阅读说明：本技术 一种基于生物膜干涉技术的沙门氏菌快速检测方法 (Rapid salmonella detection method based on biofilm interference technology ) 是由 张晓光 藏程琳 孙春燕 张鸣镝 刘佰潼 刘凯 刘泽同 刘志伟 于 2019-09-25 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于生物膜干涉技术的沙门氏菌快速检测方法,其方法为：步骤一、传感器活化；步骤二、抗体固定化；步骤三、封闭；步骤四、样品检测及结果判断；本发明的有益效果：本发明提供的基于生物膜干涉技术的沙门氏菌快速检测方法步骤少、操作简单易学、无需任何标记；该方法检测时间短,由于该方法的其他环节可以提前准备妥当,所以可以做到样品的随到随检。根据样品中所含目标菌浓度的不同,单纯的样品检测环节只需要数十秒到几分钟的时间。本发明所述方法可应用于粗样品的检测,检测前样品无需经过离心和脱气。本发明所述方法配合可商购的基于BLI技术的设备和系统,可实现多个样品(例如96个样品)的同时批量检测。(The invention discloses a method for quickly detecting salmonella based on a biofilm interference technology, which comprises the following steps: step one, activating a sensor; step two, immobilizing the antibody; step three, sealing; step four, sample detection and result judgment; the invention has the beneficial effects that: the method for rapidly detecting the salmonella based on the biomembrane interference technology has the advantages of few steps, simple and easy operation, no need of any mark; the method has short detection time, and other links of the method can be prepared properly in advance, so that the samples can be detected at any time. According to the difference of the concentration of target bacteria contained in the sample, the simple sample detection process only needs tens of seconds to several minutes. The method can be applied to the detection of a crude sample, and the sample does not need to be centrifuged or degassed before detection. The method of the present invention, in conjunction with commercially available equipment and systems based on BLI technology, enables simultaneous batch testing of multiple samples (e.g., 96 samples).)

一种基于生物膜干涉技术的沙门氏菌快速检测方法

技术领域

本发明涉及一种沙门氏菌快速检测方法，特别涉及一种基于生物膜干涉技 术的沙门氏菌快速检测方法。

背景技术

目前，食物中毒是世界性的公共卫生问题，食源性致病菌是导致食物中毒 的首要原因。沙门氏菌是一种常见的食源性致病菌，该菌常污染肉类、鱼类、 乳类、蛋类等动物性食品及相关制品而引起食物中毒。据国内外相关统计，由 沙门氏菌引起的食物中毒占细菌性食物中毒的42.6％-60％。沙门氏菌除能引起 食物中毒外，还可引起严重的消化道传染病。据欧洲食品***估计，欧盟每 年因沙门氏菌污染造成的经济损失高达30亿欧元。

快速准确检测出沙门氏菌是预防和控制沙门氏菌食物中毒及相关疾病的关 键。沙门氏菌传统检测方法步骤多、操作繁琐、耗时长，已远不能满足现代社 会快速发展需要。现有应用较广泛的快速检测方法有基于抗原抗体反应的免疫 学检测技术(如ELISA)和以PCR为代表的分子生物学检测技术，与传统方法 相比，缩短了检测时间，且有较高的灵敏度和特异性；但仍有不足，如易受污 染而导致假阳性结果(PCR)，对试剂的选择性高、准确性不够(ELISA)，检测 时间仍较长等。开发更加快速、准确的沙门氏菌检测方法是迫切需要的。

生物膜干涉(biolayer interferometry，BLI)技术是近几年刚刚兴起的新一代实时无标记快速检测技术。该技术可以进行多种生物分子间相互作用的分析， 国内外已有许多学者将其应用于抗体筛选、抗体-抗原/病毒亲和力测定、蛋白- 蛋白/DNA/RNA/纳米颗粒亲和力测定以及抗体和其他蛋白的定量测定等领域， 取得了可喜的科研成果。其所展示出的技术优势，诸如快速、高效、高准确性、 简单易用，已得到了国内外众多专家学者的一致高度认可。

