进行生长：在第0天，将CD34+造血干细胞解冻并与具有50％(v/v)SF-UCM和50％(v/v)新鲜SCGM且包含6种细胞激素、氢化可体松及4种辅助成分的混合培养基(culture medium mixture)在细胞密度为2.5×104细胞/ml下共同培养12天。本实验例所使用的6种细胞激素、氢化可体松及4种辅助成分与实验例2所使用的相同。
在12天的培养期间，每4天补充50％的培养基和新制备的UC-MSC饲养细胞，且使细胞(包括CD34+细胞)维持在2.5至5×104细胞/ml的细胞密度。在第12天，计算累积的总细胞扩增倍数和CD34+(ISHAGE)扩增倍数。
如图3A及图3B的实验结果所示，SF-UCM可以有效取代饲养层，且不会对总细胞的扩增产生明显的影响。此外，SF-UCM也可以替代CD34+细胞扩增中使用的饲养层，尽管其效果略低。基于上述实验结果，SF-UCM是饲养层的良好替代品。
实验例4：比较SF-UCM和浓缩的SF-UCM作为饲养层的替代物
以下实验例将评估用SF-UCM或是浓缩的SF-UCM代替饲养层的效果。在实施例3中所获得的SF-UCM是运用5千道尔顿至10千道尔顿的阻断性薄膜(较佳为5千道尔顿的阻断性薄膜)进行浓缩以得到经10倍浓缩的(按体积)条件培养基。所述经浓缩条件培养基是使用0.22μm过滤器进行过滤，收集滤液以获得期望的经浓缩脐带间质干细胞条件培养基(简称为“c-SF-UCM”)。使用SF-UCM或是c-SF-UCM替代饲养层的实验结果如图4A及图4B所示。
在图4A及图4B中，PC、S1以及S3-2组是与实验例3所述的相同。S3-3组是通过以下方式进行生长：在第0天，将CD34+造血干细胞解冻并与具有5％(v/v)浓缩SF-UCM和95％(v/v)SCGM且包含6种细胞激素、4种辅助成分及氢化可体松的混合培养基在细胞密度为2.5×104细胞/ml下共同培养12天。本实验例所使用的6种细胞激素、氢化可体松及4种辅助成分与实验例2所使用的相同。在培养期间，每4天补充50％的上述各混合培养基，且使细胞(包括CD34+细胞)维持在2.5至10×104细胞/ml的细胞密度。在第12天，计算累积的总细胞扩增倍数和CD34+(ISHAGE)扩增倍数。
如图4A及图4B的实验结果所示，经浓缩的SF-UCM比起SF-UCM更能有效地支持总细胞扩增以及CD34+细胞的扩增。实际上，经浓缩的SF-UCM比使用饲养层还更有效。也就是说，与使用SF-UCM或是饲养层相比，经浓缩的SF-UCM显示出最佳的干细胞扩增。经浓缩的SF-UCM优于饲养层的事实是出人意料的。这些实验结果表明，在较高浓度(与饲养层产生的浓度相比)的条件培养基中的特定因子具有较好的活性。
实验例5：4种辅助成分和浓缩SF-UCM的组合对HSC扩增有较大的改善作用
如上述的实验结果，当同时使用饲养层与4种辅助成分(维生素C、维生素E、***以及运铁蛋白)时，干细胞的扩增效果并没有明显的增强。如实验例4所示，由于浓缩的SF-UCM具有较佳的活性，因此，进一步测试了使用浓缩的SF-UCM(简称为“c-SF-UCM”)配合4种辅助成分的效果。这些测试的实验结果如图5A及5B所示。
在第0天，将CD34+造血干细胞解冻并在以下组别的培养基中进行培养：(1)SCGM+SP+UCM组：具有5％(v/v)c-SF-UCM和95％(v/v)SCGM且包含6种细胞激素、4种辅助成分及氢化可体松的混合培养基；(2)SCGM+SP组：具有6种细胞激素、4种辅助成分及氢化可体松的SCGM；(3)SCGM+UCM组：具有5％(v/v)c-SF-UCM和95％(v/v)SCGM且包含6种细胞激素及氢化可体松的混合培养基；以及(4)SCGM组：具有6种细胞激素及氢化可体松的SCGM。本实验例所使用的6种细胞激素、氢化可体松及4种辅助成分与实验例2所使用的相同。
