一种固定化芽孢的制备方法及其在吸附稀土离子中的应用
阅读说明：本技术 一种固定化芽孢的制备方法及其在吸附稀土离子中的应用 (Preparation method of immobilized spores and application of immobilized spores in adsorption of rare earth ions ) 是由 董伟 王慧敏 徐鸿涛 宁周神 潘铭 彭倩 于 2021-06-23 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种固定化芽孢的制备方法及其在吸附稀土离子中的应用。本发明提供的固定化芽孢的制备方法,包括如下步骤：1)芽孢的培养；2)芽孢的收集；3)芽孢的纯化；4)固定化芽孢的制备。本发明属于生物环保技术领域,选取对环境耐受能力强的芽孢杆菌芽孢,经一定比例的包炭后,与海藻酸钠溶液混匀后缓慢滴加至特定温度和浓度条件的无菌CaCl-2溶液中,得到结构稳定的凝胶颗粒,进一步交联后得到固定化芽孢,实现了芽孢与特定固定化技术的结合,使芽孢高浓度密集,对稀土离子的吸附效果好且稳定,吸附效果明显优于枯草芽孢杆菌细胞、枯草芽孢杆菌芽孢以及海藻酸钠包埋芽孢。(The invention provides a preparation method of immobilized spores and application of the immobilized spores in adsorption of rare earth ions. The preparation method of the immobilized spore provided by the invention comprises the following steps: 1) culturing spores; 2) collecting spores; 3) purifying spores; 4) and (3) preparing immobilized spores. The invention belongs to the technical field of biological environmental protection, bacillus spores with strong environmental tolerance are selected, are coated with carbon in a certain proportion, are uniformly mixed with a sodium alginate solution, and are slowly dripped into sterile CaCl under specific temperature and concentration conditions 2 In the solution, gel particles with stable structure are obtained, immobilized spores are obtained after further crosslinking, the combination of the spores and a specific immobilization technology is realized, the spores are dense in high concentration, the adsorption effect on rare earth ions is good and stable, and the adsorption effect is obviously superior to that of bacillus subtilis cells, bacillus subtilis spores and sodium alginate embedded spores.)