发明内容

本发明的目的是为了解决传统检测沙门氏菌的方法中步骤多、操作繁琐以 及耗时长的问题而提供的一种基于生物膜干涉技术的沙门氏菌快速检测方法。

本发明提供的基于生物膜干涉技术的沙门氏菌快速检测方法，包括传感器 活化、抗体固定化、封闭、样品检测及结果判断，其具体步骤如下：

步骤一、传感器活化：将第二代氨基偶联传感器末端浸入纯水中预湿至少 10分钟后，浸入15-25mM 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和8-12 mM N-羟基琥珀酰亚胺混合活化试剂中活化150-450秒；

步骤二、抗体固定化：将活化后的第二代氨基偶联传感器浸入用pH 4-6的 醋酸-醋酸钠缓冲溶液稀释的浓度为12.5-100μg/mL的抗体溶液中固定化180-900 秒；

步骤三、封闭：抗体固定化后，将第二代氨基偶联传感器依次浸入0.8-1.5M 乙醇胺盐酸盐溶液和0.8-1.5％牛血清白蛋白溶液中封闭150-450秒；

步骤四、样品检测及结果判断：将已封闭的第二代氨基偶联传感器浸入含 0.01-0.03％吐温-20的磷酸盐缓冲溶液中平衡60-180秒，而后浸入待测样品中进 行沙门氏菌的检测，检测过程中实时读取结合信号，对于定性分析，当结合信 号大于等于有效信号值0.0075nm时即可判定样品中含有沙门氏菌；对于定量分 析，将结合时间为60秒、120秒、180秒、300秒时的结合信号y分别代入到下 述菌浓度和结合信号间的数学公式(1)、(2)、(3)、(4)：

C₆₀＝10^{ln(41349.7y+277.0)^0.98499} (1)

C₁₂₀＝10^{ln(11293.1y+160.5)^1.11054} (2)

C₁₈₀＝10^{ln(16331.9y+179.7)^1.04064} (3)

C₃₀₀＝10^{ln(13112.1y+146.1)^1.04585} (4)

求解所得C即为样品中沙门氏菌的具体浓度，其中C₆₀、C₁₂₀、C₁₈₀和C₃₀₀分别代表结合时间为60秒、120秒、180秒和300秒时求得的菌浓度，结合时 间为60秒、120秒、180秒、300秒时所对应的沙门氏菌的最低检出限分别是 1.9×10⁶CFU/mL、1.3×10⁶CFU/mL、8.8×10⁵CFU/mL和5.6×10⁵CFU/mL。

本发明的有益效果：

本发明提供的基于生物膜干涉技术的沙门氏菌快速检测方法步骤少、操作 简单易学、无需任何标记；该方法检测时间短，由于该方法的其他环节可以提 前准备妥当，所以可以做到样品的随到随检。根据样品中所含目标菌浓度的不 同，单纯的样品检测环节只需要数十秒到几分钟的时间。例如当实际样品中的 目标菌浓度在8.8×10⁶CFU/mL时，仅仅需要60秒即可判断出样品中有目标菌 的存在。如果菌浓度更高的话这个时间会更短。本发明所述方法可实时获取检 测信号，所以可根据实际需要随时读取检测信号进行分析以判断是否有必要继 续实施检测过程，如果检测信号已达要求便可终止检测从而可以节省检测时间。 本发明所述方法可应用于粗样品的检测，检测前样品无需经过离心和脱气。本 发明所述方法配合可商购的基于BLI技术的设备和系统，可实现多个样品(例 如96个样品)的同时批量检测。

附图说明

图1为本发明所述检测方法的特异性检测结果示意图。

图2为本发明所述检测方法结合时间为60秒时菌浓度和结合信号间的标准 曲线图。

图3为本发明所述检测方法结合时间为120秒时菌浓度和结合信号间的标准 曲线图。

图4为本发明所述检测方法结合时间为180秒时菌浓度和结合信号间的标准 曲线图。

图5为本发明所述检测方法结合时间为300秒时菌浓度和结合信号间的标准 曲线图。

具体实施方式

请参阅图1至图5所示：

下列实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方 式和过程，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照试 剂制造厂商所建议的条件。

以下实施例中用到的主要试剂耗材信息见表1；主要仪器信息见表2。

表1主要试剂耗材信息表

表2主要仪器信息表

实施例1：检测方法的特异性考察

特异性是评判一种检测方法优劣的一个重要指标。为了考察所发明方法的特 异性，以沙门氏菌为目标菌，以斯氏李斯特菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特 菌为非目标菌进行试验，具体步骤如下：

