一种具有信号放大效应的可视化检测爆炸物分子的生物传感器及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种具有信号放大效应的可视化检测爆炸物分子的生物传感器及其制备方法和应用 (Biosensor with signal amplification effect and capable of visually detecting explosive molecules and preparation method and application of biosensor ) 是由 杨建明 李美洁 吕书喆 汤若昊 王兆宝 梁波 于 2021-07-05 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种具有信号放大效应的可视化检测爆炸物分子的生物传感器及其制备方法和应用。所述生物感应器的宿主为大肠杆菌,包含如SEQ ID NO.1所示的yqjfC55启动子,能够启动T7 RNA Polymerase的表达,从而激活由T7启动子所启动的甲羟戊酸途径和番茄红素合成途径基因的表达,从而合成肉眼可见的番茄红素。本发明的生物传感器能够感应低浓度的爆炸物分子浓度,将爆炸物分子浓度与番茄红素产量进行偶联,实现爆炸物分子的可视化检测,这种检测操作简单、方便、安全性高。(The invention discloses a biosensor with a signal amplification effect and capable of visually detecting explosive molecules, and a preparation method and application thereof. The host of the biosensor is escherichia coli, comprises a yqjfC55 promoter shown as SEQ ID NO.1, and can start the expression of T7RNA Polymerase, so that the expression of mevalonate pathway and lycopene synthesis pathway genes started by a T7 promoter is activated, and lycopene can be synthesized to be visible to the naked eye. The biosensor can sense the concentration of explosive molecules with low concentration, couple the concentration of the explosive molecules with the yield of lycopene and realize the visual detection of the explosive molecules, and the detection is simple and convenient to operate and high in safety.)
技术领域
本发明属于基因工程和分子生物学
技术领域
，具体涉及一种具有信号放大效应的可视化检测爆炸物分子的生物传感器及其制备方法和应用。背景技术
战区残留爆炸物（例如地雷等）对生命安全和生态系统都造成了不可修复的损伤，因此对地雷进行安全有效的检测具有重要的战略意义。生物传感器可以感应特定化合物后，发生可以被检测的变化，从而达到对特定化合物进行检测的目的。通过生物传感器对残留地雷进行检测是一种有效的手段。
爆炸物（例如地雷）的有效成份为TNT，TNT可分解为多种化合物，如1,3-二硝基苯（1,3-DNB）和2,4-二硝基甲苯（2,4-DNT）。以色列科学家Shimshon Belkin对爆炸物分子2,4-DNT的感应元件，即yqjFC55启动子，利用GFP基因作为报告元件，构建了检测2,4-DNT的生物感应系统。此生物感应系统以GFP作为报告元件，在野外进行爆炸物探测时，需使用仪器进行特定波长的紫外激发，以及绿色荧光信号的收集和分析。但野外情况较为复杂，多种非GFP物质都能在紫外激发下发出绿色荧光，从而产生干扰信号；而且产生的绿色荧光需要在一定的距离范围内进行收集，否则荧光发生散射，距离越远，信号越弱，而对于爆炸物分子，远距离检测是基本的要求，较近距离的检测会增加检测人员的危险性。
因此，目前需要一种能够快速、简单安全检测爆炸物分子的生物传感器。
发明内容
为了实现爆炸物分子的可视化检测，本发明提供了一种具有信号放大效应的可视化检测爆炸物分子的生物传感器的制备方法，以及制备得到的生物传感器及其在爆炸物分子的可视化检测中的应用。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明提供了一种具有信号放大效应的可视化检测爆炸物分子的生物传感器的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
（1）IspA基因片段经扩增、纯化回收，pACYC-MvaE-MvaS质粒利用Bgl II和Nde I双酶切、纯化回收后，将质粒酶切片段与IspA基因片段进行无缝连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，于含抗生素的LB 固体平板上筛选阳性克隆，得到重组质粒pACYC-mvaE-mvaS-IspA；
（2）分别扩增启动子yqjfC55、T7 RNA Polymerase基因以及pACYC-mvaE-mvaS-IspA载体片段，然后将三者扩增产物进行无缝连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，于含抗生素的LB 固体平板上筛选阳性克隆，得到重组质粒pACYC-mvaE-mvaS-IspA-yqjfC55-T7RNAP；