技术领域
本发明属于生物环保
技术领域
，尤其涉及一种固定化芽孢的制备方法及其在吸附稀土离子中的应用。背景技术
稀土离子在水体中的污染日渐成为人们不可忽视的重大问题，不仅导致资源浪费，还可能对人类、其他动物和植物产生毒害。微生物修复技术由于投资成本低、见效快、对环境不会产生副作用等特点，逐渐被应用于修复水土污染中的重金属。然而，由于在实际应用过程中存在生物活性低、单位体积内菌体密度低、稳定性差以及环境耐受性差等问题，微生物修复技术对重金属等环境污染的修复效果大打折扣。
固定化技术被广泛的应用于固定酶和菌株细胞，在现有的水体污染研究中大部分是用来修复重金属染物。针对不同的固定化对象，所采取的固定化方法往往不同，例如：CN103898086 A公开了一种固定化水解酶并将其用于污泥水解，将水解酶通过戊二醛吸附交联于磁性壳聚糖复合微球(由Fe3O4纳米颗粒与壳聚糖通过戊二醛交联而成)上制备得到固定化水解酶。 CN103160492A公开了一种固定化枯草芽孢杆菌的制备方法并将固定化枯草芽孢杆菌用于处理污水，通过将枯草芽孢杆菌菌悬液的菌体沉淀加入到含有远红外细菌屋的牛肉膏蛋白胨培养液中，在恒温培养箱中固定培养40～60h，得到固定化枯草芽孢杆菌。上述固定化方法存在操作较复杂、操作时间较长、容易对活性物质的活性或传质代谢能力产生较大影响等问题。现有技术鲜见固定化技术用于稀土离子污染相关处理的研究报道。因此，开展固定化微生物吸附剂对稀土离子的研究，有望拓宽固定化微生物技术的应用范围，对于促进水介质中稀土离子的回收或净化具有重要意义。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种固定化芽孢的制备方法及其在吸附稀土离子中的应用。本发明选取对环境耐受能力强的芽孢杆菌芽孢，经一定比例的包炭后与海藻酸钠溶液混匀后缓慢滴加至特定温度和浓度条件的无菌CaCl2溶液中，得到的凝胶颗粒结构稳定，进一步交联后得到的固定化芽孢实现了芽孢与特定包埋、固定化技术的结合，使芽孢高浓度密集，对稀土离子的吸附效果好且稳定，吸附效果明显优于枯草芽孢杆菌细胞、枯草芽孢杆菌芽孢以及海藻酸钠包埋芽孢，且操作便捷、环境友好，适用于吸附、回收废水中的稀土离子。
本发明的目的将通过下面的详细描述来进一步说明。
本发明提供一种固定化芽孢的制备方法，包括如下步骤：
1)芽孢的培养：将活化后的枯草芽孢杆菌接入LB液体培养基中培养5～8h后，将菌液涂布于2×SG固体培养基平板培养3～5天，得到平板表面菌体；
2)芽孢的收集：收集所述平板表面菌体于盛有无菌水的离心管中，收集过程在冰浴下进行，然后于3～5℃下离心并去除上清与表面黑色杂质后，加入无菌水重新悬浮，得到芽孢粗悬液；
3)芽孢的纯化：将所述芽孢粗悬液冰浴下于超声波细胞破碎仪震荡超声，然后在3～5℃下离心，去除上清与表面黑色杂质后，加入18～25％质量百分含量的碘海醇溶液悬浮菌体，振荡后再转入45～60％质量百分含量的碘海醇溶液，振荡后于3～5℃离心，去除上清液，收集沉淀并用无菌水洗涤2～6次，3～5℃下离心，去除上清液，得到纯化后的芽孢；
4)固定化芽孢的制备：将所述纯化后的芽孢稀释成初始OD600＝1.8～3的菌悬液，按活性炭质量：菌悬液质量＝1:80～120的包炭量比例，向菌悬液中加入活性炭粉末，混匀，得到包炭后的菌悬液；将海藻酸钠加热溶于无菌生理盐水，冷却，得到浓度为0.03～0.05g/mL的海藻酸钠溶液；将所述包炭后的菌悬液与所述海藻酸钠溶液按1～1.1:1～1.1的体积比混合均匀，用玻璃无菌注射器缓慢滴加至4～5％质量百分含量的无菌CaCl2溶液中，无菌CaCl2溶液处于冰浴状态中，将形成的凝胶颗粒于室温下放置0.5～2h后，用无菌生理盐水冲洗2～3次，再浸没于 3～5℃、4～5％质量百分含量的无菌CaCl2溶液中交联22～26h，得到固定化芽孢。
