阅读说明：本技术 一种抗双链dna抗体检测试剂 (Anti-double-chain DNA antibody detection reagent ) 是由 盛伟 裴中平 徐小点 于 2019-09-27 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种抗双链DNA抗体检测试剂盒,包括包被双链DNA抗原的磁微粒、碱性磷酸酶标记抗体和化学发光底物；所述磁微粒为二氧化硅磁性复合微粒。本发明提供的抗双链DNA抗体检测试剂具有较高的检测灵敏度,较低的检测误差并且检测时间较短的优点,可快速而精确地进行检测。(The invention provides an anti-double-stranded DNA antibody detection kit, which comprises magnetic particles coated with double-stranded DNA antigens, an alkaline phosphatase labeled antibody and a chemiluminescent substrate; the magnetic particles are silicon dioxide magnetic composite particles. The anti-double-chain DNA antibody detection reagent provided by the invention has the advantages of higher detection sensitivity, lower detection error and shorter detection time, and can be used for quickly and accurately detecting.)

一种抗双链DNA抗体检测试剂

技术领域

本发明属于检测技术领域，涉及一种抗双链DNA抗体检测试剂。

背景技术

抗双链DNA抗体是抗DNA抗体中的一种，是系统性红斑狼疮(SLE)的血清学标志物，而且是临床上最常进行的一项实验室检测指标。对于系统性红斑狼疮的诊断而言，抗双链DNA抗体具有相当高的特异性，容易被检测，同时与系统性红斑狼疮又有一定的联系，会随着该疾病的活动程度而发生变化，因此，对双链DNA抗体进行检测，可快速准确的判断系统性红斑狼疮。

目前进行诊断检测的方法主要有化学发光分析法、酶联免疫吸附测定、胶体金免疫层析法、免疫荧光分析法、间接免疫荧光法等。其中在临床上应用最为广泛的是间接免疫荧光法，该方法以绿蝇短膜虫虫体为包被基质，其上只含有一个单纯的、完整的dsDNA分子，不含有任何其他物质，特异性好；由于只结合血清中的高亲和力抗体，故灵敏度有一定限制，并且其过程包括手工操作和荧光显微镜观察，同时需要丰富的经验，受到多种因素的影响。免疫印迹法综合了十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳高分辨率和酶免疫吸附技术的高特异度，广泛用于组抗原成分分析，但是此方法检测抗ds-DNA抗体敏感性较低。

CN101776682A公开了一种双链DNA抗原的制备方法和检测人血清抗双链DNA抗体的试剂盒。该方法包括(1)使用含有Tris、EDTA盐和RNase A的缓冲液P1处理质粒DNA，离心除去上清后再加入该缓冲液P1悬浮；(2)使用含SDS和碱金属离子的碱性缓冲液P2处理步骤(1)所得悬浮物；和(3)使用含醋酸钾的缓冲液P3处理步骤(2)的产物，离心获得上清，上清过滤后用异丙醇处理，离心得到沉淀。该专利提供的抗原成本低廉并且具有稳定可靠的抗原性能，但是其对抗双链DNA抗体的敏感度不够高。CN109444404A提供了一种抗双链DNA抗体快速检测方法，DNA提取步骤包括：生物素标记双链DNA抗原、荧光标记鼠抗人免疫球蛋白G、制备试纸条和样本稀释液、测定，利用离心管、离心机、水浴箱、电子pH计、荧光免疫分析仪、连接点膜喷金一体机，再加上相应的试剂和材料进行快速而准确地检测；该专利提供的试纸条在进行检测时，检测时间较短，但是其灵敏度仍不够高。

因此，需要提供一种新的检测试剂，以提高对抗双链DNA抗体的检测灵敏度。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗双链DNA抗体检测试剂。本发明提供的抗双链DNA抗体检测试剂具有较高的检测灵敏度，较低的检测误差并且检测时间较短的优点，可快速而精确地进行检测。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种抗双链DNA抗体检测试剂，包括包被双链DNA抗原的磁微粒、碱性磷酸酶标记抗体和化学发光底物；