（3）将重组质粒pACYC-mvaE-mvaS-IspA-yqjfC55-T7RNAP、甲羟戊酸途径下游表达载体和番茄红素合成基因质粒共转化大肠杆菌感受态细胞，于含抗生素的LB固体平板上筛选到阳性克隆，获得工程菌株XLYC3，即为生物传感器。
进一步的，所述启动子yqjfC55来源于大肠杆菌Escherichia coli，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步的，所述T7 RNA Polymerase基因来源于大肠杆菌Escherichia coli。
进一步的，所述T7 RNA Polymerase基因具有下列核苷酸序列之一：
（1）SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列；
（2）与SEQ ID NO.6所示核苷酸序列具有90%以上同源性的，且能够编码T7 RNAPolymerase的核苷酸序列。
进一步的，所述启动子yqjfC55能够启动T7 RNA Polymerase基因的转录。
进一步的，所述重组质粒pACYC-mvaE-mvaS-IspA-yqjfC55-T7RNAP能够外源表达乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE、3-羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS以及法呢基/香叶基焦磷酸合酶IspA。
进一步的，所述甲羟戊酸途径下游表达载体为ptrc-low，能够外源表达甲羟戊酸激酶基因ERG12，磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8，甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19和异戊烯焦磷酸异构酶基因IDII。
进一步的，所述番茄红素合成基因质粒为pET-lyc，能够表达番茄红素所需要的香叶基香叶基焦磷酸合成酶基因crtE，八氢番茄红素合成酶基因crtB和八氢番茄红素去饱和酶基因crtI。
进一步的，所述宿主为大肠杆菌Escherichia coli Bl21。
本发明还提供了所述的制备方法制备得到的生物传感器。
本发明还提供了所述的生物传感器在用于爆炸物分子的可视化检测中的应用。
进一步的，所述生物传感器的使用方法为：将生物感应器培养活化后，加入待测样品后继续培养，观察培养液颜色变化；若培养液不呈现红色，则说明待测样品中不存在爆炸物分子，若培养液呈现红色，则说明待测样品中具有爆炸物分子，并且培养液红色越明显即说明待测样品中的爆炸物分子的浓度越高。
进一步的，所述爆炸物分子为DNT。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：
1、番茄红素操纵子中存在三个基因，crtE、crtB、crtI，分别编码香叶基香叶基焦磷酸合成酶（CrtE）、八氢番茄红素合成酶（CrtB）、八氢番茄红素去饱和酶（CrtI）。本发明利用yqjFC55感应元件启动子，在其作用下利用crtE、crtB、crtI基因合成番茄红素。T7启动子（P T7 ）是一个强启动子，并完全专一受控于T7 RNA聚合酶，而高活性的T7 RNA聚合酶合成mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍，当二者同时存在时，宿主本身基因的转录竞争不过T7表达系统，几乎所有的细胞资源都能够用于表达目的蛋白，且诱导表达后仅几个小时目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。本发明借鉴这个系统，将T7 RNA聚合酶基因由yqjFC55启动子控制表达，将番茄红素操纵子的crtE、crtB、crtI基因由强启动子T7控制表达。在爆炸物分子2,4-DNT的诱导作用下，T7 RNA聚合酶进行表达，与T7启动子结合，启动下游三个基因的表达，达到了信号放大的效应。因此，本发明构建的可视化生物传感器，能够感应爆炸物分子（2,4-DNT）的yqjfC55启动子与编码T7 RNA Polymerase的T7RNAP基因结合，T7 RNA Polymerase能够与T7启动子结合，从而启动T7启动子下游的甲羟戊酸途径和番茄红素合成途径的基因的表达，合成番茄红素。进行肉眼观察，即可达到对爆炸物分子（2,4-DNT）的检测，使用方便、简单。
2、本发明构建的可视化生物传感器，将yqjfC55启动子启动T7 RNA Polymerase的表达，而不是将yqjfC55启动子直接启动甲羟戊酸途径和番茄红素合成途径的基因的表达，这种策略具有信号放大效应，能够提高生物传感器的检测灵敏度，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为琼脂糖凝胶电泳检测pACYC载体（A）、IspA片段（B）、菌落PCR验证（C）和构建的载体pACYA-mvaE-mvaS-IspA的质粒图谱（D）。
图2为琼脂糖凝胶电泳检测C55片段（A）、T7片段（B）、IspA载体（C）、菌落PCR验证（D）和构建的载体pACYA-mvaE-mvaS-IspA-yqjfC55-T7RNAP的质粒图谱（E）。
图3为XLYC3重组菌株的可视化检测爆炸物分子的应用在锥形瓶诱导结果；A为肉眼观察结果，B为相应的灰度值。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过购买获得的常规产品。
实施例1：基因的获得和载体的构建
1、基因的获得
来自于大肠杆菌（Escherichia coli）的启动子yqjfC55，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，由金唯智公司化学合成至pUC-57载体上，获得pUC-yqjfC55载体。
2、pACYC-mvaE-mvaS-IspA表达载体的构建