本发明通过特定条件下培养枯草芽孢杆菌，制备、收集并纯化得到的芽孢稀释成初始 OD600＝1.8～3的菌悬液作为吸附剂，显著提升了对环境耐受能力，避免载体和固定化对吸附能力的影响；当初始OD600为1.5、1.2时，由于芽孢密度较低导致对稀土离子的吸附效果不够理想(吸附去除率低于80％)，当初始OD600超过3时，芽孢密度较高，并未随着OD600的增加而提高吸附去除率。通过将海藻酸钠加热溶于无菌生理盐水，可以提高溶解速度，避免小块凝结的现象；对包炭量比例进行研究发现，当活性炭包炭量为1:200时，固定化芽孢对铽离子的吸附去除率为79.81％，而当包炭量为1:100时，固定化芽孢对铽离子的吸附去除率达 90.22％，当包炭量超过1:80时，再增加活性炭质量的吸附效果变化不大。此外，本发明通过使用玻璃无菌注射器缓慢滴加至4～5％质量百分含量的无菌CaCl2溶液中，且滴加时无菌CaCl2溶液处于冰浴状态中，有利于成球状；当CaCl2的质量百分含量低于4％时，固定化效果不佳，得到的固定化小球凝胶较软，容易在保存和后续操作中破碎，尤其是当CaCl2的质量百分含量低于3％时，由于钙离子的缺失导致得到的固定化小球凝胶结构松散，极易在保存和后续操作中溶解破碎，当CaCl2的质量百分含量高于5％时，得到的固定化小球凝胶较硬，也容易出现破碎现象，且过量的钙离子可能使固定化小球凝胶的内部孔隙减小，进而影响对稀土离子的吸附效果。
枯草芽孢杆菌的活化及其在LB液体培养基中的培养，以及超声波细胞破碎仪的超声破碎，均按现有常规条件操作即可。
优选地，所述包炭量比例为1:100～110，该包炭量比例时对稀土离子的吸附去除效果好，且利于节约活性炭。
优选地，所述离心的转速为6000～10000rpm离心8～12min。
优选地，所述枯草芽孢杆菌为Bacillus subtilis 168，保藏编号为ATCC NO:27370。
优选地，所述LB液体培养基的制备方法包括如下步骤：950mL去离子水中加入胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g，用1mol/L的NaOH溶液调节pH值至7.0并定容至1L，高压灭菌，即得。所述2×SG固体培养基的制备方法包括如下步骤：970mL去离子水中加入营养肉汤16g，1mol/L MgSO4溶液2mL、2mol/L KCl溶液13mL、1mol/L MnCl2溶液 100μL、0.036mol/LFeSO4溶液30μL、琼脂粉15g，定容至1L，高压灭菌，灭菌后加入单独灭菌的20mL 50×硝酸钙·葡萄糖溶液，即得；所述硝酸钙·葡萄糖溶液由硝酸钙四水化合物1.18 g和葡萄糖5g加去离子水至100mL，即得。
此外，本发明还提供上述制备方法制得的固定化芽孢在吸附稀土离子中的应用。具体地，可以吸附土壤、废水中的稀土离子。
优选地，所述稀土离子为铽离子或镝离子。
相应地，本发明还提供一种利用固定化芽孢吸附稀土离子的方法，包括如下步骤：
1)固定化芽孢的吸附：将上述制备方法制得的固定化芽孢，与pH 7.0～7.4的含有稀土离子的溶液室温孵育吸附30～60min，收集吸附后的固定化芽孢；
2)吸附稀土离子效果的检测：在保持pH 7.0～7.4条件下，将步骤1)吸附后的溶液与过量2,6- 吡啶二羧酸进行混合，经荧光检测，得出残留稀土离子的含量。
优选地，所述稀土离子为铽离子或镝离子；所述稀土离子为铽离子时，荧光检测的吸收光谱为275nm，发散光谱为545nm；所述稀土离子为镝离子时，荧光检测的吸收光谱为231 nm，发散光谱为572nm。
固定化芽孢吸附稀土离子后，将固定化芽孢收集并用无菌水洗涤，然后重新悬浮于洗脱剂(DPA或者EDTA)中一段时间解吸附，然后离心，即可实现固定化芽孢的回收。
与现有技术相比，本发明的有益效果包括：