所述磁微粒为二氧化硅磁性复合微粒。

本发明特异性的选择二氧化硅磁性复合微粒包被双链DNA抗原，包被性能好，进而使检测试剂的检测误差小；同时本发明选择化学发光标记物作为定量分析的判断标准，具有发光时间长、强度高，在发光时间内变化小的特点。

包被性能较好，有利于后续对待测样品检测时，不会由于包被的问题而增大检测误差。

在本发明中，所述二氧化硅磁性复合微粒包括二氧化硅壳层和磁性三氧化二铁纳米内核。

优选地，所述磁微粒的粒径为0.5-2μm，例如0.8μm、1.0μm、1.2μm、1.4μm、1.5μm、1.6μm、1.8μm等，进一步优选1-1.5μm，例如1.1μm、1.2μm、1.3μm、1.4μm等。

本发明的二氧化硅磁性复合微粒为现有技术中可获得的磁微球。

本发明优选粒径为0.5-2μm的磁微粒，若粒径过大，则包被的双链DNA抗原可能会过密，而导致在后续与待检测物结合时，会有部分抗原无法与待检测物结合，造成浪费，并且可能会影响其灵敏度；若粒径过小，则包被的双链DNA抗原过少而影响测量精度。

在本发明中，化学发光底物为3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐。

在本发明中，所述发光底物中还包括增强剂。

优选地，所述增强剂选自聚季铵盐，进一步优选双葵基二甲基溴化铵和/或双葵基二甲基氯化铵。

在本发明中，增强剂可以增强碱性磷酸酶酶解化学发光底物的发光强度，本发明特异性的选择聚季铵盐作为增强剂，尤其是选择双葵基二甲基溴化铵和/或双葵基二甲基氯化铵作为增强剂，其增强因素可达10000倍以上，因此，可以明显的增加本发明提供的抗双链DNA抗体检测试剂的灵敏度。

在本发明中，所述双链DNA抗原选自质粒DNA抗原和/或大肠杆菌双链DNA抗原，进一步优选质粒DNA抗原。

优选地，所述抗体选自抗人IgG、IgA或IgM中的任意一种或至少两种的组合，进一步优选抗人IgG。

在本发明中，所述磁微粒偶联有链霉亲和素。

优选地，所述双链DNA抗原通过链霉亲和素包被于所述磁微粒上。

在本发明中，包被双链DNA抗原的磁微粒的制备方法如下：

将抗原溶液加入磁微粒中，孵育包被，得到所述包被双链DNA抗原的磁微粒。

优选地，所述制备方法如下：

(1)将链霉亲和素溶液加入酶标板中进行偶联反应，得到链霉亲和素偶联的磁微粒；

(2)将抗原溶液加入链霉亲和素偶联的磁微粒中进行孵育包被，得到所述包被双链DNA抗原的磁微粒。

在本发明中，所述碱性磷酸酶标记抗体的制备方法如下：

将活化后的抗体与活化后的碱性磷酸酶混合，纯化，得到所述碱性磷酸酶标记抗体。

本发明中的包被双链DNA抗原的磁微粒以及碱性磷酸酶标记抗体的制备方法均可以采用现有技术中常用的制备方法进行制备。

示例性的，所述活化后的抗人IgG抗体的制备方法如下：

将抗人IgG抗体加入偶联剂2-亚胺基硫烷盐酸盐中，静置后加入甘氨酸溶液再次静置，然后利用凝胶柱除盐，得到活化的抗人IgG抗体。

所述活化的碱性磷酸酶的制备方法如下：

将碱性磷酸酶溶液加入4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯溶液中，静置后利用凝胶柱除盐，得到活化的碱性磷酸酶。

在本发明中，在所述抗双链DNA抗体检测试剂中，所述碱性磷酸酶标记抗体以溶液的形式存在。

优选地，所述溶液的浓度为0.1-2μg/mL，例如0.4μg/mL、0.6μg/mL、0.8μg/mL、1.0μg/mL、1.2μg/mL、1.5μg/mL、1.8μg/mL等。