细胞是在2.5×104细胞/ml的细胞密度下进行培养。在培养期间，每4天补充50-80％的上述各混合培养基，且使细胞(包括CD34+细胞)维持在2.5至10×104细胞/ml的细胞密度。在第12天，计算累积的总细胞扩增倍数和CD34+(ISHAGE)扩增倍数。
图5A及图5B显示了与SCGM组相比，累积的总细胞扩增倍数和CD34+(ISHAGE)扩增倍数。如图5A及图5B所示，在SCGM和6种细胞激素存在的情况下(但在缺乏饲养层的情况下)，4种辅助成分和c-SF-UCM分别可以增强总细胞的扩增和CD34+细胞的扩增。
4种辅助成分可以增强细胞扩增的事实是出乎意料的，且与在饲养层存在下所见的结果相反(参见图2A和图2B)。如上所述，饲养层分泌的某些因子可能具有与4种辅助成分类似的效果。因此，当使用饲养层时，4种辅助成分增强细胞扩增的效果是不明显的，而在使用c-SF-UCM代替饲养层时其效果是明显的。也就是说，当饲养层不存在时，4种辅助成分可以替代缺失的因子，从而产生增强效果。
当在同一培养基中添加4种辅助成分和c-SF-UCM时，累积的总细胞扩增倍数或CD34+细胞扩增倍数会显著的增加。可能的原因是，4种辅助成分与c-SF-UCM中的因子可能有助于细胞扩增途径的不同阶段，从而使它们的组合对造血干细胞的扩增带来很大的改善作用。基于此，4种辅助成分和c-SF-UCM能够以协同的方式一起作用。
实验例6：造血干细胞扩增不影响聚落形成单位(colony forming units；CFU)
干细胞的体外扩增需要对称***，其中两个子细胞保留干细胞的性质。在体外扩增造血干细胞中所遇到的一个问题点是，扩增细胞时可能遇到的分化和成熟。分化的细胞在移植后可能不会发展成所需类型的细胞。
为了检测定型的造血祖细胞(committed hematopoietic progenitors)，是将第0天的未培养的CD34+细胞与第12天的经培养的CD34+细胞以100以及5000细胞/ml的浓度分别接种于35mm培养皿中，并培养于具备细胞激素的MethoCult甲基纤维素培养基(cytokine-supplemented MethoCult methylcellulose medium；Stemcell Technology,Vancouver,Canada)中。在37℃潮湿饱和的环境下，且在20％O2及5％CO2培养14天后，总计的聚落形成单位(CFUs)包括CFU-G，CFU-M，CFU-GM，CFU-E以及BFU-E是使用倒置显微镜(inverted microscope)进行计数。将各组累积的CFU扩增倍数标准化至第0天未培养的CFU总数，并将其显示为相对扩增倍数。
如图6A及图6B所示，累积的CFU扩增倍数平行于累积的CD34+细胞扩增倍数(ISHAGE)，此结果表明了扩增的CD34+细胞会维持其干细胞特性。
实验例7：测试4种辅助成分中各个组分的效果
如上述的实验例所示，在缺乏饲养层的情况下，4种辅助成分增强了本发明培养基中的细胞扩增。为了进一步了解辅助成分的作用，我们研究了每种辅助成分的个别作用。
在本实验例中，PC组和S3-3组与前面的实验例相同。每4天补充50％的培养基，且将细胞维持在2.5至5×104细胞/ml的细胞密度。
其它组别的制备方式如下：在第0天，将CD34+造血干细胞解冻并在以下组别的培养基中进行培养：(1)SP3于UCM组：具有5％(v/v)c-SF-UCM和95％(v/v)SCGM且包含6种细胞激素、3种辅助成分(***E2+维生素C+维生素E)及氢化可体松的混合培养基；(2)SP3于SCGM组：具有6种细胞激素、3种辅助成分(***E2+维生素C+维生素E)及氢化可体松的SCGM；(3)UCM组：具有5％(v/v)c-SF-UCM和95％(v/v)SCGM且包含6种细胞激素及氢化可体松的混合培养基；以及(4)SCGM组：具有6种细胞激素及氢化可体松的SCGM。本实验例所使用的6种细胞激素、氢化可体松及辅助成分与实验例2所使用的相同。细胞是在2.5×104细胞/ml的细胞密度下进行培养。在培养期间，每4天补充80％的上述各混合培养基，且使细胞(包括CD34+细胞)维持在2.5至10×104细胞/ml的细胞密度。在第12天，计算累积的总细胞扩增倍数和CD34+(ISHAGE)扩增倍数。