(1)本发明通过加入不同浓度的碘海醇溶液进行高速离心并控制离心时间，有效去除了杂物，实现了芽孢的收集和纯化；进一步用活性炭包埋后进行固定化，可实现枯草芽孢杆菌芽孢的高浓度密集。
(2)本发明发现利用海藻酸钠固定化包埋活性炭与枯草芽孢杆菌芽孢对稀土离子具有很强的吸附性，吸附效果明显优于枯草芽孢杆菌细胞、枯草芽孢杆菌芽孢以及海藻酸钠包埋芽孢，且对环境耐受能力强，易于回收再利用。
(3)本发明提供制得的固定化芽孢在吸附稀土离子中的应用。进一步地，本发明还发现：稀土离子(包括Tb3+、Dy3+等)能与过量的DPA结合形成复合物，且其荧光强度与稀土离子浓度在一定范围内成线性关系，从而便于进行残留稀土离子含量的检测和稀土离子吸附去除效果的评估。
附图说明
图1Tb3+、Dy3+分别与过量的DPA结合后形成复合物的荧光强度检测图。
图2本发明制得的固定化芽孢对Tb3+、Dy3+的吸附效果检测图。
图3不同稀土离子浓度下固定化芽孢对Tb3+、Dy3+的去除率检测图。
图4一定时间内固定化芽孢对Tb3+、Dy3+的吸附效果检测图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
本发明实施例中，活性炭、培养基等均为常规市售产品，或可通过本领域的常规技术手段获得。枯草芽孢杆菌为Bacillus subtilis 168，保藏编号为ATCC NO:27370。
实施例一 固定化枯草芽孢杆菌芽孢的制备
固定化枯草芽孢杆菌芽孢的制备方法，包括如下步骤：
1)芽孢的培养：将活化后的枯草芽孢杆菌接入LB液体培养基中，37℃、250rpm培养6h 后，将菌液涂布于2×SG固体培养基，于37℃培养4天，得到平板表面菌体；
枯草芽孢杆菌菌株的活化包括如下步骤：用接种环蘸取少量保藏菌液于LB固体培养基平板上划线，于37℃培养箱中过夜培养；
2)芽孢的收集：收集所述平板表面菌体于盛有25mL无菌水的离心管中，收集过程在冰浴下进行，8000rpm、4℃离心10min，去除上清与表面黑色杂质后，加入25mL无菌水重新悬浮，得到芽孢粗悬液；
3)芽孢的纯化：将所述芽孢粗悬液冰浴下于超声波细胞破碎仪震荡超声(额定输出功率的 50％，6min，3个循环)，然后8000rpm、4℃下离心10min，去除上清与表面黑色杂质后，加入20％质量百分含量的碘海醇溶液悬浮菌体，振荡后再转入50％质量百分含量的碘海醇溶液，振荡后于8000rpm、4℃下离心10min，去除上清液，收集沉淀并用无菌水洗涤3次，8000rpm、4℃下离心10min，去除上清液，得到纯化后的芽孢；通过相差显微镜观察，芽孢是明亮的，得到的芽孢纯度>99％；
4)固定化芽孢的制备：将所述纯化后的芽孢稀释成初始OD600＝2的菌悬液，按活性炭质量：菌悬液质量＝1:100的包炭量比例，向菌悬液中加入活性炭粉末，混匀，得到包炭后的菌悬液；将海藻酸钠加热溶于无菌生理盐水，冷却，得到浓度为0.04g/mL的海藻酸钠溶液；将所述包炭后的菌悬液与所述海藻酸钠溶液按1:1的体积比混合均匀，用玻璃无菌注射器缓慢滴加至4％质量百分含量的无菌CaCl2溶液中，无菌CaCl2溶液处于冰浴状态中，将形成的凝胶颗粒于室温下放置1h后，用无菌生理盐水冲洗2次，再浸没于4℃、4％无菌CaCl2溶液中交联 24h，得到固定化芽孢。
实施例二 固定化枯草芽孢杆菌芽孢的制备
固定化枯草芽孢杆菌芽孢的制备方法，包括如下步骤：
1)芽孢的培养：将活化后的枯草芽孢杆菌接入LB液体培养基中，37℃、250rpm培养8h后，将菌液涂布于2xSG固体培养基，于37℃培养5天，得到平板表面菌体；
枯草芽孢杆菌菌株的活化包括如下步骤：用接种环蘸取少量保藏菌液于LB固体培养基平板上划线，于37℃培养箱中过夜培养；
2)芽孢的收集：收集所述平板表面菌体于盛有25mL无菌水的离心管中，收集过程在冰浴下进行，7000rpm、4℃离心11min，去除上清与表面黑色杂质后，加入25mL无菌水重新悬浮，得到芽孢粗悬液；
