体外扩增造血干细胞的生长因子组合物及其应用
阅读说明：本技术 体外扩增造血干细胞的生长因子组合物及其应用 (The growth factor combination of amplifying candidate stem cell in vitro and its application ) 是由 肖业臣 冉秋菊 周佳稔 于 2019-07-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种体外扩增造血干细胞的生长因子组合物,包括：干扰素α、肝素以及白细胞介素12。本发明还公开了一种所述的生长因子组合物在体外扩增造血干细胞中的应用,通过将所述生长因子组合物添加到体外培养造血干细胞的培养液中,可实现快速、有效扩增造血干细胞,可提高体外造血干细胞扩增数量达到7689倍,以解决现有技术中培养效率低下、数量不足的问题。(The invention discloses a kind of growth factor combinations of amplifying candidate stem cell in vitro, comprising: interferon-' alpha ', heparin and interleukin 12.The invention also discloses the applications in the growth factor combination described in one kind in vitro amplifying candidate stem cell, by the way that the growth factor combination is added in the culture solution of in vitro culture candidate stem cell, quick, effective amplifying candidate stem cell can be achieved, Hematopoiesis in Vitro expansion of stem cells quantity can be improved and reach 7689 times, to solve the problems, such as that culture efficiency is low in the prior art, lazy weight.)
技术领域
本发明涉及干细胞培养的技术领域，特别涉及一种体外扩增造血干细胞的生长因子组合物及其应用。
背景技术
骨髓移植，即造血干细胞(HSCs)移植，是目前临床应用最为成熟的干细胞治疗方法，也被认为是唯一能治愈白血病、再生障碍性贫血和淋巴瘤等疾病的治疗手段。迄今为止，HSCs移植都是根据骨髓配型，采集供体骨髓动员后的外周造血干/祖细胞或脐带血直接进行移植，不进行体外培养，同时也存在寻找匹配HSCs困难的问题；另外匹配的供体 HSCs需要供体提供大量的造血干细胞，给供体的生理和心理都造成一定的影响，这也是近年来国内出现的多起造血捐献者临时反悔弃捐的主要原因。如果供体是脐带血，由于脐带血HSCs数量较少，因此需要多份配型合适的脐带血才能满足成年患者需要，给血源的收集带来很大的困难，这也导致了很多关于脐带血保存无用论的观点。基于上述多种因素的存在造成HSCs数量不足的问题，难以满足HSCs移植所需的数量。而体外扩增是在机体外部模拟体内的环境，给予一定的营养和刺激因子促使细胞增殖。通过体外扩增技术提高造血干细胞的数量，同时不降低其自我更新能力，以满足骨髓移植的需要，这也是国内外科学家一直研究的方向。