图7A及图7B显示评估每一个辅助成分对造血干细胞扩增所造成的影响的结果。本实验对每一个辅助成分进行了检测，实验结果发现，运铁蛋白(TF)的使用可以被排除在外。如图7A及图7B所示，剩余的3种辅助成分，维生素C、维生素E和***(E2)在添加时可以增强细胞扩增倍数。相对地，进一步添加运铁蛋白(TF)并不会明显的增强细胞的扩增。
图8A及图8B显示评估维生素C对造血干细胞扩增所造成的影响的结果。实验结果表明，维生素C可以单独支持总细胞的扩增及CD34+细胞的扩增。图9A及图9B显示评估维生素E对造血干细胞扩增所造成的影响的结果。实验结果表明，维生素E也可单独支持总细胞的扩增及CD34+细胞的扩增。图10A及图10B显示评估维生素C及维生素E组合下，对造血干细胞扩增所造成的影响的结果。实验结果表明，维生素C及维生素E的组合在支持细胞扩增的方面也产生了良好的结果。
实验例8：不同数量的培养基补充(medium replenishments)
上述实验例的结果表明，在离体造血干细胞的扩增中，培养基中的血清和饲养层可以用特定的因子及辅助成分来替代。为了进一步研究培养的方式，是将培养程序进行变化。本实验例的条件与上述实验例的条件相同，差别在于，每4天所补充(replenished)的培养基的量被改变。其中一组是每4天补充50％(1：1)的量，而另一组则是每4天补充80％(1：4)的量。实验结果如图11A及11B所示。
从图11A及图11B的实验结果来看，当补充不同量的培养基时，每4天补充产80％的量比每4天补充50％的量得到更好的结果。显然地，细胞将从更新鲜的培养基中受益。
实验例9：造血干细胞扩增所需要的细胞激素
在上述的实验例中，培养基中包括了6种细胞激素：rh SCF、rh TPO、rh Flt3L、rhIL-3、rh IL-6以及rh G-CSF。为了测试所有的细胞激素的必要性，将进行以下实验排除掉一些细胞激素。
在本实验例中，于第-1天，在T-12.5容器中接种脐带间质干细胞(UC-MSC)，使其在完全培养基(complete culture medium)(含有10％人类脐带血清和DMEM)中作为饲养细胞进行培养。在第0天，将CD34+造血干细胞解冻并与上述UC-MSC饲养细胞在细胞密度为2.5×104细胞/ml下共同培养6天，并配合使用2ml的含有3、5或6种细胞激素及氢化可体松的5％CS/IMDM。所述3种细胞激素组(细胞激素*3)包括rh SCF、rh TPO以及rh Flt3L。所述5种细胞激素组(细胞激素*5)包括rh SCF、rh TPO、rh Flt3L、IL-3以及IL-6。所述6种细胞激素组(细胞激素*6)包括rh SCF、rh TPO、rh Flt3L、rh IL-3、rh IL-6以及rh G-CSF。在细胞培养期间，额外3ml的混合培养基被添加。在第6天，计算累积的总细胞扩增倍数和CD34+(ISHAGE)扩增倍数。
QC组：使用COH培养基(15％FBS/Myelocult H5100+IMDM)将造血干细胞(包括CD34+细胞)与COH275饲养细胞共同培养，并配合使用3种细胞激素包括rh SCF、rh TPO以及rhFlt3L。细胞密度为2.5×104细胞/ml。在第3天及第5天加入3ml的混合培养基。实验结果如图12A及12B所示。