3)芽孢的纯化：将所述芽孢粗悬液冰浴下于超声波细胞破碎仪震荡超声(额定输出功率的 50％，6min，3个循环)，然后7000rpm、4℃下离心11min，去除上清与表面黑色杂质后，加入22％质量百分含量的碘海醇溶液悬浮菌体，振荡后再转入55％质量百分含量的碘海醇溶液，振荡，7000rpm、4℃下离心11min，去除上清液，收集沉淀并用无菌水洗涤3次，7000 rpm、4℃下离心11min，去除上清液，得到纯化后的芽孢；通过相差显微镜观察，芽孢是明亮的，得到的芽孢纯度>99％；
4)固定化芽孢的制备：将所述纯化后的芽孢稀释成初始OD600＝2.5的菌悬液，按活性炭质量：菌悬液质量＝1:90的包炭量比例，向菌悬液中加入活性炭粉末，混匀，得到包炭后的菌悬液；将海藻酸钠加热溶于无菌生理盐水，冷却，得到浓度为0.04g/mL的海藻酸钠溶液；将所述包炭后的菌悬液与所述海藻酸钠溶液按1:1的体积比混合均匀，用玻璃无菌注射器缓慢滴加至4.5％质量百分含量的无菌CaCl2溶液中，无菌CaCl2溶液处于冰浴状态中，将形成的凝胶颗粒于室温下放置1h后，用无菌生理盐水冲洗2次，再浸没于4℃、4.5％质量百分含量无菌 CaCl2溶液中交联24h，得到固定化芽孢。
实施例三 稀土离子浓度检测
当稀土离子为Tb3+时，Tb3+与过量的DPA结合后形成复合物的荧光强度检测图如图1中的A所示，荧光检测的吸收光谱为275nm，发散光谱为545nm；当稀土离子为Dy3+时，Dy3+与过量的DPA结合后形成复合物的荧光强度检测图如图1中的B所示，荧光检测的吸收光谱为231nm，发散光谱为572nm。从图1可知，Tb3+、Dy3+能与过量的DPA结合形成复合物，且其荧光强度与稀土离子浓度在一定范围内成线性关系。
实施例四 固定化枯草芽孢杆菌芽孢的吸附
将实施例一制得的固定化芽孢与pH 7.0～7.4的含有不同浓度的稀土离子的溶液室温孵育 60min，收集吸附后的固定化芽孢。在保持pH 7.0～7.4条件下，将吸附后的上清液与过量2,6- 吡啶二羧酸进行混合，经荧光检测，得出残余稀土离子含量。
本发明将枯草芽孢杆菌芽孢在纯化后与活性炭、海藻酸钠、氯化钙等试剂通过一定顺序处理，制成固定化芽孢。通过测试本发明制得的固定化芽孢对Tb3+、Dy3+等稀土离子的饱和吸附量，发现其对不同稀土离子的吸附能力不尽相同，但均具有较好的吸附效果，固定化芽孢对Tb3+、Dy3+的吸附效果检测图如图2所示，对Tb3+饱和吸附量为841纳摩尔/毫克固定化芽孢，对Dy3+饱和吸附量为1034纳摩尔/毫克固定化芽孢。而相同条件下，经检测，枯草芽孢杆菌细胞对Tb3+的饱和吸附量为78纳摩尔/毫克细胞，对Dy3+的饱和吸附量为152纳摩尔/ 毫克细胞；枯草芽孢杆菌芽孢对Tb3+饱和吸附量为102纳摩尔/毫克芽孢，对Dy3+的饱和吸附量为196纳摩尔/毫克芽孢；海藻酸钠包埋芽孢(与本发明的固定化相比，未添加活性炭进行包炭)对Tb3+的饱和吸附量为641纳摩尔/毫克芽孢，对Dy3+的饱和吸附量为1002纳摩尔/ 毫克芽孢。可见，将活性炭与枯草芽孢杆菌芽孢共同包埋后的固定化芽孢对稀土离子的吸附能力明显更强，发生了协同增效作用。
如图3所示，当稀土离子浓度为100μmol/L，加入OD600＝2、包炭量为1:100的固定化芽孢2.5g吸附60min时，对Tb3+、Dy3+等稀土离子的吸附去除率高达90％以上。固定化芽孢的吸附时间对吸附效果产生重要影响，一定时间内固定化芽孢对Tb3+、Dy3+的吸附效果检测图如图4所示，对Tb3+吸附60min时的吸附量接近饱和吸附量，对Dy3+吸附50min时的吸附量接近饱和吸附量。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
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