最初，HSCs体外培养是采用基质细胞作为辅助细胞，基质细胞可以分泌大量的生长因子或者细胞因子，而这些生长因子也是促进HSCs增殖的关键因素。多年以来，发现促进HSCs增殖的细胞因子一直是国内外科学家研究HSCs的重点课题，现也已有多个细胞因子和活性物质被报道能在体外促进HSCs增殖或/和自我更新。从目前国内外的文献来看，干细胞生长因子(SCF)、白介素3(IL3)和白介素6(IL6)通常是体外培养小鼠和人造血干细胞必须添加的3种细胞因子，而不同的实验室或研究者可能选择成纤维细胞生长因子(FGF1或FGF2)[de Haan，G.，E，2003；Yeoh JS，R，2006]、***(IGF2)[Zhang CC，2004]、血小板生成素(TPO)[Sauvageau G，2004；Ko KH，2011]、红细胞生成素(EPO)、Fms样酪氨酸激酶受体3的配体(Fltl3)[Purton LE，2000；Ko KH，2011]、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)等细胞因子中的一种或多种添加到细胞培养液中，用于HSCs体外增殖。目前，采用单一或者多种细胞因子进行体外培养造血干细胞，一定程度上可增加造血干细胞的增殖，但是多种细胞因子共同培养造血干细胞时，不同的成分可能存在拮抗或者具有同种功能生长因子和细胞因子的共同存在，导致体外培养效率低下或存在获得性细胞缺陷等问题，很难应用于科学研究或产业化生产，比如：人脐带血CD34+细胞在体外用IL-3、IL-6及SCF培养或者IL-11、SCF及FL 培养6天后，扩增的细胞由于改变了VLA-4和VLA-5的表达，而干扰了骨髓归巢导致扩增的HSCS一致性能较差[zhai qiongli，2004]，导致很难应用于临床，仍不能解决造血干细胞数量不足的问题。目前，多种细胞因子的存在也是各自发挥作用，扩增效率比较差。因此，如何设计一种不同细胞因子组合物才能达到最佳的扩增效果，以满足目前造血干细胞扩增效率低、数量不足的问题很有必要。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种体外扩增造血干细胞的组合物，通过使用该组合的生长因子及活性物质能在体外快速、有效扩增造血干细胞，可提高体外造血干细胞扩增数量并保证其自我更新能力。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种体外扩增造血干细胞的生长因子组合物，包括：干扰素α、肝素以及白细胞介素12。
优选的是，还包括：干细胞生长因子、白介素3、血小板生成素、Fms样酪氨酸激酶受体3的配体和***。
本发明还提供一种所述的生长因子组合物在体外扩增造血干细胞中的应用，所述应用为将含10％血清的DMEM培养液与生长因子组合物混合体外扩增造血干细胞。
优选的是，所述生长因子包含干扰素α、肝素、白细胞介素12、干细胞生长因子、白介素3、血小板生成素、Fms样酪氨酸激酶受体3的配体以及***。
优选的是，所述干扰素α、肝素、白细胞介素12、干细胞生长因子、白介素3、血小板生成素、Fms样酪氨酸激酶受体3的配体以及***2(IGF2)的添加浓度分别为1-100ng/ml。
优选的是，所述干扰素α添加浓度为50ng/ml、所述肝素添加浓度为10ug/ml、所述白细胞介素12添加浓度为10ng/ml、所述干细胞生长因子添加浓度为100ng/mL、所述白介素3添加浓度为100ng/mL、所述血小板生成素添加浓度为100ng/mL、所述Fms样酪氨酸激酶受体3的配体添加浓度100ng/ml以及所述***的添加浓度为10ng/ml。
优选的是，所述体外扩增造血干细胞获自小鼠或人的骨髓或脐带血造血干细胞样品。
优选的是，所述体外扩增造血干细胞的条件为：37℃、5％二氧化碳条件下培养14-21 天。
本发明至少包括以下有益效果：