在本发明中，在抗双链DNA抗体检测试剂中，所述包被双链DNA抗原的磁微粒以分散液的形式存在。

优选地，所述分散液的浓度为1-4μg/mL，例如1.2μg/mL、1.5μg/mL、1.8μg/mL、2.0μg/mL、2.5μg/mL、3.0μg/mL、3.5μg/mL等。

在本发明中，所述抗双链DNA抗体的检测方法为现有技术中常用的检测方法，示例性的，所述抗双链DNA抗体检测试剂的使用方法如下：

(1)在检测管中加入包被双链DNA抗原的磁微粒的分散液和待检测样本混合进行孵育、分离并清洗；

(2)向步骤(1)得到的体系中加入碱性磷酸酶标记抗体溶液混合均匀进行第二次孵育、分离并清洗；

(3)加入化学发光底物以及增强剂，充分混合后孵育12-15min后检测相对发光强度以得到抗双链DNA抗体的量。

在本发明中所述分离可以加磁场进行分离。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明特异性的选择二氧化硅磁性复合微粒包被双链DNA抗原，包被性能好，进而使检测试剂的检测误差小；同时本发明选择化学发光标记物作为定量分析的判断标准，具有发光时间长、强度高，在发光时间内变化小的特点。

(2)在本发明中，增强剂可以增强碱性磷酸酶酶解化学发光底物的发光强度，本发明特异性的选择聚季铵盐作为增强剂，尤其是选择双葵基二甲基溴化铵和/或双葵基二甲基氯化铵作为增强剂，其增强因素可达10000倍以上，因此，可以明显的增加本发明提供的抗双链DNA抗体检测试剂的灵敏度。

(3)本发明提供的抗双链DNA抗体的检测试剂具有灵敏度高、误差值小的检测优点，其中，检测试剂的LOD在0.05IU/mL以下，最低可达0.005IU/mL以下；检测误差在2％以下，最低可达1％以下。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施例1

一种抗双链DNA抗体检测试剂，由包被双链DNA抗原的磁微粒、碱性磷酸酶标记抗体、化学发光底物和增强剂组成。

其中，包被双链DNA抗原的磁微粒悬浮液的浓度为2μg/mL；碱性磷酸酶标记抗体溶液的浓度为1μg/mL。

化学发光底物为3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐；增强剂为双葵基二甲基氯化铵。

包被双链DNA抗原的磁微粒悬浮液的制备方法如下：

(1)取羧基化的纳米磁微球(粒径为1μm)的MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)悬浮液加入EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)进行活化反应，然后加入链霉亲和素，30℃下混悬5h，加磁场进行分离，去除上层清液后，利用Tris缓冲液进行重新悬浮，得到偶联有链霉亲和素的磁微粒的悬浮液，浓度为2μg/mL。

(2)将偶联有链霉亲和素的磁微粒的悬浮液与大肠杆菌双链DNA抗原的悬浮液混合(Tris缓冲液，浓度为1μg/mL)在室温下进行孵育4h，加磁场进行分离，去除上层清液，然后利用pH为7的磷酸盐缓冲液进行清洗，重新悬浮，得到浓度为2μg/mL的包被双链DNA抗原的磁微粒悬浮液。

碱性磷酸酶标记抗体的制备方法如下：

(1)将抗人IgG抗体加入偶联剂2-亚胺基硫烷盐酸盐中，在30℃下静置20min后加入甘氨酸溶液再次在30℃下静置5min，然后利用G-25凝胶柱除盐，得到活化的抗人IgG抗体，浓度为1μg/mL。

(2)将碱性磷酸酶溶液加入4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯溶液中，在30℃下静置30min后利用G-25凝胶柱除盐，得到活化的碱性磷酸酶，浓度为1μg/mL。

(3)将活化后的抗体与活化后的碱性磷酸酶在5℃下混合并静置20h，然后利用Supperdex200凝胶纯化柱纯化，得到所述碱性磷酸酶标记抗体，浓度为1μg/mL。

实施例2-6

与实施例1的区别在于，本实施例所使用的二氧化硅磁性复合微粒的粒径为1.5μm(实施例2)、0.5μm(实施例3)、2μm(实施例4)、0.1μm(实施例5)、2.5μm(实施例6)。