利用限制性内切酶1 Nde І（TaKaRa，货号1621）和限制性内切酶2 Bgl Ⅱ（TaKaRa，货号1606）双酶切pACYC-mvaE-mvaS-GPPS2质粒，其酶切体系为：
质粒或PCR产物
3 μg
10 ×Q.Cut Buffer
10 μL
限制性内切酶1
5 μL
限制性内切酶2
5 μL
超纯水
补至100 μL
酶切体系置于37 ºC孵育1h，进行胶回收纯化（图1A）。
以大肠杆菌E. coli Bl21(DE3)基因组为模版，引物IspA-F和引物IspA-R，进行聚合酶链式反应（PCR），扩增IspA基因片段，其PCR扩增体系如下所示：
PCR程序为：95ºC 3 min；30循环 ×（95ºC 15 s，55ºC 15 s，72ºC 1 min）；72ºC 5min；16ºC ∞。
引物序列如下所示：
IspA-F：
5’- tataagaaggagatatacatATGGACTTTCCGCAGCAACT-3’（SEQ ID NO.2）；
IspA-R：
5’- ctttaccagactcgagatctTTATTTATTACGCTGGATGATGTAGTCC-3（SEQ ID NO.3）。
PCR产物利用胶回收纯化试剂盒（Vazyme，货号DC301-01）进行胶回收纯化（图1B）。
利用2×Clon Express Mix（Vazyme，货号C115）通过无缝克隆的方法将三个PCR产物进行连接，其体系如下所示：
载体的PCR片段
0.03 pmol
插入各基因的PCR片段
0.06 pmol
2×Clon Express Mix
5 μL
超纯水
补至10 μL
体系置于50 ºC孵育30 min。产物转化E. coli DH5α感受态，涂布到含34 mg/L氯霉素的LB 固体平板上，PCR筛选阳性克隆（图1C），从阳性克隆中提取重组质粒pACYC-mvaE-mvaS-IspA（图1D），再通过限制性酶切和测序进行鉴定。
3、pACYC-mvaE-mvaS-IspA-yqjfC55-T7RNAP表达载体的构建
以pUC-yqjfC55为模版，引物IspA-C55-F和引物IspA-C55-R，进行PCR，扩增载体片段，其PCR扩增体系如下所示：
PCR程序为：30循环×（98ºC 10 s，60ºC 15 s，68ºC 90 s）；16ºC ∞。
引物序列如下所示：
IspA-C55-F：
5’-CCGGTAAACCAGCAATAGACACGGTTTTGGCGTATGGAG-3’ （SEQ ID NO.4）；
IspA-C55-R：
5’-GTGTTCATAGATCTTTACCTCCTTCCGCCACTCAGGCTGCTGAT-3’ （SEQ ID NO.5）。
PCR产物利用胶回收纯化试剂盒（Vazyme，货号DC301-01）进行胶回收纯化（图2A）。
以大肠杆菌E. coli Bl21(DE3)基因组为模版，引物IspA-T7RNAP-F和引物IspA-T7RNAP-R，进行PCR，扩增T7 RNA Polymerase片段（SEQ ID NO.6），其PCR扩增体系如下所示：
PCR程序为：95ºC 3 min；30循环 ×（95ºC 15 s，58ºC 15 s，72ºC 20 s）；72ºC 5min；16ºC ∞。
引物序列如下所示：
IspA-T7RNAP-F：
5’-GGAAGGAGGTAAAGATCTATGAACACG-3’（SEQ ID NO.7）；
IspA-T7RNAP-R：
5’-TTACGCGAACGCGAAGTCCG-3’ （SEQ ID NO.8）。
PCR产物利用胶回收纯化试剂盒（Vazyme，货号DC301-01）进行胶回收纯化（图2B）。
以pACYC-mvaE-mvaS-IspA为模版，引物IspA载体-F和引物IspA载体-R，进行聚合酶链式反应（PCR），扩增载体片段，其PCR扩增体系如下所示：
PCR程序为：30循环×（98ºC 10 s，60ºC 15 s，68ºC 1 min30 s）；16ºC ∞。
引物序列如下所示：
IspA载体-F：
5’- CGGACTTCGCGTTCGCGTAAtaagcggctatttaacgaccc-3’ （SEQ ID NO.9）；
IspA载体-R：5’-tgtctattgctggtttaccgg-3’ （SEQ ID NO.10）。
PCR产物利用胶回收纯化试剂盒（Vazyme，货号DC301-01）进行胶回收纯化（图2C）。
利用2×Clon Express Mix（Vazyme，货号C115）通过无缝克隆的方法将三个PCR产物进行连接，其体系如下所示：
载体的PCR片段
0.03 pmol
插入各基因的PCR片段
0.06 pmol
2×Clon Express Mix
5 μL
超纯水
补至10 μL
体系置于50 ºC孵育30 min。产物转化E. coli DH5α感受态，涂布到含34 mg/L氯霉素的LB 固体平板上，PCR筛选阳性克隆（图2D），从阳性克隆中提取重组质粒pACYC-mvaE-mvaS-IspA-yqjfC55-T7RNAP（图2E），再通过限制性酶切和测序进行鉴定。经检测，所述重组质粒pACYC-mvaE-mvaS-IspA-yqjfC55-T7RNAP能够外源表达乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE、3-羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS以及法呢基/香叶基焦磷酸合酶IspA。
实施例2：XLYC3重组菌株的构建
将pET-lyc质粒（引用自专利CN 112877342A）、pACYC-mvaE-mvaS-IspA-yqjfC55-T7RNAP、pTrc-low质粒（引用自Yang J, Xian M, Su S, et al. Enhancing productionof bio-isoprene using hybrid MVA pathway and isoprene synthase in E. coli.PLoS One. 2012; 7:e33509.）共同转化E. coli BL21(DE3) 感受态细胞，涂布到含34 mg/L氯霉素、100 mg/L氨苄青霉素和30 mg/L卡那霉素的LB固体平板上，获得阳性克隆，由此获得含有载体pET-lyc、pACYC-mvaE-mvaS-IspA-C55-T7RNAP质粒和ptrc-low质粒的工程菌株XLYC3。