本发明公开的生长因子组合物中包含的白介素12(IL12)是促进TH1反应的重要调节因子，能促使TH0细胞向TH1细胞分化，抑制其向TH2细胞分化，而干扰素(IFN) 是TH1类细胞因子主要分泌物之一，通过IL12与IFNα同时作用可促进Th0细胞内IL12 受体mRNA的表达，也就增加了IL12与IL12受体的结合几率；另外，IL12还可逆转变应原对IL12受体mRNA的抑制，同样增加IL-12与IL-12R的结合，因此，IL12与IFN α同时添加共同体外培养造血干细胞，利于增强组织相容抗原和外周血单核细胞表面FC 受体的表达。肝素(heparin)是一种含硫酸基团的粘多糖，可加强抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)灭活丝氨酸蛋白酶，从而具有阻止凝血酶形成，对抗凝血酶和阻止血小板聚集等多种作用，通过肝素与IL-12及IL-12R的混合，可阻止体外扩增后的造血干细胞的凝结，大大提高扩增效率。另外造血干/祖细胞本身可以自分泌或旁分泌FGF等生长因子，而肝素能促进FGF 与造血干细胞表面的FGF受体结合，激活AKT和ERK等信号通路促进细胞增殖。本申请通过生长因子组合物IL-12、IFNα及heparin的添加，再结合其他一些细胞因子及体外扩增培养基，可使体外扩增小鼠/人源造血干细胞扩增7689倍，相对现有技术，可快速通过体外扩增技术获得大量造血干细胞，有利于应用于科学研究或者产业化生产上，为现代医学通过体外扩增造血干细胞进行骨髓移植奠定基础。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明不同生长因子的筛选结果；
图2为本发明添加不同浓度生长因子时CD117+小鼠造血干细胞扩增数；
图3为本发明添加不同浓度生长因子时CD117+小鼠造血干细胞扩增效率；
图4为本发明检测CD117+小鼠造血干细胞在不同生长因子组合物中生成集落(CFU) 的潜能；
图5为本发明人脐带血细胞在不同生长因子组合物中造血干细胞的增殖数量。
具体实施方式
下面对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
本发明提供一种体外扩增造血干细胞的生长因子组合物，包括：干扰素α、肝素以及白细胞介素12。
一个优选方案中，还包括：干细胞生长因子、白介素3、血小板生成素、Fms样酪氨酸激酶受体3的配体和***。
本发明还提供一种所述的生长因子组合物在体外扩增造血干细胞中的应用，其特征在于，所述应用为将含10％血清的DMEM培养液与生长因子组合物混合体外扩增造血干细胞。
一个优选方案中，所述生长因子包含干扰素α、肝素、白细胞介素12、干细胞生长因子、白介素3、血小板生成素、Fms样酪氨酸激酶受体3的配体以及***。
一个优选方案中，所述干扰素α、肝素、白细胞介素12、干细胞生长因子、白介素3、血小板生成素、Fms样酪氨酸激酶受体3的配体以及***的添加浓度分别为1-100ng/ml。
一个优选方案中，所述干扰素α添加浓度为50ng/ml、所述肝素添加浓度为10ug/ml、所述白细胞介素12添加浓度为10ng/ml、所述干细胞生长因子添加浓度为100ng/mL、所述白介素3添加浓度为100ng/mL、所述血小板生成素添加浓度为100ng/mL、所述Fms样酪氨酸激酶受体3的配体添加浓度100ng/ml以及所述***的添加浓度为 10ng/ml。
一个优选方案中，所述体外扩增造血干细胞获自人的骨髓或脐带血造血干细胞样品及小鼠等其它哺乳动物的造血干细胞。
一个优选方案中，所述体外扩增造血干细胞的条件为：37℃、5％二氧化碳条件下培养14-21天。
干扰素α(IFNα)，它是一种可溶性的物质，可增强组织相容抗原和外周血单核细胞表面FC受体的表达，抑制淋巴细胞的增殖，增强巨噬细胞的细胞毒活性，调节免疫自身稳定功能等。
肝素(heparin)是一种含硫酸基团的粘多糖，可促进FGF与FGFR的结合，还能加强抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)灭活丝氨酸蛋白酶，从而具有阻止凝血酶形成，对抗凝血酶和阻止血小板聚集等多种作用。
白细胞介素12(IL12)是一种异源二聚体细胞因子，被认为是细胞免疫应答过程中的关键调节因子。
干细胞生长因子(SCF)是一种具有刺激自体内源性干细胞生长的蛋白质和酶的组合，是早期造血干细胞/祖细胞的刺激因子，在维持造血细胞存活，促进造血细胞增殖和分化，调控造血细胞的生长发育中起着重要作用。