实施例7-9

与实施例1的区别在于，本实施例所使用的增强剂为双葵基二甲基溴化铵(实施例7)、二甲基苄基氯化铵(实施例8)、聚氯苄乙烯苄基二甲基铵(实施例9)。

实施例10

与实施例1的区别在于，本实施例不使用增强剂。

实施例11

一种抗双链DNA抗体检测试剂，由包被双链DNA抗原的磁微粒、碱性磷酸酶标记抗体、化学发光底物和增强剂组成。

其中，包被双链DNA抗原的磁微粒悬浮液的浓度为4μg/mL；碱性磷酸酶标记抗体溶液的浓度为2μg/mL。

化学发光底物为3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐；增强剂为双葵基二甲基氯化铵。

包被双链DNA抗原的磁微粒悬浮液的制备方法如下：

(1)取羧基化的纳米磁微球(粒径为1μm)与质粒DNA抗原的悬浮液混合(Tris缓冲液，浓度为1μg/mL)在室温下进行孵育4h，加磁场进行分离，去除上层清液，然后利用pH为7的磷酸盐缓冲液进行清洗，重新悬浮，得到浓度为4μg/mL的包被双链DNA抗原的磁微粒悬浮液。

碱性磷酸酶标记抗体的制备方法如下：

(1)将抗人IgM抗体加入偶联剂2-亚胺基硫烷盐酸盐中，在30℃下静置20min后加入甘氨酸溶液再次在30℃下静置5min，然后利用G-25凝胶柱除盐，得到活化的抗人IgM抗体，浓度为1μg/mL。

(2)将碱性磷酸酶溶液加入4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯溶液中，在30℃下静置30min后利用G-25凝胶柱除盐，得到活化的碱性磷酸酶，浓度为1μg/mL。

(3)将活化后的抗体与活化后的碱性磷酸酶在5℃下混合并静置20h，然后利用Supperdex200凝胶纯化柱纯化，得到所述碱性磷酸酶标记抗体，浓度为2μg/mL。

对比例1

与实施例1的区别在于，将磁微球替换为酶标板。

性能测试

对实施例1-11和对比例1提供的检测试剂进行性能测试，方法如下：

(1)灵敏度测试：用标准品缓冲液(40mM Tris-HCl，0.5％BSA，1％NaCl，pH8.0)将抗双链DNA抗体IgG配置成浓度为0.001IU/mL、0.002IU/mL、0.003IU/mL、0.005IU/mL、0.007IU/mL、0.008IU/mL、0.01IU/mL、0.05IU/mL、0.08IU/mL、0.1IU/mL、0.5IU/mL、1IU/mL、5IU/mL的标品，利用检测试剂进行检测，记录其可检测的最低浓度(LOD)，即为样品的灵敏度。

(2)检测误差：用标准品缓冲液(40mM Tris-HCl，0.5％BSA，1％NaCl，pH8.0)将抗双链DNA抗体IgG配置成浓度为0.5IU/mL的标品，然后利用实施例和对比例提供的检测试剂进行检测，记录其检测的值，以及计算检测误差百分比。

测试结果见表1：

表1

由实施例和性能测试可知，本发明提供的抗双链DNA抗体的检测试剂具有灵敏度高、误差值小的检测优点，其中，检测试剂的LOD在0.05IU/mL以下，最低可达0.005IU/mL以下；检测误差在2％以下，最低可达1％以下。由于检测结果最多显示至小数点后三位，所以在此检测误差最低为0.2％。

由实施例1-2和实施例3-6的对比可知，磁微球的粒径在1-1.5μm范围内时具有更好的检测灵敏度以及更低的检测误差。由实施例1和实施例7-10的对比可知，当本发明包括增强剂，增强剂为聚季铵盐时，最后得到的检测试剂的灵敏度较好，检测误差低。由实施例1和对比例1的对比可知，本发明采用磁微球作为固相载体，更有利于减少测量误差。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的抗双链DNA抗体检测试剂，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。