实施例3：可视化检测爆炸物分子的应用
锥形瓶检测：挑取实施例2获得的工程大肠杆菌XLYC3单菌落于10 mL含有34 mg/L氯霉素、100 mg/L氨苄青霉素和30 mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，于37ºC摇床过夜培养活化；再转接至100 mL M9培养基中进行扩大培养，培养至OD600为0.6-0.8，加入0.5 mMisopropyl-β-D-thiogalactoside（IPTG）诱导，阳性对照设置2组，分别加入5 mg/L或10mg/L的DNT，30℃摇床培养，拍照。
结果如图3表明，与IPTG诱导组相比，两个DNT组的培养液红色更明显，且随着时间的增长，红色更加明显；且DNT浓度高组的培养液红色较浓度低组更明显。说明本发明构建的XLYC3重组菌株能够作为一种感应爆炸物分子的生物传感器，能够感应DNT而产生肉眼可见的番茄红素，而且DNT浓度越高，番茄红素产量越高，红色越明显，结果表明这种产番茄红素的生物传感器检测爆炸物分子的效果非常显著。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
序列表
<110> 青岛农业大学
<120> 一种具有信号放大效应的可视化检测爆炸物分子的生物传感器及其制备方法和应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 242
<212> DNA
<213> 启动子(yqjfC55)
<400> 1
ccggttttgg cgtatggagc gcctggcatc tggtcgaaac gactctcaag cagcaacagc 60
tccgcggtta gcttccctct ggccggagcc attccggcct tatccctcaa attttttgga 120
gatctttgtc aattttcctt gctaacaatc aacattcacc acatttatga ttttctccat 180
cgacaacaac gacgccaata ccgcgccttt gcacaaaaaa acaatcagca gcctgagtgg 240
cg 242
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tataagaagg agatatacat atggactttc cgcagcaact 40
<210> 3
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctttaccaga ctcgagatct ttatttatta cgctggatga tgtagtcc 48
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccggtaaacc agcaatagac acggttttgg cgtatggag 39
<210> 5
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtgttcatag atctttacct ccttccgcca ctcaggctgc tgat 44
<210> 6
<211> 2652
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atgaacacga ttaacatcgc taagaacgac ttctctgaca tcgaactggc tgctatcccg 60
ttcaacactc tggctgacca ttacggtgag cgtttagctc gcgaacagtt ggcccttgag 120
catgagtctt acgagatggg tgaagcacgc ttccgcaaga tgtttgagcg tcaacttaaa 180
gctggtgagg ttgcggataa cgctgccgcc aagcctctca tcactaccct actccctaag 240
atgattgcac gcatcaacga ctggtttgag gaagtgaaag ctaagcgcgg caagcgcccg 300
acagccttcc agttcctgca agaaatcaag ccggaagccg tagcgtacat caccattaag 360
accactctgg cttgcctaac cagtgctgac aatacaaccg ttcaggctgt agcaagcgca 420
atcggtcggg ccattgagga cgaggctcgc ttcggtcgta tccgtgacct tgaagctaag 480
cacttcaaga aaaacgttga ggaacaactc aacaagcgcg tagggcacgt ctacaagaaa 540
gcatttatgc aagttgtcga ggctgacatg ctctctaagg gtctactcgg tggcgaggcg 600
tggtcttcgt ggcataagga agactctatt catgtaggag tacgctgcat cgagatgctc 660
attgagtcaa ccggaatggt tagcttacac cgccaaaatg ctggcgtagt aggtcaagac 720
tctgagacta tcgaactcgc acctgaatac gctgaggcta tcgcaacccg tgcaggtgcg 780