白介素3(IL3)是白细胞介素家族重要成员之一，是一种由T淋巴细胞所产的糖蛋白，能够刺激参与免疫反应的细胞增殖、分化并提高其功能。
血小板生成素素(TPO)是包含834个氨基酸的糖基化的多肽链，生理调节造血祖细胞演化成成熟巨核细胞增殖和分化。
Fms样酪氨酸激酶受体3的配体(Fltl3))是一种与造血调控有关的早期造血生长因子，可与多种细胞因子协同作用。Flt3的配体与Flt3结合后能够调节原始造血干细胞/祖细胞增殖和分化，动员和刺激髓系及淋巴祖细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞和自然杀伤树突状细胞增殖和分化，是树突状细胞最为重要的生长因子。
***(IGFs)一类多功能细胞增殖调控因子，现已发现的包括IGF-1和 IGF-2两种，本申请用的IGF2可以促进造血干细胞的增殖率。
1、对象
动物源细胞：获自小鼠CD117+干/祖细胞；
人源细胞：获自未患血液病的骨髓、脐带血造血干细胞样品(来自产妇脐带血，有产妇知情书)。
2、试验方法
2.1获取小鼠CD117+干/祖细胞，包括以下的步骤：
1)采取CO2窒息法处死小鼠；
2)将小鼠固定于解剖板上，直接将75％乙醇喷于小鼠表面消毒；
3)将消毒处理过的小鼠转移至生物安全柜中；
4)将小鼠后腿部皮肤减去，露出小鼠腿部，在小鼠脚踝处分离鼠足；
5)剪断小鼠膝关节后的筋膜和肌肉，用镊子固定住膝关节，向关节方向折断股骨近膝关节。向下推肌肉组织至骨盆处，将整条股骨暴露并剪断；
6)用镊子固定膝关节，反方向折断胫骨近膝关节处，向下推肌肉组织取下胫骨；
7)将小鼠股骨和胫骨置于有3ml无菌PBS的6孔板中；
8)用1ml注射器吸取浸泡股骨和胫骨的PBS向两端开口的骨中冲出骨髓，反复几次直至骨头冲洗发白为止，然后用注射器将冲出的冲洗液吹散细胞；
9)将70μm滤器放置50ml离心管上，往滤器中加入步骤8所得的细胞悬液，1200RPM离心10min；
10)将骨髓细胞转移至无菌的5mL无菌流式细胞管中，通过离心浓缩体积至为200μL，然后加入PE标记的抗CD117抗体，后续操作程序详见试剂盒说明书(EasySepTM MouseCD117(cKIT)Positive Selection kit,STEMCELL)，用磁珠分选法得到CD117+小鼠造血干细胞。
2.2 CD117+小鼠造血干细胞体外增殖
2.2.1探究不同生长因子最佳组合物
取7000个上述2.1获得的CD117+小鼠造血干细胞种植在含有10％血清的DMEM培养液(HyClone-DMEM/HIGH GLUCOSE)的96孔板(圆底)中，每孔中DMEM培养液 (含10％血清)用量为200μL，根据实验需要，添加不同组合的生长因子，每种组合设5 个重复孔，于37℃、5％CO2的条件体外培养14-21d后，收集培养产物中的细胞，计算细胞总数。
流式仪细胞分析各细胞群百分数，具体步骤如下：上述每个样品加入4uL含有如下流式抗体的抗体混合液，室温或4度染色30min，然后加入PBS缓冲液清洗1-2次，再加入200ul PBS缓冲液，流式细胞仪检测(BD AccuriTM C6 Flow Cytometer,BD)。
其中，流式抗体无特殊说明，均购自eBioscience公司，其中Lin包含FITC标记的CD11b、Gr-1、TER-119、CD3、CD4、CD8、B220和CD41；APC标记的c-Kit和PE-cy5.5 标记的Sca-1。
PBS缓冲液的配制：称取NaCl 8g、KCL0.2g、Na2HPO4·12H2PO4 0.24g溶于900mL 双蒸水中，用盐酸调pH值至7.4，加水定容至1L，常温保存备用。上述无菌PBS获自配制好的PBS缓冲液于121℃，高压灭菌20-30min。
上述添加不同组合的生长因子的方法步骤：(INFα为10ng/ml，heparin浓度为20ug/ml，其他各种因子的添加浓度为50ng/mL)