(1)将沙门氏菌、斯氏李斯特菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌接种到 胰蛋白胨大豆肉汤培养基中过夜培养，离心得菌体沉淀，经磷酸盐缓冲溶液洗 净后再用磷酸盐缓冲溶液将沙门氏菌菌悬液浓度调整至2.2×10⁸CFU/mL、 4.4×10⁷CFU/mL、8.8×10⁶CFU/mL，将斯氏李斯特菌、金黄色葡萄球菌、单增 李斯特菌的菌悬液浓度调整为1.0×10⁷CFU/mL，待检。

(2)在96孔板中相应位置依次加入纯水、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二 亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺混合活化试剂(400mM 1-乙基-(3-二甲基氨基 丙基)碳二亚胺盐酸盐和200mM N-羟基琥珀酰亚胺各取100μl加入到1800μl水 中配制而成)、抗体溶液(50μg/ml于pH为5的10mM的醋酸-醋酸钠缓冲溶液 中)、浓度为1M的乙醇胺盐酸盐(pH＝8.5)、1％牛血清白蛋白、含0.02％吐温 -20的磷酸盐缓冲溶液以及待检样品。

(3)将加样后的96孔板放入Octet Red 96生物分子相互作用仪，运行系统， 第二代氨基偶联传感器末端会依次浸入纯水(10分钟)、1-乙基-(3-二甲基氨基 丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺混合活化试剂(300秒)、抗体溶液(600秒)、乙醇胺盐酸盐(300秒)、1％牛血清白蛋白(300秒)、含吐温20的 磷酸盐缓冲溶液(120秒)、样品(300秒)，系统运行过程中可实时观察到各步 骤的相关情况。其中传感器预湿(即浸入纯水中10分钟)也可在运行系统之前 提前完成。

(4)检测结果如图1所示，三种浓度的沙门氏菌样品的信号值都远在有效 信号值(0.0075nm)之上，而斯氏李斯特菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌 的信号值都远小于有效信号值，说明该方法有很好的特异性。

实施例2：牛肉样品中不同浓度沙门氏菌的检测

无菌操作称取25g牛肉，置于盛有225mL磷酸盐缓冲溶液的无菌均质袋中， 用拍击式均质器拍打1min-2min后取样品悬液适量，加入沙门氏菌使样品悬液 中的菌浓度分别为2.2×10⁸CFU/mL、4.4×10⁷CFU/mL、8.8×10⁶CFU/mL，得到 所需的待测样品。往96孔板中加样及用生物分子相互作用仪进行样品检测同实 施例1的(2)和(3)。检测到的结合信号值代入到菌浓度和结合信号间的数学 公式计算可得回收到的菌浓度。表3为不同结合时间下目标菌的回收率试验结 果，从表中可以看出回收率平均值基本都在96％以上，说明该方法用于实际样 品检测也有很高的准确率。另外，通过比较不同结合时间下菌的回收率可以看出随着结合时间的延长，菌的回收率也随之变大，更加接近于100％，说明结合 时间的延长可以在一定程度上使得检测结果更加准确。

表3结合时间为60秒、120秒、180秒、300秒时牛肉中所添加目标菌的回收 率试验结果

实施例3：全蛋粉样品中不同浓度沙门氏菌的检测

无菌操作称取25g全蛋粉，置于盛有225mL磷酸盐缓冲溶液的无菌均质袋 中，用拍击式均质器拍打1min-2min后取样品悬液适量，加入沙门氏菌使样品 悬液中的菌浓度分别为2.2×10⁸CFU/mL、4.4×10⁷CFU/mL、8.8×10⁶CFU/mL， 得到所需的待测样品。往96孔板中加样及用生物分子相互作用仪进行样品检测 同实施例1的(2)和(3)。检测到的结合信号值代入到菌浓度和结合信号间的 数学公式计算可得回收到的菌浓度。表4为不同结合时间下目标菌的回收率试 验结果，从表中可以看出回收率平均值基本都在95％以上，进一步说明该方法 用于实际样品检测也有很高的准确率。另外，通过比较不同结合时间下菌的回 收率可以看出随着结合时间的延长，菌的回收率也更加接近于100％，说明结合 时间的延长可以在一定程度上使得检测结果更加准确。

表4结合时间为60秒、120秒、180秒、300秒时全蛋粉中所添加目标菌的回 收率试验结果