ctggctggca tctctccgat gttccaacct tgcgtagttc ctcctaagcc gtggactggc 840
attactggtg gtggctattg ggctaacggt cgtcgtcctc tggcgctggt gcgtactcac 900
agtaagaaag cactgatgcg ctacgaagac gtttacatgc ctgaggtgta caaagcgatt 960
aacattgcgc aaaacaccgc atggaaaatc aacaagaaag tcctagcggt cgccaacgta 1020
atcaccaagt ggaagcattg tccggtcgag gacatccctg cgattgagcg tgaagaactc 1080
ccgatgaaac cggaagacat cgacatgaat cctgaggctc tcaccgcgtg gaaacgtgct 1140
gccgctgctg tgtaccgcaa ggacaaggct cgcaagtctc gccgtatcag ccttgagttc 1200
atgcttgagc aagccaataa gtttgctaac cataaggcca tctggttccc ttacaacatg 1260
gactggcgcg gtcgtgttta cgctgtgtca atgttcaacc cgcaaggtaa cgatatgacc 1320
aaaggactgc ttacgctggc gaaaggtaaa ccaatcggta aggaaggtta ctactggctg 1380
aaaatccacg gtgcaaactg tgcgggtgtc gataaggttc cgttccctga gcgcatcaag 1440
ttcattgagg aaaaccacga gaacatcatg gcttgcgcta agtctccact ggagaacact 1500
tggtgggctg agcaagattc tccgttctgc ttccttgcgt tctgctttga gtacgctggg 1560
gtacagcacc acggcctgag ctataactgc tcccttccgc tggcgtttga cgggtcttgc 1620
tctggcatcc agcacttctc cgcgatgctc cgagatgagg taggtggtcg cgcggttaac 1680
ttgcttccta gtgaaaccgt tcaggacatc tacgggattg ttgctaagaa agtcaacgag 1740
attctacaag cagacgcaat caatgggacc gataacgaag tagttaccgt gaccgatgag 1800
aacactggtg aaatctctga gaaagtcaag ctgggcacta aggcactggc tggtcaatgg 1860
ctggcttacg gtgttactcg cagtgtgact aagagttcag tcatgacgct ggcttacggg 1920
tccaaagagt tcggcttccg tcaacaagtg ctggaagata ccattcagcc agctattgat 1980
tccggcaagg gtctgatgtt cactcagccg aatcaggctg ctggatacat ggctaagctg 2040
atttgggaat ctgtgagcgt gacggtggta gctgcggttg aagcaatgaa ctggcttaag 2100
tctgctgcta agctgctggc tgctgaggtc aaagataaga agactggaga gattcttcgc 2160
aagcgttgcg ctgtgcattg ggtaactcct gatggtttcc ctgtgtggca ggaatacaag 2220
aagcctattc agacgcgctt gaacctgatg ttcctcggtc agttccgctt acagcctacc 2280
attaacacca acaaagatag cgagattgat gcacacaaac aggagtctgg tatcgctcct 2340
aactttgtac acagccaaga cggtagccac cttcgtaaga ctgtagtgtg ggcacacgag 2400
aagtacggaa tcgaatcttt tgcactgatt cacgactcct tcggtaccat tccggctgac 2460
gctgcgaacc tgttcaaagc agtgcgcgaa actatggttg acacatatga gtcttgtgat 2520
gtactggctg atttctacga ccagttcgct gaccagttgc acgagtctca attggacaaa 2580
atgccagcac ttccggctaa aggtaacttg aacctccgtg acatcttaga gtcggacttc 2640
gcgttcgcgt aa 2652
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggaaggaggt aaagatctat gaacacg 27
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ttacgcgaac gcgaagtccg 20
<210> 9
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cggacttcgc gttcgcgtaa taagcggcta tttaacgacc c 41
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tgtctattgc tggtttaccg g 21
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