以含有10％血清的DMEM培养液+SCF作为培养单核CD117+细胞的对照，分别添加IL3、IL6、INFα、EPO、TPO、heparin、成纤维细胞生长因子1(FGF1)、成纤维细胞生长因子2(FGF2)、成纤维细胞生长因子9(FGF9)以及成纤维细胞生长因子18(FGF18)，获取扩增效率最高的生长因子，命名为A。
1、在上述筛选结果的基础上，以含有10％血清的DMEM培养液+SCF+A作为培养单核CD117+细胞的对照，分别添加Fltl3、IGF2、肝细胞生长因子(HGF)、TPO、IL12、基质细胞衍生因子1(SDF1)、表皮生长因子(EGF)、生长抑制特异性基因产物6(Gas6)、 EPO以及M-CSF，获取扩增效率最高的生长因子，命名为B。
2、在1筛选结果的基础上，以含有10％血清的DMEM培养液+SCF+A+B作为培养单核CD117+细胞的对照，分别添加INFα、IGF2、EGF、IL12、FGF1、FGF2、FGF9、 FGF18以及血小板衍生因子(PDGF)，获取扩增效率最高的生长因子，命名为C。
3、在2筛选结果的基础上，以含有10％血清的DMEM培养液+SCF+A+B+C作为培养单核CD117+细胞的对照，分别添加IL7、heparin、SDF1以及成纤维细胞生长因子 21(FGF21)，获取扩增效率最高的生长因子，命名为D。
4、在3筛选结果的基础上，以含有10％血清的DMEM培养液+SCF+A+B+C+D作为培养单核CD117+细胞的对照，分别添加IL6、IGF2、IL12、EPO、HGF以及Fltl3，获取扩增效率最高的生长因子，命名为E。
5、在4筛选结果的基础上，以含有10％血清的DMEM培养液+SCF+A+B+C+D+E作为培养单核CD117+细胞的对照，分别添加骨形成发生蛋白2(BMP2)、IGF2、Fltl3、Wnt3a、SDF1以及EPO，获取扩增效率最高的生长因子，命名为F。
6、在5筛选结果的基础上，以含有10％血清的DMEM培养液+SCF+A+B+C+D+E+F 作为培养单核CD117+细胞的对照，分别添加IGF2、EPO、Wnt3a以及SDF1，获取扩增效率最高的生长因子，命名为G。
7、在6筛选结果的基础上，以含有10％血清的DMEM培养液 +SCF+A+B+C+D+E+F+G作为培养单核CD117+细胞的对照，分别添加EPO、Wnt3a以及 SDF1，获取促进单核CD117+细胞扩增的生长因子的组合物(以所添加的每种生长因子均抑制或者与对照起到相同的效果时为判断获取组合物的标准)。
2.2.2探究最佳组合物中不同生长因子的最佳浓度
在2.2.1探究得到的最佳的生长因子组合的基础上，取7000个上述2.1得到CD117+小鼠造血干细胞，在含有10％血清的DMEM培养液的96孔板(圆底)中，每孔中DMEM 培养液(含10％血清)用量为200μL，根据实验需要，添加不同浓度的最佳组合物中的生长因子以及生长因子组合物，其中单一生长因子的添加浓度为：SCF、IL3、TPO、Fltl3、 IGF2、INFα以及IL12添加浓度分别采用1ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL，heparin 添加量为1μg/mL、10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL。
生长因子组合物的组合方式及其各生长因子的浓度如下所示：组合物Z1包含SCF100ng/mL、IL3 100ng/mL和TPO 100ng/mL；组合物Z2包含SCF 100ng/mL、IL3 100ng/mL、TPO 100ng/mL和INFα50ng/mL；组合物Z3包括SCF 100ng/mL、IL3 100ng/mL、TPO 100ng/mL、INFα50ng/mL、heparin10ug/ml和Fltl3 100ng/mL；组合物Z4包括SCF 100ng/mL、IL3100ng/mL、F1t3L 100ng/ml、heparin 10ug/ml和IGF2 10ng/ml；组合物Z5 包括SCF 100ng/mL、IL3 100ng/mL、F1t3L 