从实验结果来看，总细胞的扩增与CD34+细胞的扩增均受益于更多的细胞激素：6种细胞激素>5种细胞激素>3种细胞激素。然而，在总细胞的扩增中，选择更多细胞激素的倾向是明显地，而在CD34+细胞中，此倾向并不太明显。此观察结果表明，在总细胞群中的非CD34+细胞将受益于更多的细胞激素。此现象可以从图13显示CD34+细胞相对于总细胞扩增的相对扩增的结果而得知。在本实验例中，有趣的是，3种细胞激素似乎足以支持CD34+细胞的扩增，而其它多余的细胞激素(在5种细胞激素与6种细胞激素的组别中)似乎对非CD34+细胞有更多益处。而使用其它多余的细胞激素与3种细胞激素相比，其会些微增强CD34+细胞的扩增。
实验例10：扩增后细胞中的红细胞谱系细胞
已知离体的造血干细胞的扩增将产生一些分化细胞和一些定型细胞用于特定谱系。为了检测定型的造血祖细胞(hematopoietic progenitors)，是将第0天的未培养的CD34+细胞与第12天的经培养的CD34+细胞以100以及5000细胞/ml的浓度分别接种于35mm培养皿中，并培养于具备细胞激素的MethoCult甲基纤维素培养基(cytokine-supplemented MethoCult methylcellulose medium；Stemcell Technology,Vancouver,Canada)中。
在37℃潮湿饱和的环境下，且在20％O2及5％CO2培养14天后，总计的聚落形成单位(CFUs)包括CFU-G，CFU-M，CFU-GM，CFU-E以及BFU-E是使用倒置显微镜(invertedmicroscope)进行计数。红细胞谱系CFU的百分比是使用以下公式进行计算：(BFU-E+CFU-E)/(BFU-E+CFU-E+CFU-GM+CFU-G+CFU-M)*100％。上述的简称如下：BFU-E为崩裂形成单位-红细胞(burst-forming unit-erythroid)；CFU-E为聚落形成单位-红细胞(colony-forming unit-erythroid)；CFU-GM为聚落形成单位-粒细胞、巨噬细胞(colony-formingunit-granulocyte,macrophage)；CFU-G为聚落形成单位-粒细胞(colony-forming unit-granulocyte)，而CFU-M为聚落形成单位-巨噬细胞(colony-forming unit-macrophage)。
如图14所示，当与阳性对照组(PC)相比，在本发明的培养基中扩增的细胞将产生更高百分比的红细胞谱系CFU。这些实验结果表明，本发明的培养基可以支持造血干细胞的扩增以产生足够比例的保留有红细胞谱系祖细胞(erythroid-lineage progenitor cell)特性的细胞。然而，当与未培养的细胞相比，在本发明的培养基中扩增的细胞未产生更高比例的红细胞谱系CFU。这些结果暗示，在细胞扩增期间，某些造血干细胞可能分化成其他细胞谱系。
从上述的实验例中，可以得知的是，本发明的无血清培养基能够支持造血干细胞的离体扩增。本发明的方法可以包括在任何本发明的培养基中生长造血干细胞，所述培养基包含基础培养基、细胞激素、特定的辅助成分，以及从培养脐带间质干细胞的无血清培养基所获得的条件培养基。
本发明实施例的优点可以包括以下中的一个或多个。由于培养基中缺乏血清和其他组织(饲养层)，因此，对活性成分和关键成分实施品质控制将更为容易。本发明可以避免潜在的污染或不良的免疫反应，提高细胞治疗产品的安全性，并且容易符合GMP细胞生产的放大制程。
虽然本发明已以实施例揭示如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的更改与润饰，故本发明的保护范围所附权利要求所界定者为准。