100ng/ml、heparin 10ug/ml、IGF2 10ng/ml和 INFα50ng/ml；组合物Z6包括SCF 100ng/mL、IL3 100ng/mL、TPO 100ng/mL、INFα 50ng/mL、F1t3L 100ng/ml、heparin 10ug/ml、IGF2 10ng/ml和IL12 10ng/ml)，每种组合设5个重复孔，体外培养14-21d后，收集细胞，计算细胞总数，同时以添加SCF100ng/mL 和IL3100ng/mL的组合物培养的CD117+小鼠造血干细胞为对照。流式细胞仪分析各细胞群百分数，具体步骤参照2.2.1所示。
2.2.3检测CD117+小鼠造血干细胞生成集落(CFU)的潜能
采用甲基纤维半固体培养法培养CD117+小鼠造血干细胞。取10000个上述2.1获得CD117+小鼠造血干细胞种植于甲基纤维半固体培养基中，根据实验要求，添加不同生长因子组合，每种组合设3个重复，进行集落形成试验。
具体步骤如下：将得到的细胞重悬，台盼蓝染色计数，取10000个细胞与甲基纤维半固体培养基混合，对照组为甲基纤维半固体培养基，在甲基纤维半固体培养基分别加入以下组合物：组合物F1包括SCF 100ng/mL、IL3 100ng/mL和TPO 100ng/mL；组合物F2 包括SCF 100ng/mL、IL3 100ng/mL、TPO 100ng/mL和INFα50ng/mL；组合物F3包括 SCF 100ng/mL、IL3 100ng/mL、TPO 100ng/mL、INFα50ng/mL、heparin10ug/ml；组合物 F4包括SCF100ng/mL、IL3 100ng/mL、TPO 100ng/mL、F1t3L 100ng/ml、heparin 10ug/ml 和IGF210ng/ml；组合物F5包括SCF 100ng/mL、IL3 100ng/mL、TPO 100ng/mL、F1t3L 100ng/ml、heparin 10ug/ml、IGF2 10ng/ml和INFα50ng/ml；组合物F6包括SCF 100ng/mL、 IL3100ng/mL、TPO 100ng/mL、F1t3L 100ng/ml、heparin 10ug/ml、IGF2 10ng/ml、INFα 50ng/ml和IL12 10ng/ml；然后分别置于37℃、5％CO2条件下培养14-21天后，检测CD117+ 小鼠造血干细胞在甲基纤维半固体培养基中集落的数量。
2.3人源造血干细胞在不同生长因子组合中体外扩增
2.3.1获取人源细胞，包含以下方法步骤：
(1)拿到无血液病的骨髓或脐带血造血干细胞样品后，用3ml塑料吸管将样品吸到50ml离心管中，加PBS缓冲液至50ml，1200RPM离心5min。
(2)弃上清，根据红细胞裂解液(Solarbio)说明书加入相应体积红细胞裂解液，4℃裂解10min，1200RPM离心5min。
(3)弃上清，重复步骤2，直至将红细胞裂解完全。
2.3.2人源造血干细胞体外增殖
根据上述方法得到人源细胞，取50000个细胞种植在含有10％血清的DMEM培养液的24孔板中，根据实验要求，添加2.2.1获取的最佳生长因子及其组合物，在37℃、5％CO2条件下体外培养14-21天，每2d流式细胞仪分析CD34+细胞率。采用流式细胞仪检测方法，具体步骤参照2.2.1所示。
3、统计学分析
所有的实验数据均采用GraphPad Prism Version 5.04的Student t检验，数据将用 Means±SEM，P<0.05被视为有统计学意义。
结果
1、不同生长因子最佳组合物
1.1添加不同组合的生长因子的CD117+造血干细胞培养结果
1、以含有10％血清的DMEM培养液+SCF作为培养单核CD117+细胞的对照，结果显示：相比对照，添加生长因子IL3、IL6、INFα、TPO、heparin后，细胞总数分别扩增 17.5倍、9倍、8.5倍、7.5倍以及10.5倍，其余生长因子均与对照效果一样，如图1a所示。
2、以含有10％血清的DMEM培养液+SCF+IL3作为培养单核CD117+细胞的对照，结果显示：相比对照，添加Fltl3、IGF2、HGF、TPO、IL12、SDF1以及EPO后，细胞总数分别扩增10.5倍、11.5倍、13.5倍、17倍、16倍、11倍以及9.5倍，其余生长因子均与对照效果一样，如图1b所示。
3、以含有10％血清的DMEM培养液+SCF+IL3+TPO作为培养单核CD117+细胞的对照，分别添加INFα、IGF2、EGF、FGF1、FGF2、FGF9、FGF18以及PDGF，结果显示：相比对照，添加INFα、EGF、FGF2、FGF9以及PDGF，细胞总数分别扩增6.5倍、5.25 倍、5.75倍、6倍以及5.35倍，其余生长因子抑制扩增或与对照效果一样，如图1c所示。
4、以含有10％血清的DMEM培养液+SCF+IL3+TPO+INFα作为培养单核CD117+细胞的对照，分别添加IL7、heparin、SDF1以及FGF21，结果显示，相比对照，添加heparin 和SDF1细胞总数分别扩增6倍和5.4倍，其余生长因子与对照效果一样，如图1d所示。
5、以含有10％血清的DMEM培养液+SCF+IL3+TPO+INFα+heparin作为培养单核CD117+细胞的对照，分别添加IL6、IGF2、IL12、EPO、HGF以及Fltl3，结果显示，相比对照，添加IL12和Fltl3细胞总数分别扩增14.5倍和9倍，其余生长因子与对照效果一样，如图1e所示。
6、以含有10％血清的DMEM培养液+SCF+IL3+TPO+INFα+heparin+IL12作为培养单核CD117+细胞的对照，分别添加BMP2、IGF2、Fltl3、Wnt3a、SDF1以及EPO，结果显示，相比对照，添加IGF2、Fltl3、Wnt3a、SDF1以及EPO细胞总数分别扩增6.5倍、10.1 倍、7.5倍、6.1倍和6倍，添加BMP2效果和对照类似，如图1f所示。
7、以含有10％血清的DMEM培养液+SCF+IL3+TPO+INFα+heparin+IL12+Fltl3作为培养单核CD117+细胞的对照，分别添加IGF2、EPO、Wnt3a以及SDF1，结果显示，相 比对照，添加IGF2、Wnt3a以及SDF1细胞总数分别7倍、5.9倍以及5.9倍，添加EPO 与对照类似，如图1g所示。
8、以含有10％血清的DMEM培养液+SCF+IL3+TPO+INFα+heparin+IL12+Fltl3+IGF2作为培养单核CD117+细胞的对照，分别添加EPO、Wnt3a以及SDF1，结果显示，相比 对照，添加SDF1效果类似，其他两种抑制扩增，如图1h所示。
通过20多种的细胞因子的筛选过程分析，生长因子在体外培养单核CD117+细胞时是相互作用的，比如：在上述2或者6中，当培养基为含有10％血清的DMEM培养液+SCF+IL3或者含有10％血清的DMEM培养液+SCF+IL3+INFα+heparin+IL12+Fltl3时，添加EPO能提高细胞总数的扩增效率，而在上述的4、5、7、8中添加EPO却抑制细胞扩增，说明IL12 与EPO具有协同促进扩增作用，而Fltl3或者Fltl3+IGF2组合均能抑制EPO调控红细胞生成的活性。又如：上述3所用培养基基础上添加IL12后抑制扩增，而2或5在所使用的培养基基础上添加IL12分别能提高细胞总数的扩增，说明在1使用的培养基基础上，单独添加IL3可促进IL12的活性提高扩增效率，但是IL3+TPO同时加入1所使用的培养基时，则会抑制IL12活性从而抑制细胞扩增；另外，在1所使用培养基的基础上IL3+TPO 后，再加入INFα+heparin又能刺激IL12的活性提高细胞扩增效率，因此体外扩增过程中每种生长因子并不是单独的发挥作用，而是通过多种生长因子的协同作用共同提高体外扩增造血干细胞的扩增效率，也就是，体外扩增培养液中加入生长因子的种类很关键。本申请发明人通过多种生长因子的筛选，能够促进CD117+小鼠造血干细胞扩增的生长因子包括：SCF、IL3、TPO、FLTL3、IGF2、heparin、INFα以及IL12。
当同时添加8种生长因子时，CD117+小鼠造血干细胞扩增效率最高(如图2所示)，经流式细胞仪检测，总单核细胞可达到21358300个，造血干细胞所占的比例1.26％，总造血干细胞的数量达到269115个，以此得出扩增了7689倍。现有技术中，添加不同的生长因子组合物后，培养14天能提高3139倍，造血干细胞达到109881个，而本申请培养 14-21天后能扩增7689倍。
1、不同生长因子最佳组合物的最佳浓度
当SCF、IL3、TPO、Fltl3、IGF2、INFα以及IL12添加浓度分别采用1ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL，heparin添加量为1μg/mL、10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL，结果显示：仅添加SCF时，四个添加浓度体外扩增均不太明显，但相对添加100ng/mL时细胞总数较多；添加SCF100ng/mL时，IL3添加浓度为100ng/mL扩增比率达到1倍，为参照更为准确和方便，因此，选用SCF+IL3分别为100ng/mL时的扩增比率为对照。
由图3分析得知，含有10％血清的DMEM培养液中添加SCF和IL3后为培养CD117+ 小鼠造血干细胞的对照，TPO最佳添加浓度为100ng/mL，Fltl3最佳添加浓度为100ng/mL，IGF2最佳添加浓度为10ng/mL，heparin最佳添加浓度为10μg/mL，IL12最佳添加浓度为10ng/mL，INFα最佳添加浓度为50ng/mL。
在单独添加最佳组合物中不同生长因子中所优选出的最佳浓度的基础上，进行不同组合即：组合物Z1-组合物Z6，发现组合物的添加相比单独添加最佳组合物中任何一种生长因子时的扩增效率均提高；从表1中分析，组合物Z1-组合物Z6不同的组合形式扩增比率不同，Z6表现出最佳的扩增比率，是对照的7689倍。即：当同时添加SCF 100ng/mL、 IL3100ng/mL、TPO 100ng/mL、INFα50ng/mL、F1t3L 100ng/ml、heparin 10ug/ml、IGF2 10ng/ml和IL12 10ng/ml时，可获得最高的扩增比率，可见，本发明以最佳的生长因子组合物及其相应浓度下，能有效提高造血干细胞的体外增殖率。
表1 不同生长因子组合物的体外扩增造血干细胞
2、检测CD117+小鼠造血干细胞生成集落(CFU)的潜能
由图4分析可得知，不同的生长因子组合物相比对照均呈现不同程度增多了造血细胞集落，并且在含有图2、图3结果显示的最佳生长因子组合和浓度，即SCF 100ng/mL、IL3100ng/mL、TPO 100ng/mL、F1t3L 100ng/ml、heparin 10ug/ml、IGF2 10ng/ml、INFα50ng/ml和IL12 10ng/ml)的甲基纤维半固体培养基中造血集落形成的数量最多，再次证明所选生长因子均能提高体外造血干细胞的扩增效率，但是仅在8种生长因子同时添加并在最佳的浓度下培养造血干细胞，才能协同表现出最佳的集落潜能；F6造血集落形成的数量最多，是对照的6.5倍。
3、人源细胞在不同生长因子组合中造血干细胞的增殖数量
由图5分析可得知，不同的生长因子组合物相比对照均呈现不同程度增多了造血细胞数量，并且在含有图2、图3结果显示的最佳生长因子组合和浓度(即：SCF 100ng/mL、IL3 100ng/mL、TPO 100ng/mL、INFα50ng/mL、F1t3L 100ng/ml、heparin 10ug/ml、IGF210ng/ml和IL12 10ng/ml)的培养条件下造血干细胞的数量最多，再次证明所选生长因子均能提高体外造血干细胞的扩增效率，但是仅在8种生长因子同时添加并在最佳的浓度下培养造血干细胞，才能协同表现出最佳的增殖效率。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与附图。